miR-1264对喉癌Hep2细胞增殖和迁移的影响

目的 miR-1264在喉癌中表达下调。文中旨在研究miR-1264对喉癌Hep2细胞生物学功能的影响及是否参与下调LCRG1基因的表达。方法 Real-time quantitative PCR检测miR-1264在人喉癌组织中的表达情况;将转染mimic/inhibitor NC Hep2细胞设为对照组,将未转染Hep2细胞设为空白组,将转染miR-1264 mimic/inhibitor设为实验组。利用MTT、Transwell分别观察miR-1264对Hep2细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;luciferase实验验证miR-1264和LCRG1 3'UTR的结合;RT-PCR、Western blot分别检测miR-1264、LCRG1蛋白表达。结果与对照组和空白组相比,Hep2细胞瞬转miR-1264mimic后,活细胞数量明显增加,增殖能力显著增强(P<0.05);而瞬转miR-1264 inhibitor后,活细胞数量明显降低,增殖能力减弱(P<0.05)。与对照组[(80.80±1.07)个]及空白组[(73.60±1.44)个]迁移细胞数量相比,实验组[(97.00±1.41)个]明显增加(P<0.05),迁移能力亦显著增强(P<0.05);与对照组[(80.00±1.11)个]及空白组[(73.60±1.44)个]迁移细胞数量相比,miR-1264 inhibitor组[(71.40±1.21)个]明显降低(P<0.05),迁移能力亦减弱(P<0.05)。与对照组[(43.00±1.41)个]和空白组[(50.60±1.03)个]侵袭细胞数量相比,实验组[(57.00±1.00)个]明显增加(P<0.05),侵袭能力亦显著增强(P<0.05);与对照组[(61.20±1.50)个]和空白组[(50.60±1.03)个]侵袭细胞数量相比,实验组[(27.60±0.93)个]明显降低,侵袭能力受到显著抑制(P<0.05),利用RT-PCR验证瞬转成功后,进一步应用Western blot实验检测LCRG1蛋白表达结果,显示:实验组LCRG1蛋白表达较NC对照组和空白组均无明显差异(P>0.05)。结论 miR-1264在喉癌组织中高表达,miR-1264可能不参与LCRG1蛋白的表达下调,但能增强Hep2细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

壁虎醇提物诱导人喉癌细胞Hep2凋亡的实验研究

本文研究了壁虎乙醇提取物(GEE)诱导Hep2细胞凋亡的作用。采用噻唑蓝比色法(MTT)检测了GEE对Hep2细胞增殖的抑制作用,发现GEE可呈剂量-时间依赖性的抑制Hep2细胞的增殖,GEE作用24、48、72 h后其IC50值分别为336.858、237.949、188.991μg/mL。Hoechst 33258荧光染色后在显微镜下可观察到Hep2细胞发生了典型凋亡的形态学变化;利用Western blot法证实在Hep2细胞中GEE可诱导caspase-3和抑制VEGF蛋白的表达。这些结果表明GEE可能是通过上调Caspase-3和下调VEGF蛋白的表达诱导Hep2细胞的凋亡。

内皮素系统在喉癌细胞HEP2的表达

目的内皮素(endothelin,ET)系统在多种恶性肿瘤中均有表达且对恶性肿瘤的演进具有重要调控作用,文中对喉癌细胞HEP2是否存在ET系统进行探讨。方法应用RT-PCR和免疫组化方法分别检测HEP2细胞ET系统的基因和蛋白表达,ELISA法对HEP2细胞ET1分泌情况进行检测。结果HEP2细胞存在ET系统基因及蛋白表达,同时能主动分泌ET1。结论人喉癌细胞存在ET系统的表达,ET1可能是促进喉癌病理发展的重要生物因子。

