重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36 000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104IU/mg。结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当。为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。

马铃薯Y病毒属病毒HC-Pro蛋白功能研究进展

马铃薯Ｙ病毒属病毒基因组编码的ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白（蚜传辅助因子）具有多种功能，在病毒生活史各个环节中起重要作用。ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白具有蛋白酶活性，作为蚜传辅助因子参与病毒蚜传过程，调节病毒在宿主体内的转移，并在病毒复制、宿主症状表达及增强异源病毒复制等方面发挥作用。本文对ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白的既定、预测功能作一综述。深入了解ＨＣ－Ｐｒｏ 蛋白的功能不仅在理论上有助于明确病毒生活周期。

利用PLDMV/Twin-Strep侵染性克隆纯化HC-Pro病毒蛋白

番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)是一种新的潜在威胁番木瓜种植业的病毒,其辅助成分蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒复制、运动、寄主植物症状表现的多功能蛋白,因此纯化获得具有功能活性的HC-Pro蛋白,研究其多功能性具有重要意义。本研究利用In-Fusion拼接策略和E.coli Cell-Free快速构建植物病毒侵染性克隆法,一步快速地将28个氨基酸组成的蛋白标签Twin-Strep插入到PLDMV HC-Pro氨基端,成功获得了基于农杆菌的携带Twin-Strep标签的PLDMV侵染性克隆pPLDMV-Strep。通过农杆菌渗透注射接种番木瓜植株,从感染PLDMV-Strep的番木瓜叶片总蛋白中,利用Twin-Strep蛋白标签亲和层析分离纯化获得PLDMVHC-Pro蛋白,并通过LC/ESI-MS/MS(liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometric)对其进行蛋白N端和C端序列测序,证明了纯化获得完整的PLDMVHC-Pro蛋白。研究结果为后续解析PLDMV HC-Pro在病毒侵染过程中的功能及与寄主蛋白相互作用奠定了基础。

盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清的制备及鉴定

病程相关蛋白(PRs)在植物抗病抗逆过程中发挥重要作用。盐穗木病程相关蛋白基因HcPR10(GenBank:KF673356)来自盐穗木(Halostachys capsica)在600 mmol·L^-1NaCl胁迫下的盐抑制差减文库。为探究盐穗木病程相关蛋白HcPR10发挥生物学功能的机制,该研究通过体外表达和纯化HcPR10重组蛋白制备特异性的HcPR10多克隆抗体。并采用双酶切构建原核重组表达载体pET28a-HcPR10,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21诱导表达,通过正交分析优化重组蛋白可溶性诱导表达的条件,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,基于纯化获得的His-HcPR10重组蛋白和转HcPR10拟南芥总蛋白,分别利用ELISA和Western Blotting检测抗血清效价和特异性。结果表明:成功构建重组表达载体pET28a-HcPR10;正交结果显示诱导温度27℃,诱导转速200 r·min^-1,IPTG浓度0.7 mmol·L^-1,诱导时间6 h条件下可诱导表达大量可溶性目的蛋白;ELISA检测抗HcPR10血清效价达1∶243000,Western Blotting印迹结果显示制备的抗血清可以与重组蛋白和转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)中异源表达的HcPR10蛋白特异性结合。该研究获得了效价高、特异性强的盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清,为进一步研究HcPR10的亚细胞定位及生物学功能奠定了基础。

B型肉毒毒素重链C端基因的表达与保护作用的初步研究

肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,有7种血清型(A～G),是目前已知的毒性最强的细菌蛋白质。人类肉毒中毒主要是由A、B和E型引起。本研究克隆了B型肉毒毒素重链C端片段(Hc),在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用Ni离子亲和柱进行了纯化。Hc蛋白免疫后的BALB/c小鼠可以抵抗6×103LD50B型肉毒毒素攻击。

