肠毒素大肠杆菌LT—B基因转基因马铃薯口服免疫原性研究

探讨马铃薯表达的产肠毒素大肠杆菌热敏肠毒素B亚基口服免疫原性,选择4周龄的昆明白小鼠。转基因马铃薯块茎经冷冻干燥后,研磨成粉状,以灌胃给药的方式对小鼠进行免疫。分0.2 g、0.4 g和0.6 g三个剂量组,免疫三次,每周一次。对照组用5μg细菌中表达的抗原蛋白腹腔注射免疫小鼠,空白组小鼠饲喂普通鼠粮。利用ELISA方法对小鼠血清、粪便特异性抗体表达进行分析。结果有45%小鼠经转基因马铃薯口服免疫后可诱导特异性的免疫应答。与细菌表达的抗原免疫反应相比,血清IgG反应和黏膜sIgA反应略强或相当。说明产肠毒素大肠杆菌转基因植物疫苗免疫动物可诱导特异的系统免疫应答和黏膜免疫应答。为利用植物生产预防大肠杆菌性腹泻可食用的口服疫苗,保护儿童免受细菌性腹泻的侵染奠定了基础。

人产肠毒素大肠杆菌ST、LT-B肠毒素基因融合的研究

将人产肠毒素大肠杆菌(ETEC),编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码不耐热肠毒素B亚基(LT-B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联,ELISA检测融合基因表达蛋白产物观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。说明了ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性,这为产肠毒素大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。

人毒素原性大肠杆菌肠毒素ST、LT-B基因的融合

将毒素原性大肠杆菌(ETEC)编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码热敏肠毒素B亚基(LT—B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联。ELISA检测融合基因表达蛋白产物,观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。本研究说明ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性。这为毒素原性大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。

实时荧光定量PCR检测感染小鼠肠道内容物的LT肠毒素基因

构建LT-PMD19质粒标准品,进行SYBR Green荧光定量PCR检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因,以确定该方法的特异性和灵敏度,绘制标准曲线;通过腹腔注射0.2mL ETEC菌液建立小鼠腹泻模型,分别于感染后4h、15h、2d、7d和14d各处死2只,通过建立的荧光定量PCR方法对小肠液中的ETEC的LT基因进行定量检测。研究结果显示,用建立的荧光定量PCR检测LT基因无非特异性扩增,标准曲线呈良好的线性关系(R2=0.999),标准品的熔解曲线均呈单峰,灵敏度为8.18×103拷贝数/μL;小鼠感染4h后LT毒素含量最高,剖检可见小肠肿大,充满黄绿色的内容物,感染后7d、14d均未检测出LT毒素,肠道未见明显病变,表明LT肠毒素在肠道内的生成规律与肠道病变损伤呈正相关。

Enhanced immunization after intranasal coadministration of Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit and human papillomavirus 16-L1 DNA vaccine

Human papillomavirus （HPV）, mainly types 16 and 18, are the most important initiating agents of cervical cancer. Prevention of high-risk HPV infections is a potentially effective approach to control HPV associated cervical cancer.

鱼用口服疫苗免疫佐剂研究进展

免疫佐剂是一种先于或与抗原同时使用,能够增强机体的非特异性免疫能力及相应抗原的免疫原性,但其本身不具备抗原特性的物质。文章对鱼用口服疫苗免疫佐剂的作用机理以及霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、细胞因子等几种主要鱼用口服疫苗免疫佐剂的应用情况进行综述,发现鱼用口服疫苗免疫佐剂的研究应用过程中仍存在作用机理研究相对滞后、忽略肠道黏膜免疫机理特殊性、使用成本过高、安全性等问题,建议今后加强对鱼类肠道黏膜免疫机理以及口服疫苗免疫佐剂作用机理的研究,优化口服疫苗免疫佐剂的免疫剂量和程序,降低生产成本,研发出更为广泛、廉价的口服疫苗免疫佐剂,提高其安全性等,以促进水产养殖业的健康发展。

大肠杆菌热敏肠毒素的检测及纯化

采用平板免疫溶血试验、兔回肠结扎试验,探讨了大肠杆菌耐热肠毒素制备的方法和检测方法。试验表明:平板免疫溶血试验能够快速灵敏地检测出热敏感肠毒素,并具有很强的特异性,比肠结扎试验灵敏度高,而且简便易行;试验将细菌接种到产毒素培养基上培养,进行增菌,然后离心取上清液,沉淀溶于PBS液中用多黏菌素B浸出,均用80%饱和度的(NH4)2SO4盐析,之后用SephadexG-100凝胶层析分离纯化,最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测热敏肠毒素的纯度。

猪大肠埃希菌肠毒素基因的多重PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)耐热肠毒素(STa、STb)基因和不耐热肠毒素(LT)基因保守序列为靶序列,设计合成了3对可扩增目的片段为182、108和336 bp的引物,建立了检测ETEC耐热肠毒素基因和不耐热肠毒素基因的多重PCR方法.该方法对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)EDL933、猪链球菌Streptcoccus、鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella typhimrium和猪肺疫巴氏杆菌Pasteurella pneumotropic的检测结果均为阴性,并且能检测到102cfu/mL稀释度的标准菌.对11株分离自广东佛山地区腹泻仔猪的待检菌株进行检测,结果为:含STa基因的菌株为5株;含STb基因为2株;含LT基因为3株,其中2株同时具有STb和LT基因.结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查.

