幽门螺杆菌尿素酶A基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)标准株NCTC11639尿素酶A(UreaseA,UreA)编码基因的重组质粒,测定、分析其核酸序列,并在E.coli中表达,研究其抗原性。方法应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增UreA编码基因片段,将其克隆至pMD18-T载体上进行序列测定,并与GenBank上公布的其它Hp菌株基因序列进行比较,再将目的基因克隆至表达载体pGEX-4T-1上进行表达和纯化,用Western-blot检测产物的抗原性并用于对24株抗Hp全菌小鼠单克隆抗体的鉴定。结果扩增的UreA基因全长675bp(登录号为DQ141577),与GenBank上公布的其它Hp菌株的UreA核酸序列的同源性为95%～98%,表达的UreA融合蛋白分子量为52000,表达产物可被病人血清和全菌免疫的小鼠血清识别,29株抗Hp小鼠单克隆抗体中有4株是针对UreA抗原的。结论重组UreA具有较好的抗原性,为Hp检测试剂和疫苗的研究奠定基础。

牛幽门螺杆菌抗体中和菌体蛋白对Hela细胞的生长抑制作用

目的:研究Hpylori菌体蛋白对Hela细胞增殖的影响及牛抗Hpylori抗体对Hpylori菌体蛋白的中和作用.方法:Hpylori超声全菌抗原接种奶牛,按多克隆抗体制备常规,腋下皮下接种,全程免疫后每1-2mo加强1次,琼脂双向扩散至1:32时可采集牛血制备抗血清,同期收集牛常乳.抗血清及牛乳低温保存备用.经500、330、330g/L饱和硫酸铵粗提后,沉淀用生理盐水溶解,对生理盐水透析24h,上DEAE-32柱,收集高峰蛋白,经SDS-PAGE鉴定后分装,-20℃保存,通过Hela生长曲线确定Hela细胞的接种密度.建立SS1及NCTC11637对Hela细胞生长增殖功能的抑制作用的MTT分析方法,以牛抗HpyloriIgG分别与SS1及NCTC11637共育2h后各自对Hela增殖功能的抑制率变化来评价牛抗HpyloriIgG对SS1及NCTC11637菌体蛋白的中和作用.结果:细胞毒模型发现SS1与NCTC11637均能浓度依赖性地抑制Hela细胞增殖(SS1:r=0.9594;NCTC11637:r=0.9371),Hela细胞圆缩、边界突显,胞质内可见较多颗粒,折光性差,至高浓度抗原孔,Hela多见碎片,或明显皱缩.但对于相同的细胞毒效应SS1所需浓度高于NCTC11637;中和模型发现牛特异性IgG可分别中和SS1及NCTC11637的细胞毒作用,且具有剂量-反应关系(SS1:r=-0.9936;NCTC11637:r=-0.9627).结论:牛抗Hpylori抗体能够剂量依赖地中和Hpylori对Hela细胞生长增殖的抑制作用.