草苁蓉多糖提取物诱导人喉癌Hep2细胞凋亡的实验研究

目的：探讨草苁蓉多糖提取物（BRP）对人喉癌 Hep2细胞的抗瘤作用。方法：采用高通量色谱仪分析多糖提取物成分，流式细胞仪分析细胞周期及凋亡蛋白，western blot 检测细胞凋亡相关蛋白变化。结果：高通量色谱分析仪发现BRP成分单一，BRP对细胞的抑制率呈时间和浓度依赖性。细胞周期分析发现BRP使细胞滞留于G0/G1期。与对照组相比，不同浓度的BRP（100～400μg/ml）明显诱导细胞的凋亡。 Western blot 结果发现 BRP 作用后，pro-caspase-3，pro-caspase-8和pro-caspase-9蛋白分裂增加，同时死亡受体DR5和Bax表达增加，而Bcl-2表达减少。结论：研究发现BRP主要通过使 Hep2细胞周期变化和凋亡来抑制细胞的生长，其途径主要包括线粒体内部途径和死亡受体外部途径来完成。

单次、分次照射与^(125)I粒子低剂量率照射对人喉鳞癌Hep2细胞的抑制作用

目的探讨125I粒子持续低剂量率照射与分次照射、单次照射对人喉鳞癌细胞Hep2的抑制作用及其作用机制。方法实验分为无照射对照组(Ctrl组)、单次照射组(SDR组)、分次照射组(FDR组)和125I粒子持续低剂量率照射组(125I-CLDR组)四组。采用细胞克隆形成实验法检测Hep2细胞在不同照射条件下细胞克隆的形成能力;用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期阻滞情况;用蛋白印迹法检测不同照射条件后Hep2细胞总γ-H2AX、Cyclin B1、Caspase3蛋白表达的变化。结果经2 Gy、4 Gy、6 Gy的剂量照射,125I-CLDR组Hep2细胞克隆形成率均低于SDR组和FDR组。经4 Gy的剂量照射后,125I-CLDR组Hep2细胞出现G2/M期阻滞,且阻滞效应较SDR组及FDR组的细胞强;125I-CLDR组Hep2细胞的凋亡比例明显高于SDR组及FDR组;三个照射组γ-H2AX、Cyclin B1、Caspase3、NF-κB、P21和Cdk1的表达水平上调,125I-CLDR组p-Cdc25c蛋白表达水平低于SDR组和FDR组。结论在本实验条件下,125I粒子持续低剂量率照射较单次照射、分次照射能够诱发更多Hep2细胞出现DNA损伤、引起持续的G2/M期阻滞、诱导细胞凋亡并抑制细胞的再增殖。

miR-9-5p下调FRMD6促喉癌Hep2细胞存活的机制研究

目的探讨miR-9-5p通过下调FRMD6表达促进喉癌Hep2细胞存活的具体机制。方法通过实时荧光定量PCR检测miR-9-5p、FRMD6在人喉癌组织中的表达情况。Hep2细胞转染对照抑制剂作为对照组,实验组分别转染miR-9-5p抑制剂、FRMD6、miR-9-5p抑制剂+FRMD6,利用MTT、细胞克隆形成实验等观察miR-9-5p及FRMD6对Hep2细胞增殖活力的影响;caspase-3蛋白活性检测以评估miR-9-5p、FRMD6对Hep2细胞的凋亡情况。对照组转染阴性对照,实验组分别转染miR-9-5pmimics,Western blot法检测过表达细胞中FRMD6的表达;Luciferase实验验证miR-9-5p与FRMD63′-UTR的结合。对照组转染阴性对照/抑制剂,实验组分别转染miR-9-5p对照/抑制剂,RT-PCR、Western blot法分别检测转染细胞中miR-9-5p、FRMD6、YAP等表达情况。结果RT-PCR法检测结果显示,喉癌组织中miR-9-5p表达增加而FRMD6表达下降。MTT及细胞克隆形成实验结果显示,Hep2细胞分别瞬转miR-9-5p抑制剂或FRMD6过表达活细胞数量均明显减少,增殖能力显著下降(P<0.05),而两者共瞬转后,细胞增殖能力较单转染组显著降低(P<0.05);caspase-3蛋白活性:Hep2细胞分别瞬转miR-9-5p抑制剂或FRMD6细胞凋亡增加(P<0.05),而两者共瞬转后细胞凋亡较单转染组高(P<0.05)。Westernblot法检测结果显示,Hep2细胞过表达miR-9-5p后FRMD6表达减少;Luciferase实验结果显示,miR-9-5p与FRMD63′-UTR直接结合。RT-PCR及Westernblot法检测结果显示,miR-9-5p阴性组FRMD6转录及翻译显著降低,YAPmRNA及蛋白表达则显著上调(P<0.05);miR-9-5p抑制剂组FRMD6的表达升高,而YAP表达降低(P<0.05)。结论miR-9-5p通过抑制FRMD6基因表达,促进人喉癌组织及Hep2细胞增殖存活,抑制细胞凋亡,这个过程可能与Hippo-YAP通路受抑制有关。