大肠杆菌热敏感肠毒素的检测与制备

为探索猪源大肠杆菌热敏感肠毒素的简易检测方法和纯化方法,拟采用兔回肠结扎试验、兔皮肤蓝斑试验和平板免疫溶血试验比较检测热敏感肠毒素的方法。初步试验表明:平板免疫溶血试验能够快速灵敏地检测出热敏感肠毒素,并具有很强的特异性,比肠结扎试验灵敏度高,而且简便易行;采用SephadexG 100纯化热敏感肠毒素LT并采用SDS PAGE电泳检测蛋白纯度,表明该方法可以除去杂蛋白,肠毒素蛋白分子量为12

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因的原核表达

大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)不仅是重要的黏膜免疫原,而且作为佐剂在黏膜免疫中起着重要的作用。试验采用PCR方法扩增了肠毒素性大肠杆菌的LTB基因,并将其克隆到pGEX-KG原核表达载体上,构建了重组质粒pKG-LTB,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的LTB基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-LTB分子量约为35kDa,并具有免疫反应活性。这为进一步研究LTB蛋白黏膜免疫原性和黏膜佐剂的作用奠定了基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素的免疫学机制研究进展

随着免疫学及疫苗研究的不断发展,大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)在免疫过程中的作用日益受到人们重视。本文介绍了LT的免疫学机制与应用方面的进展。

自释放型细胞内运输载体LCA2结构域的制备与性质研究

蛋白质药物因其独特的优势,在疾病的预防和治疗中发挥了极其重要的作用,但大分子的特性阻碍了其对细胞内靶标的作用。现有的递送策略中,由于穿膜肽更适用于临床研究和治疗,逐渐成为了递送蛋白质药物最主要的工具。因此,开发安全有效的穿膜肽类递送载体对于生物医药的基础研究及临床应用具有重要意义。文中设计了一种基于肠毒素A2结构域的自释放型细胞内运输载体LCA2,该载体由连接子Linker、自释放酶敏感位点Cs与穿膜结构域LTA2三部分组成,并以荧光蛋白质mCherry为模式蛋白质来检测该载体的性质。电泳结果显示,从含有pET24a(+)-ma2重组质粒的工程菌中获得了高纯度的mCherry-LCA2融合蛋白,且低浓度的胰蛋白酶就可将mCherry从LCA2上有效地分离;荧光显微镜下观察到LCA2能将与之连接的mCherry运输到不同类型的细胞中,流式细胞仪检测到LCA2的运输能力具有一定的细胞差异性。共聚焦显微镜的荧光分析和Western印迹结果显示,LCA2载体将mCherry蛋白运送到内质网,Cs酶敏感位点被切开,模式蛋白质mCherry与LCA2分离并释放到细胞内。CCK-8结果表明,在给药剂量5~40μg/mL范围内,细胞增殖活力未见显著变化。上述结果证明,LCA2是一种安全有效的自释放型递送载体,能够将活性蛋白质或蛋白质药物运输到细胞内质网并释放。

LTB-2xSTN12S融合蛋白联合cGAMP和dmLT双佐剂对小鼠的免疫保护效果

目的在原核系统中表达肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)不耐热肠毒素B亚基(heat labile enterotoxin B subunit,LTB)和耐热肠毒素(heat stable enterotoxin)突变体(STN12S)的融合蛋白,联合环鸟-腺二核苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate,cGAMP)和dmLT(double mutant heat-labile enterotoxin)佐剂初步评价其保护效果并进行免疫反应分析。方法构建表达质粒pET28α-LTB-2xSTN12S,转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,镍柱纯化,将纯化的重组LTB-2xSTN12S蛋白联合dmLT和cGAMP佐剂(为抗原+dmLT+cGAMP组;同时设空白对照组、感染对照组、抗原组),均经皮下途径免疫BALB/c小鼠,免疫2针,间隔2周,末次免疫2周后滴鼻攻击ETEC-HN临床分离株(LT+/ST+),2周后称重,取眼眶静脉血及脾淋巴细胞进行体液和细胞免疫分析。结果重组质粒pET28-LTB-2xSTN12S基因测序正确,纯化的重组LTB-2xSTN12S蛋白相对分子质量约20000,纯度为93%,与霍乱毒素(cholera toxin,CT)和ST多抗均能发生特异反应。抗原+dmLT+cGAMP组小鼠诱导的免疫保护均高于感染对照组和抗原组(P均<0.05),诱导的针对LTB-2xSTN12S血清IgG抗体水平及针对LTB和ST抗原特异性IgG抗体水平均高于其他组(P均<0.05);脾淋巴细胞培养上清中抗LTB-2xSTN12SIgG抗体水平及针对LTB-2xSTN12SLTB抗原特异性IgG抗体水平均显著高于其他组(P均<0.01),诱导的脾淋巴细胞抗原特异性IL-4、IL-6、IL-17和IFNγ细胞因子分泌细胞数量均高于其他组(P均<0.05)。结论经原核表达系统成功表达并纯化了LTB-2xSTN12S融合蛋白,LTB和ST抗原性良好,联合cGAMP和dmLT佐剂对同时表达LT和ST临床分离株的攻击具有保护效果,并检测到显著的特异性体液和细胞免疫反应。

LAMP技术检测食品中产肠毒素大肠埃希氏菌

产肠毒素大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一种重要的引起人畜共患病的致病菌,能引起水样便及酸中毒,建立快速、准确的检测方法对预防和控制产肠毒素大肠埃希氏菌的感染具有重要意义。基于ETEC不耐热肠毒素LT基因序列,设计LAMP引物检测产肠毒素大肠埃希氏菌。结果表明:LAMP检测产肠毒素大肠埃希氏菌的检出限为32.9cfu/mL,人工污染生猪肉的检出限为55cfu/g。LAMP将可以成为替代PCR的核酸扩增新技术,为快速检测产肠毒素大肠埃希氏菌构建了一个技术平台。