H7亚型禽流感病毒HA蛋白在Sf9中的表达与纯化

【目的】真核表达H7亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA蛋白,为进一步制备H7亚型HIV亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda clone 9,Sf9)的密码子偏嗜性,优化并合成H7亚型AIV的HA序列,将其克隆至穿梭质粒pFastBac1中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至Sf9中,通过间接免疫荧光和Westernblots试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过SYBRgreen染料法荧光定量PCR试验,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR定量方法,筛选出在Sf9中表达HA重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白。【结果】表达H7亚型AIV HA蛋白的重组杆状病毒在Sf9盲传3代后,Sf9开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和Western blots试验发现,Sf9内出现可与HA重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的HA重组蛋白条带大小约70 kD左右,与预期相符,且HA重组蛋白可与H7亚型AIV阳性血清反应,表明HA重组蛋白表达成功;以构建的pUC19-gp64质粒为标准,建立基于gp64基因的杆状病毒qPCR检测方法,该方法在1×103~1×108 copy/μL间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数R2=0.993;利用qPCR检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过Western blots试验筛选HA蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以10MOI的比例接种Sf9,孵育72h,蛋白表达效果最好;通过His镍株亲和纯化HA重组蛋白,蛋白浓度为0.268mg/mL,鸡红细胞凝集效价为4log2。【结论】本试验在Sf9中成功表达并纯化H7亚型AIVHA蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量PCR检测方法,可为进一步评价H7亚单位疫苗的免疫原性提供参考。

圈养狐貉源犬瘟热病毒地方分离株H基因的遗传变异分析

本研究于2004～2006年从人工饲养的发病狐貉中分离到6个CDV分离株，用RT—PCR方法扩增了其H蛋白基因片段，并对其进行了克隆和测序。测序结果表明，6个CDV分离株H基因阅读框全长均为1824bp，编码607个氨基酸，未发现碱基的插入和缺失。与Genbank中的34株CDV参考毒株的H基因序列进行比较和分析，现有的CDV毒株可以分为Asia-1、Asia-2、America-1、America-2、Europe和Arctic6个基因型，本实验中的分离株HL为Arctic基因型，与来自意大利的194／97株、丹麦的Green株同分在一组，其余5株分离株与来自日本的HAMA、UENO、Tanu96等毒株以及来自中国的TN株、GP株（大熊猫株）分在一组同属Asia-1型，表现出一定的地理位置相关性；6个分离株均与Onderstepoor、Convac等疫苗株差异较大、关系较远，提示病毒变异可能是造成目前已免疫动物仍然发生犬瘟热流行的原因之一。

感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆与序列分析

目的了解病料中犬瘟热病毒(CDV)的变异情况,为犬瘟热的预防与治疗提供理论依据。方法采用RT-PCR方法对犬病料中CDV的血凝素蛋白(H)、融合蛋白(F)和核衣壳蛋白(N)基因进行扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T-easy载体中测序,并进行序列分析。结果测定一株CDV的H、F和N基因大小分别为1863 bp、1653 bp和2235 bp。同源性分析表明,未发现碱基的插入和缺失。该病毒的H、F和N基因分别与国内强毒株BJ080127株的H基因、GN株的F基因和HL株的N基因亲缘关系最近,氨基酸同源性分别为97.3%、97.7%和99.3%。与国外标准野毒株A75-17在核苷酸水平上同源性依次为94.4%、93.8%和97.2%,与疫苗株CDV3在核苷酸水平上同源性分别为88.5%、88.8%和93.9%。系统进化树表明该病毒与国内强毒株在同一谱系。糖基化分析显示,该病毒在F基因3～5位氨基酸处多出1个糖基化位点。结论本研究从犬病料中成功克隆了犬瘟热病毒血凝素蛋白、融合蛋白和核衣壳蛋白,在F基因中新增了一个糖基化位点,为犬瘟热的遗传变异和流行学研究提供了分子生物学依据。

麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)在痘苗病毒中的表达

将麻疹病毒F和HA基因插入到痘苗病毒中,分别处于痘苗启动子P7.5与P11控制下,获得重组病毒vLmF和vCmH。用抗F多肽抗体和HA单抗进行ELISA检测,结果表明,两株重组病毒均能表达相应的麻疹蛋白。蛋白印迹显示重组病毒表达产物在分子大小,蛋白切割和糖化方面与麻疹病毒糖蛋白一致。两株重组病毒分别免疫家兔都能产生较高滴度的麻疹抗体,这些抗体具有中和作用和血溶抑制作用。此外,vCmH产生的抗体还具有血凝抑制作用。