miR-21对人喉鳞癌Hep2细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨miR-21对人喉鳞癌Hep2细胞增殖与凋亡的影响。方法脂质体LipofectamineTM2000将miR-21inhibitor和miR-21阴性对照(NC)转入Hela细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,克隆实验及Hoechst染色分别检测细胞增殖与凋亡情况,Western blot检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)、程序化死亡蛋白4基因(PDCD4)、Bax、Bcl-2表达及蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平。结果与miR-21NC比较,miR-21inhibitor能显著抑制细胞活力[(0.728±0.045)vs.(0.393±0.018),P<0.01],降低细胞克隆数目[(158.38±14.47)vs.(65.52±6.86),P<0.01],提高细胞凋亡率[(8.45±0.67)%vs.(40.23±3.46)%,P<0.01],并上调PTEN、PDCD4、Bax表达,下调Bcl-2表达及降低AKT磷酸化水平(P<0.01)。结论 miR-21inhibitor通过PTEN/AKT信号通路抑制人喉鳞癌Hep2细胞增殖和诱导凋亡,并调节细胞凋亡相关蛋白的表达。

Hep2-exo负载树突细胞诱导抗喉癌免疫效应的机制

目的探讨人喉癌细胞Hep2细胞来源外泌体(Hep2-exo)负载树突细胞(DC)后体外刺激细胞毒T细胞对Hep2细胞的杀伤作用。方法利用蔗糖密度梯度超速离心法从Hep2细胞培养上清液中分离Hep2-exo。透射电子显微镜鉴定Hep2-exo形态,Western印迹分析Hep2-exo表面CD9分子表达。分离培养喉癌患者外周血单个核细胞诱导的DC,流式细胞术鉴定细胞表型。用MTT法检测负载Hep2-exo的DC刺激T淋巴细胞增殖情况及细胞毒T细胞对Hep2细胞的杀伤作用。结果透射电镜下见Hep2-exo呈典型的杯状,大小相对均一,平均直径30~100 nm。Hep2-exo表面有CD9CD63分子表达。单个核细胞DC有CD1a分子表达说明诱导成功,边缘有绒毛样突起,呈典型的PC形态。负载Hep2-exo的DC刺激T细胞增殖能力及T细胞对靶细胞的杀伤效应明显强于未负载Hep2-exo的DC(P<0.05)。结论负载Hep2-exo的DC能促进T细胞增殖,可体外诱导细胞毒T细胞应答抑制喉癌细胞生长。

miR-126对人喉鳞癌Hep2细胞迁移侵袭能力的影响

目的探讨miR-126对人喉鳞癌Hep2细胞迁移侵袭能力的影响。方法采用脂质体Lipofectamine TM 3000将miR-126 mimics和miR-126 NC转入Hep2细胞中,Realtime-PCR检测miR-126表达,MTT法检测细胞活力,tanswell实验检测细胞迁移及侵袭能力,Western印迹检测细胞中基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、锌指转录因子(Snail)、锌指结合蛋白(ZEB)1蛋白表达及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的激活情况。结果miR-126 mimics组miR-126表达量高于miR-126 NC组,细胞活力低于miR-126 NC组,细胞迁移数目少于miR-126 NC组,细胞侵袭数目少于miR-126 NC组,MMP2、MMP9、Snail、ZEB1、PI3K及p-AKT蛋白表达量均低于miR-126 NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-126过表达能显著的抑制Hep2喉鳞癌细胞迁移侵袭能力,其机制可能与阻断PI3K/AKT信号通路有关。