以应激蛋白为生物标志物研究低浓度2-硝基-4’-羟基二苯胺对鲫鱼肝脏和脑组织的动态暴露的影响

采用实验室模拟方法,以鲫鱼(Carassiusauratus)作为实验动物,运用SDS—PAGE和WesternBlotting方法,研究了在不同暴露时期,1mg/L2-硝基-4’-羟基二苯胺对鲫鱼肝脏和脑组织应激蛋白HSF70诱导表达的情况.结果表明:应激蛋白HSP70对2-硝基-4’-羟基二苯胺非常敏感.在鲫鱼暴露2d后,脑组织中HSP70与对照组相比,有显著的表达(p<0.05);在鱼体暴露7d后,肝脏组织中HSPT0与对照组有显著的诱导表达(p<0.05);随着暴露天数的增加,肝脏组织和脑组织HSP70表达也显著增加,且存在着较好的时间-效应关系.可考虑将应激蛋白HSP70作为2-硝基-4’-羟基二苯胺污染在水生生态系统中的一种敏感的生物标志物.

玉米圆斑病菌毒素与玉米对应抗病基因研究进展

近年来玉米圆斑病在我国有加重趋势。为有效控制该病害,本文综述玉米圆斑病菌分泌的3种毒素或蛋白及玉米中的抗病基因。HC毒素是1号生理小种分泌的寄主专化性毒素,其合成受TOX2位点上多个基因控制。HC毒素抑制组蛋白脱乙酰酶活性,引起高度乙酰化来修饰植物防卫反应相关基因表达。Hm1和Hm2是玉米抵抗HC毒素的抗病基因,分别编码HC毒素还原酶和HC毒素还原酶类蛋白,Hm1在抗病玉米全生育期内均起作用,Hm2仅在成熟期才有抗性。BZR-cotoxin是玉米圆斑病菌3号生理小种分泌的水稻专化性毒素,其可诱导非病原菌在水稻和玉米叶片上感病。Bz-cmp是玉米圆斑病菌分泌的另一蛋白,修饰玉米种子内的ChiA蛋白,并将该蛋白转化为失活的ChiA-m,从而使种子感病。

基于PPI网络与机器学习的蛋白质功能预测方法

针对现有的基于蛋白质相互作用(PPI)网络的蛋白质功能预测方法预测精度不高、易受数据噪声影响的问题,提出一种基于机器学习(层次聚类、主成分分析和多层感知器)的蛋白质功能预测方法 HPMM。该方法综合考虑蛋白质宏观和微观层面的信息,将蛋白质家族、结构域和重要位点信息作为顶点属性整合到PPI网络中以减轻网络中数据噪声的影响。首先,基于层次聚类和主成分分析进行特征提取,得到功能模块和属性主成分特征,然后训练多层感知器模型,建立多特征与多功能之间的映射关系以用于功能预测。在三个分别被分子功能(MF)、生物过程(BP)和细胞组件(CC)注释的人类PPI网络上进行测试,对HPMM、余弦迭代算法(CIA)和有向PPI网络基因本体术语传播(GoDIN)算法的功能预测效果进行比较分析。实验结果表明,相比CIA和GoDIN这两种完全基于PPI网络的方法,HPMM的精确度与F值更高。

代谢综合征患者短期胰岛素强化治疗血清超敏c-反应蛋白和白介素-6水平变化

目的:观察代谢综合征患者短期胰岛素强化治疗前后血清超敏c-反应蛋白和白介素-6水平变化。方法:选择正常对照组和代谢综合征组,每组各50例,检测两组超敏c-反应蛋白和白介素-6水平,并观察短期胰岛素强化治疗后代谢综合征组上述二指标变化。结果:代谢综合征组超敏c-反应蛋白和白介素-6水平明显高于正常对照组,且短期胰岛素强化治疗后超敏c-反应蛋白和白介素-6水平有所下降。结论:超敏c-反应蛋白和白介素-6等炎症因子水平与代谢综合征发病相关。