新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤的治疗

目的 :寻求有效的肿瘤基因治疗方法 ,研究新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因在无胸腺裸鼠体内的抗肿瘤作用。方法 :建立BALB/c裸小鼠荷人结肠癌模型 ,瘤内注射脂质体包裹的真核重组子 pVHN和pVVP3。观测 pVHN和pVVP3治疗荷HCT裸鼠的效果 ,免疫组化法检测肿瘤细胞Bcl 2和PCNA的表达。结果 :经HN基因和VP3基因联合治疗组的小鼠与荷瘤对照组小鼠相比 ,肿瘤体积明显缩小 ,抑瘤率可达 70 %。病理组织切片表明 ,治疗组裸鼠体内肿瘤细胞大量凋亡 ,局部地方可见细胞消失。免疫组化表明 ,Bcl 2和PCNA蛋白在荷HCT裸鼠对照组与各治疗组均有表达 ,其中Bcl 2表达在荷瘤对照组与pVHN治疗组差异有显著意义 (P <0 .0 5 ) ,PCNA表达在荷瘤对照组与 pVHN +pVVP3治疗组差异极其显著 (P <0 .0 1)。结论 :NDVHN基因与凋亡素VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤细胞的增殖有一定抑制作用 ,可诱导其凋亡 ,其凋亡可能与下调Bcl 2表达有关。

高致病性禽流感H5N1血凝素蛋白表达及活性测定

通过PCR扩增高致病性禽流感H5N1的HA和HA1基因片段,利用原核表达系统表达重组HA和HA1蛋白,并用SDS-PAGE,Western-blotting和血凝试验进行重组HA蛋白的鉴定和血凝活性鉴定.结果表明,经过HA蛋白胞外段分析、重组载体的酶切鉴定得出的重组HA蛋白,在血凝试验中能与HA特异性抗体结合,并有较高的血凝活性.利用表达载体pET42a表达AIV-H5亚型的HA基因,为进一步利用重组蛋白研制AIV-H5抗体的ELISA检测方法,研制抗AIV-H5亚型的单克隆抗体提供基础.

不含POU结构域的八聚核苷酸结合蛋白(NONO)真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的构建小鼠的不包含POU结构域的八聚核苷酸结合蛋白(NONO)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达和定位。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到NONO编码序列,将该序列克隆至带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-NONO-HA。通过PCR、双酶切鉴定构建正确后以脂质体为媒介转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察该融合蛋白在细胞内的表达及定位情况。结果重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明构建正确,且能在NIH3T3细胞中得到大量表达。荧光显微镜观察发现NONO-HA融合蛋白在静息状态下主要分布于胞质中。结论成功构建带HA标签的NONO真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达NONO-HA融合蛋白。

禽流感病毒HA基因在拟南芥中的表达

将H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因构建到植物表达载体,经农杆菌法转入拟南芥基因组中,酶联免疫吸附(ELISA)测定分析T2代转基因株系,据OD值筛选获得HA基因高效表达株系;RT-PCR及Western blot分析进一步证实,这些转基因株系均可转录HA基因,翻译形成相应的蛋白质。拟南芥叶片中表达积累的HA蛋白经亲和层析纯化,Western blot分析检测到1条分子量为65 ku的蛋白质带,与预期的HA蛋白大小完全一致,没有发生蛋白质降解现象。表明禽流感病毒HA蛋白可在植物细胞中稳定表达,植物可用于生产禽流感疫苗。

犬瘟热病毒昆明分离株的生物学特性

从1只曾接种过犬瘟热弱毒疫苗但又发病的宠物犬血样中分离到1株犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV昆明分离株(CDV-KM)。该毒株可使Vero细胞产生以细胞融合及空泡化为特征的细胞病变,病毒效价为105.8TCID50/mL或1.76×106PFU/mL,并能在鸡胚绒毛尿囊膜、鸡胚成纤维细胞及MDCK细胞上增殖。微量中和试验结果发现,自制的犬抗CDV-KM株同份血清对CDV-KM株与参考毒株CDV-Onder-stepoort的中和抗体效价即半数保护量分别为1:142和1:132,显示二者未存在明显的中和表位差异。RT-PCR、RFLP和DNA测序分析结果显示,使用参照组合引物CDV-P2/P3/P4扩增,均可得到被认为指示弱毒株特征的177bp核酸片段;而H蛋白全长基因扩增产物未见能指示野生毒株特征的NdeⅠ和SspⅠ酶切位点;H蛋白基因与Onderstepoort小空斑变异株、鸡胚适应株和大空斑变异株的核酸序列同源性分别为98.84%、98.90%和100%。表明该分离株属于疫苗基因群。