miR-122a抑制人喉癌细胞株Hep2细胞增殖的研究

目的:研究miR-122a对人喉癌细胞株Hep2细胞增殖、细胞周期以及相关蛋白表达量的影响。方法:人喉癌细胞株Hep2细胞分别转染miR-122a寡聚核苷酸(A组)和miR-122a inhibitor(阻遏物)(B组),同时设立阻遏物阴性对照(inhibitor negative control,miR-NC inhibitor)(C组)和空白对照(D组)。用RT-PCR、MTT法、流式细胞仪和Western blot技术评价各组细胞增殖和细胞周期的生物学特征。结果:转染miR-122a寡聚核苷酸后,Hep2细胞中miR-122a表达显著增加。同D组相比,A组细胞增殖水平明显受到抑制,miR-122a寡聚核苷酸能够有效诱导Hep-2细胞周期阻滞在G1/G0期,A组细胞分裂周期蛋白42表达水平明显下调,细胞周期调控因子蛋白CDK4及细胞周期素D1蛋白表达水平明显降低。结论:miR-122a寡聚核苷酸能够显著抑制喉癌细胞Hep2的增殖,miR-122a是潜在的人喉癌细胞基因治疗的候选靶点。

miR-21对人喉鳞癌细胞Hep2迁移侵袭能力的影响

目的探讨微小RNA-21(miR-21)对人喉鳞癌细胞Hep2迁移、侵袭能力的影响。方法用脂质体LipofectamineTM2000将miR-21抑制剂和miR-21NC转入人喉鳞癌细胞Hep2中,48h后,运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室法检测细胞侵袭能力,蛋白质印迹法检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)的激活情况,以及基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9与伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(RECK)的表达。结果与miR-21NC比较,miR-21抑制剂能明显降低Hep2细胞活力[(0.688±0.043)vs.(0.375±0.012)],抑制细胞迁移能力[(6.57±0.02)μmvs.(20.49±2.18)μm]及细胞侵袭能力[(100.7±10.2)vs.(46.8±4.3)],差异均有统计学意义(P<0.01);同时miR-21抑制剂能明显下调PI3K、MMP2及MMP9的表达(P<0.01),降低Akt的磷酸化水平(P<0.01),并上调PTEN及RECK的表达(P<0.01)。结论 miR-21抑制剂能明显抑制人喉鳞癌细胞Hep2的迁移、侵袭能力,可能与PTEN/PI3K/Akt信号通路有关。

RhoC表达对喉鳞癌Hep2肿瘤细胞凋亡、肿瘤干细胞标志物-ALDH1A1及细胞形态的影响

目的研究Ras同源类似物C(ras homology C,Rho C)对喉鳞状细胞癌生物学行为的影响。方法通过脂质体转染技术将外源基因导入喉鳞状细胞癌细胞-Hep2肿瘤细胞,抑制/增强肿瘤细胞中Rho C表达,TUNEL法检测Rho C对Hep2肿瘤细胞凋亡的影响,罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞骨架观察Hep2肿瘤细胞形态变化,实时荧光定量核酸扩增检测(real-time quantitative polymerase chain reaction detecting system,QPCR)方法检测Rho C对Hep2肿瘤细胞肿瘤干细胞标志物乙醛脱氢酶A1(aldehyde dehydrogenase 1 family,member A1,ALDH1A1)的表达的影响。结果抑制Rho C表达可使Hep2肿瘤细胞凋亡增强,肿瘤细胞群中肿瘤干细胞标志物ALDH1A1 mRNA表达水平降低;改变Rho C表达后,肿瘤细胞形态发生了不同的改变。结论Rho C在喉鳞癌的转移中具有重要的作用,以Rho C为治疗靶点在控制肿瘤转移方面具有重要的临床应用价值。