瞬时受体电位通道蛋白选择性抑制剂HC-608的合成工艺研究

目的建立瞬时受体电位通道蛋白1/4/5(TRPC1/TRPC4/TRPC5)选择性抑制剂HC-608的合成路线。方法以3-甲基黄嘌呤为起始原料,经过溴代、取代、成醚反应得到重要中间体7-(4-氯苄基)-8-((3-三氟甲氧基)苯氧基)-3-甲基黄嘌呤;该中间体与2-(3-溴丙氧基)四氢-2H-吡喃经取代反应、水解反应得到瞬时受体电位通道蛋白TRPC1/TRPC4/TRPC5选择性抑制剂HC-608。结果与结论考察了中间体的合成工艺并采用新工艺路线合成了HC-608,路线总收率为42%。HC-608的结构经1H-NMR、13C-NMR和MS谱确证。新合成路线简便、高效,为后续研究奠定了基础。

HPV L1壳蛋白在诊断宫颈上皮内瘤变及预测其转归中的临床价值

目的研究HPV L1壳蛋白检测在宫颈上皮内瘤变(CIN)诊断中的临床意义以及对CIN转归的预测价值,探索更加合理有效诊断处理CIN的方案。方法选择在南京大学医学院附属鼓楼医院行宫颈HPV-HC2检测阳性的妇女共187例,同时检查TCT、HPVL1壳蛋白检测及宫颈活检,以病理组织结果为金标准进行对照研究,并对其中继续在鼓楼医院治疗并随访的114例妇女行跟踪研究2年。结果 (1)根据宫颈活检病理结果分组,CIN1、CIN2、≥CIN3的L1壳蛋白阳性率分别是49.12%、30.00%、20.45%,运用卡方检验,χ2=10.437,P=0.015<0.05,有统计学差异。CIN1组的L1阳性率大于其他各组,而其他组别的L1阳性率之间均无统计学差异,CIN2和CIN3合并与CIN1组进行卡方检验,χ2=9.443,P=0.002<0.05,有统计学差异。(2)在2年随访结果中,CIN1未手术组L1(+)和L1(-)的HC2转阴率比较,P=0.022<0.05,有统计学差异。(3)HPVL1壳蛋白对CIN1的转归有较好的预测作用,CIN1患者中L1(+)的HPV转阴率较L1(-)的高。结论 (1)CIN1组的L1阳性率大于其他各组,而其他组别的L1阳性率之间均无统计学差异。(2)随访2年结果:未手术组L1(+)和L1(-)的HC2转阴率比较,有统计学差异(P<0.05)。(3)HPVL1壳蛋白可作为CIN1的临床预后指标。

脐腹灸及解语膏穴位贴敷联合针刺辅助治疗脑梗死风痰瘀阻证30例临床观察

目的 观察脐腹灸及解语膏穴位贴敷联合针刺辅助治疗脑梗死风痰瘀阻证的临床疗效。方法选取安徽中医药大学第二附属医院2019年11月至2020年8月收治的60例脑梗死风痰瘀阻证患者作为研究对象,采用随机数字表法分为对照组和治疗组,各30例。2组均给予西医常规基础治疗,在此基础上,对照组采用针刺治疗,治疗组采用脐腹灸及解语膏穴位贴敷联合针刺治疗。治疗14 d后比较2组的临床疗效,治疗前后的中医证候积分、日常生活能力(ADL)评分、神经功能缺损(NIHSS)评分,以及低密度脂蛋白(LDL)、超敏C反应蛋白(hc-CRP)、同型半胱氨酸(HCY)水平。结果 治疗组总有效率为86.67%(26/30),对照组为73.33%(22/30),2组比较差异有统计学意义(P<0.05);治疗后2组ADL评分明显升高,中医证候积分及NIHSS评分明显降低,与同组治疗前比较差异均有统计学意义(P<0.05),且治疗组改善更明显,与对照组治疗后比较差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后2组LDL、hc-CRP、HCY水平明显降低,与同组治疗前比较差异均有统计学意义(P<0.05),且治疗组降低更明显,与对照组治疗后比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 脐腹灸及解语膏穴位贴敷联合针刺辅助治疗脑梗死风痰瘀阻证能有效改善患者的临床症状,提高患者的日常生活能力,减轻患者的神经功能缺损程度,降低LDL、hc-CRP、HCY水平,疗效确切,且无明显不良反应,值得临床推广应用。