吉林省2001～2014年麻疹病毒血凝素蛋白基因变异分析

目的研究吉林省2001-2014年麻疹病毒血凝素（H）蛋白的变异情况。方法选取吉林省2001-2014年21株麻疹病毒株,通过病毒分离、核酸提取、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增得到H蛋白基因片段,测序并拼接全序,用生物信息学软件进行变异分析。结果吉林省2001-2014年21株麻疹病毒株均为H1a基因亚型,与中国疫苗株S191相比,H蛋白的核苷酸变异率由2001年的4.69%逐年上升到2013年的5.34%,氨基酸变异率由4.05%逐年上升到5.02%。与H1a中国代表株China93-4相比,核苷酸变异率从0.38%逐步上升为1.14%,氨基酸变异率从0.49%逐步上升为1.41%。吉林省麻疹病毒株均保留了4个糖基化位点,第240位氨基酸均由丝氨酸变为天冬酰胺,导致第5个糖基化位点NLS238-240缺失。21株麻疹病毒H蛋白氨基酸的334、397、493、574、592、603、613和614位点熵值相对偏高,可变性相对较大。结论吉林省2001-2014年麻疹病毒的核苷酸和氨基酸变异率均呈逐年升高趋势,需持续监测关键区域位点变异情况。

江西省赣州市2013-2016年麻疹病毒分离株N基因和H基因特征分析

目的分析赣州市流行的麻疹病毒的基因特征。方法采集麻疹疑似病例咽拭子标本,应用荧光RT-PCR方法检测麻疹病毒核酸;用Vero/SLAM细胞对麻疹病毒核酸检测阳性标本进行病毒分离培养,并将麻疹病毒分离株进行核蛋白N基因和血凝素蛋白H基因扩增、测序;运用DNAStar、Bioedit和MEGA 5.0等分子生物学软件对N基因和H基因进行序列特征分析。结果978份疑似麻疹病例咽拭子标本中,检出47份麻疹病毒核酸阳性,阳性率为4.81%,分离到25株毒株;扩增的13株毒株均为H1基因型的H1a亚型,与H1a基因型代表株(CHN/93/2)N基因核苷酸、氨基酸的同源性分别98.0%~98.5%、97.9%~99.6%,与H基因核苷酸、氨基酸的同源性分别为98.2%~98.9%、97.4%~98.5%。各分离株N基因与中国疫苗株Shanghai-191之间核苷酸、氨基酸的同源性分别为93.7%~95.2%、95.2%~96.8%;H基因与Shanghai-191之间核苷酸、氨基酸的同源性为94.2%~96.5%、94.2%~96.6%。结论2013-2016年赣州市麻疹病毒流行株为H1a亚型,疫苗株对现流行株有保护性,但仍需持续监测麻疹病毒基因的变异情况。

甲型H5N1禽流行性感冒病毒血凝素抗原和霍乱毒素B亚单位融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的构建甲型HSN1禽流行性感冒流感病毒血凝素（HA）抗原和霍乱毒素B亚单位（CTB）融合蛋白真核表达载体，并研究其在COS7细胞中的表达特性，及其在动物体内不同时间点诱导机体产生特异性抗体的情况。方法采用PCR技术分别克隆CTB基因和HA基因，并用BamHI酶切2个基因片段，在T4连接酶的作用下构建CTHA融合基因（CH基因）。双酶切后，将CH基因插入真核表达质粒pCI—neo中，构建甲型H5N1禽流感病毒融合蛋白真核表达载体（pCI—CH）。将pCICH质粒转染COS7细胞，利用Western印迹、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SD孓PAGE）检测HA抗原的表达；间接EI-ISA法检测免疫接种新西兰大白兔后其血清中HA抗原的特异性抗体效价，以及与H1N1、H9N1、H3N2和乙型流感病毒的交叉反应情况。结果pCl—CH真核表达载体（即核酸疫苗）构建成功，可在cos7细胞中高效表达，并能在大白兔体内诱导产生特异性抗pcI-cH抗体。核酸疫苗pC-CH特异性抗血清不仅可以与甲型HSNl流感病毒特异性结合（P／N〉2．1），而且可以与HINl、HgNl和H3N2毒株发生特异性反应；但该抗血清与乙型流感病毒无特异性反应。结论构建的甲型H5N1禽流感病毒核酸疫苗具有良好的免疫原性。