姜黄素抑制喉癌Hep2细胞系增殖的Rho/ROCK机制研究

目的分析姜黄素抑制喉癌Hep2细胞系增殖的相关机制及Rho/ROCK的参与作用。方法喉癌Hep2细胞随机分为4组:对照组、Y27632组、姜黄素低剂量组和高剂量组。姜黄素低剂量和高剂量组分别给予姜黄素(5μmol/L和50μmol/L)孵育,Y27632组在给予姜黄素孵育(10μmol/L)时给予Y27632(10μmol/L)。分析各组细胞活力情况,Western Blotting法分析各组细胞中细胞凋亡蛋白Bax、Bcl2、P53以及Caspase3/9及ROCK通路调控蛋白的表达变化。结果姜黄素可以明显抑制喉癌Hep2细胞的增殖,高剂量的姜黄素抑制率最高,同时,姜黄素高剂量可以显著增强Hep2细胞的Rho A、ROCK1/2及细胞凋亡相关蛋白的表达(P<0.01),效果明显优于姜黄素低剂量组,Y27632可以明显恢复异常表达的上述蛋白。结论姜黄素通过激活ROCK信号通路和细胞凋亡蛋白上调表达抑制喉癌Hep2细胞的增殖,发挥肿瘤抑制的作用。

转染E1B55K基因提高Hep2细胞包装肠腺病毒Ad41的能力

人F组腺病毒Ad40、Ad41难以在体外培养的细胞中传代,被称为难养腺病毒(Fastidious adenovirus)。本研究观察了在Hep2细胞表达Ad41 E1B55K基因对Ad41复制的促进作用。从Ad41阳性粪便标本中用PCR的方法获得E1B55K基因,构建真核表达载体,转染Hep2细胞,筛选单克隆,用RT-PCR检测了E1B55K基因的表达。用引起293细胞完全CPE比较产毒量的方法对所得细胞克隆进行初步筛选,获得一株产毒相对较强的细胞Hep2-E1B#4。与对照细胞Hep2、Hep2-DNA3相比,等量Ad41接种Hep2-E1B#4产生的细胞病变效应(CPE)程度明显加深。用免疫细胞化学的方法测定产毒的感染滴度,等量Ad41接种后,Hep2-E1B#4产生的子代腺病毒滴度大于对照的9倍;半定量PCR测得Hep2-E1B#4子代病毒基因组拷贝数约为对照细胞的4倍。结果说明转染E1B55K基因促进了Ad41在Hep2细胞的复制,获得的Hep2-E1B#4细胞株可用于Ad41的分离、培养和体外扩增。

流体剪切力诱导喉鳞癌Hep2细胞上皮-间充质转化

目的探究流体剪切力(fluid shear stress,FSS)对喉鳞癌Hep2细胞发生上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的影响。方法对Hep2细胞加载140 m Pa的FSS,观察不同时间点细胞的形态学变化;划痕实验检测力学加载后Hep2细胞迁移能力的变化;共聚焦显微镜下观察细胞骨架蛋白F-actin的分布;Western blotting检测EMT相关蛋白的表达。结果 FSS力学加载后,Hep2细胞形态由多边形向梭形转变,撤销FSS后,细胞恢复初始的多边形;Hep2细胞迁移能力的增加依赖于FSS加载时间。FSS促使细胞骨架蛋白F-actin重排,从而增强Hep2细胞的迁移行为。FSS使Hep2细胞EMT标志蛋白发生了时序性变化。结论 FSS是诱导Hep2细胞发生EMT的一个重要物理因素。

凋亡蛋白对Hep2细胞影响的研究

从鸡贫血病毒(CAV———ch icken anem ia virus)总DNA中克隆凋亡蛋白(Apoptin)基因片段,并与pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体构建融合载体,转化E.coli.DH5α,筛选氨苄抗性阳性克隆并鉴定.以该融合载体转染Hep2细胞后,在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光标记,同时观察到细胞核形态学呈凋亡特征变化,表明凋亡蛋白可以诱导Hep2细胞系发生凋亡.