禽流感病毒感染小鼠前后表面蛋白编码基因变异情况分析

目的了解禽流感病毒（AIV）在感染小鼠前后表面蛋白编码基因的特点及变异情况。方法在A／Goose／Guangdong／NH／2003（H5N1）感染小鼠肺组织的第12小时和第9天各分离1株AIV病毒，通过鸡胚增殖后提取RNA，反转录合成cDNA，经PCR扩增和产物纯化构建重组质粒，用双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定并进行基因特性分析。结果3株病毒HA基因的核苷酸序列同源性为99．6％～99．8％，推导氨基酸序列的同源性为99．3％～99．6％。3株病毒NA基因的核苷酸序列同源性为99．8％-99．9％，均为同义突变。M基因未发生任何变异。结论AIV感染小鼠后HA基因出现变异，NA和肘基因未出现有意义的突变。

我国人副流感病毒3型HN基因的遗传变异及进化特征分析

目的基于血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因分析我国流行人副流感病毒3型(human parainfluenza virus 3,HPIV3)的基因变异规律和进化特征。方法采用多重荧光PCR方法对2007—2020年5个省市(北京、浙江、安徽、河南、湖南)急性呼吸道感染病例的咽拭子标本进行常见病原体核酸筛查,对HPIV3阳性标本进行HN基因序列测定,与GenBank数据库的国外和我国10个省的HPIV3流行代表株HN基因序列进行比对,应用多种生物信息学方法开展分子进化分析。结果本研究期间从5个省市共获得49株HPIV3的HN基因序列,核苷酸同源性在96.6%~100%之间,其中48株为C3基因亚型,1株为C5基因亚型。系统进化分析显示,我国12个省市在2003—2020年间存在C1、C3和C5基因亚型的毒株共流行,毒株间核苷酸和氨基酸同源性分别为95.4%~99.8%和97.9%~100%,其中C3是我国的优势流行基因亚型,分属于C3a、C3b、C3c、C3e和C3f进化分支,以C3f的传播范围和流行时间最为广泛。对C3基因亚型的进化分析显示,其最近共同祖先形成时间(tMRCA)可追溯到1990年,有效群体规模在2002—2010年间逐渐扩张而后趋于平稳;C3各进化分支HPIV3的HN基因进化速率在3.69×10^(-4)~5.82×10^(-4)替换/位点/年之间;C3基因亚型毒株HN蛋白共享N308、N351、N485和N523潜在N-糖基化位点,选择压力以负向选择为主。结论C3基因亚型是我国的本土优势HPIV3流行型别,形成了广泛传播和持续流行态势,并在流行过程中形成多个进化分支共同循环。

抗牙龈卟啉单胞菌牙周炎基因疫苗的构建及其表达研究

为构建抗牙龈卟啉单胞菌的牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-fimA、pVAX1-HA2-fimA／IL-15，并检测其在293T细胞的表达，本研究应用基因重组技术，构建以牙龈卟啉单胞菌HA2和fimA为目的基因、SD大鼠IL-15基因为免疫佐剂的真核表达质粒，用Lip2000介导瞬时转染293T细胞，Western Blotting检测目的蛋白体外表达的情况。重组真核表达质粒经酶切及DNA测序鉴定构建正确，转染的293T细胞能够检测到目的蛋白的正确表达。本研究成功构建了真核共表达质粒pVAX1-HA2-fimA、pVAX1-HA2-fimA／IL-15，且目的基因能在真核细胞中正确表达，为下一步研制抗牙龈卟啉单胞菌的牙周炎基因疫苗提供了一定的帮助。

牛副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白在杆状病毒中的表达

目的在杆状病毒中表达牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type-3,BPIV-3)血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase,HN)。方法提取BPIV-3 BN-1株RNA,设计特异性引物扩增HN全长ORF,将其克隆至杆状病毒供体载体p Fast Bac HTA中,获得重组供体质粒p Fast Bac-HN。将p Fast Bac-HN转化至感受态细胞E.coli DH10Bac,制备穿梭质粒Bacmid-HN。将纯化的Bacmid-HN经脂质体转染至Sf21昆虫细胞,拯救重组杆状病毒,并进行Western blot鉴定。结果经PCR及测序鉴定证明,HN基因重组供体质粒p Fast Bac-HN及穿梭质粒Bacmid-HN构建正确。利用Sf21昆虫细胞成功拯救重组杆状病毒,连续传代扩增3代的病毒滴度为2×108 CPE/ml。重组HN蛋白的相对分子质量约70 000,可与BPIV-3阳性血清发生特异性反应。结论在杆状病毒表达系统中成功表达了BPIV-3重组HN蛋白,为BPIV-3的诊断及疫苗效力评价奠定了基础。