TAZ基因在喉癌组织中的表达规律及其对Hep2细胞增殖的影响

目的探讨TAZ基因在喉癌组织中的表达规律及其对喉癌Hep2细胞增殖的影响。方法免疫组化检测TAZ在32例喉癌及相应癌旁组织中的表达情况,实时PCR法检测其中TAZ mRNA的表达情况。喉癌Hep2细胞分为实验组和对照组,实验组转染真核表达载体pcDNA3.1-TAZ,对照组转染空载体,应用Western blot法及实时PCR法检测两组细胞中TAZ及EMT过程关键基因的表达水平;MTT法及细胞克隆形成实验测定两组细胞增殖活力。此外,转染pcDNA3.1-LATS1以激活Hippo通路检测TAZ在喉癌细胞中的作用是否依赖Hippo信号。结果喉癌组织中TAZ蛋白及mRNA表达显著高于癌旁组织(P<0.05);过表达TAZ后,Hep2细胞增殖活力明显高于对照组(P<0.05),其中EMT过程中上皮关键基因如E-cadherin下调(P<0.05),而间质细胞关键基因如Vimentin表达增加(P<0.05),同时活化Hippo后喉癌细胞EMT过程受抑制。结论TAZ在喉癌组织中高表达,TAZ过表达能够促进Hep2细胞增殖,且该过程依赖Hippo信号通路,提示Hippo-TAZ可能在喉癌发生、发展过程中起重要作用。

miR-155对喉鳞状细胞癌Hep2细胞增殖影响及机制

目的探讨miR-155对喉鳞状细胞癌Hep2细胞增殖影响及具体机制。方法采用miR-155 NC和miR-155 inhibitor转染Hep2细胞,realtime-PCR法检测转染效果,细胞计数盒-8(CCK-8)法检测不同转染时间(12、24、36、48、60、72 h)细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;Western blot检测Hep2细胞中细胞周期蛋白A1(cyclin A1)、cyclin D1、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/叉形头转录因子(Foxo3a)信号通路相关蛋白表达量。结果 miR-155 inhibitor组中miR-155表达量(0.34±0.03)明显低于miR-155 NC组(1.25±0.10),且转染24、36、48、60、72 h后,miR-155 inhibitor组Hep2细胞活力明显低于miR-155 NC组;与miR-155 NC组比较,miR-155 inhibitor组Hep2细胞凋亡率明显提高,细胞周期阻滞于G1期,cyclin A1、cyclin D1、PI3K、p-AKT表达下调,Foxo3a表达上调,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论 miR-155表达下调可降低Hep2细胞活力、增加细胞凋亡率,其机制可能与miR-155调控PI3K/AKT/Foxo3a信号通路有关。

siRNA干扰沉默S100A4基因表达对喉癌Hep2细胞周期和侵袭的影响

目的应用RNA干扰技术下调喉癌Hep2细胞中S100A4基因的表达,探讨其对Hep2细胞周期和细胞侵袭力的影响。方法脂质体法转染S100A4siRNA至Hep2细胞。Real-time PCR和Western blot验证S100A4基因mRNA和蛋白水平的表达,流式细胞术和transwell实验分别检测下调S100A4表达对Hep2细胞周期和侵袭能力的影响。结果 S100A4 mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖指数显著降低,并且处于G1期细胞数明显增多,细胞侵袭能力显著降低。结论 S100A4siRNA转染喉癌Hep2细胞能有效下调S100A4基因的表达,从而影响Hep2的细胞周期和抑制细胞的侵袭能力。