幽门螺杆菌对肝癌HepG2细胞C‐Met基因表达的影响

目的研究幽门螺杆菌(Hp)对肝癌HepG2细胞原癌基因C-Met表达的影响。方法将Hp与HepG2细胞共同培养,设置空白对照组、Hp组、C-Met抑制剂空白组和C-Met抑制剂Hp组,每组设副孔5个,采用CCK8试剂盒检测HepG2细胞增殖活性,采用Western blot和qPCR方法检测C-Met原癌基因蛋白和mRNA表达水平。结果相较于空白对照组,Hp处理组HepG2细胞增殖活性升高且与时间呈正相关,而C-Met抑制剂可以抑制HepG2细胞的增殖活性。同时,Hp组HepG2细胞C-Met基因蛋白和mRNA表达水平均上调,C-Met抑制剂组则显著下调。相较于Hp共培养12 h,共培养24 h C-Met蛋白和mRNA表达水平均上调。结论Hp促进HepG2细胞的增殖可能与其提高原癌基因C-Met的蛋白及其mRNA表达水平有关,为后续更深入研究肝癌发生发展的复杂机制提供了理论依据。

幽门螺杆菌对人肝细胞系HepG2原癌基因c-fos表达的影响

目的 探讨H .pylori对HepG2c-fos基因表达的影响。 方法 将H .pylori与HepG2共同培养 1、3、6、12和2 4h ,采用RT -PCR和Westernblot方法检测不同作用时相细胞的c -fosmRNA和蛋白表达。结果 cgA+ H .pylori作用HepG2后c -fos呈短暂一过性表达升高 ,c -fosmRNA、蛋白质在H .pylori感染后 1h开始增加 ,6h达高峰 ,表达水平分别为对照组的 2 .5倍和 1.6倍 (P <0 .0 1)。 12h开始下降 ,2 4h基本恢复到刺激前水平。而cgA-H .pylori及空肠弯曲菌与HepG2细胞共培养后 ,未见该基因的表达升高。结论 cag+ A H .pylori可诱导HepG2c -fos基因表达升高 ,其在肝癌发生中的作用有待进一步研究。

BC047440-siRNA对肝癌HepG2细胞增殖抑制及其分子机制的初步探讨

目的利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制肝癌相关基因BC047440的表达,观察其受抑制后对细胞增殖能力的影响并初步分析其抑制增殖的分子机制。方法设计针对BC047440基因的siRNA,构建pGenSil-1-BC047440-siRNA真核表达载体。分别用脂质体法将介导siRNA的真核绿色荧光表达载体pGenSil-1-BC047440-siRNA、空载体质粒pGenSil-1转染人肝癌HepG2细胞建立稳定细胞株;随后实验分为3组:转染siRNA表达载体组(PP2)、转染空质粒组(PP1)和未处理的亲本HepG2细胞组(PP0)。采用荧光定量PCR检测BC047440mRNA表达变化;CCK-8分析细胞增殖活性;平板克隆形成实验检测单个细胞的增殖能力;最后选取NF-κB下游增殖相关基因c-myc、bcl-2、cyclin D1,用荧光定量PCR检测其mRNA水平的变化。结果成功转染并获得PP1、PP2组抗性克隆,PP2组与PP0组比较,BC047440mRNA水平明显降低,抑制率约为75%;细胞增殖实验中PP2组细胞增殖能力明显降低,平板克隆形成实验结果显示PP2组克隆形成率为(8.42±0.82)%,明显低于PP1组[(39.31±5.39)%]和PP0组[(40.96±3.21)%](P<0.01)。检测NF-κB下游增殖相关的几个基因时发现PP2组c-myc mRNA表达明显降低,约为PP0组的12/25;其余基因无明显变化。结论干扰BC047440基因表达可以抑制肝癌细胞的增殖,初步揭示BC047440基因可以对c-myc起正向调控作用,从而促进肝癌细胞的增殖,提示抑制BC047440基因可能成为控制人肝癌细胞生长的有效靶点。

HBx和c-Src对肝癌细胞HepG2上皮间质转化的介导作用及其分子机制

目的探讨HBx和c-Src对肝细胞癌Hep G2细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的介导作用及其分子机制。方法构建HBx腺病毒及对照腺病毒,转染Hep G2细胞,观察细胞形态改变,应用Western blot和免疫组化的方法探索Hep G2细胞的EMT相关信号分子的表达及细胞定位情况。应用c-Src特异性抑制剂PP2处理HBx转染的Hep G2细胞,观察PP2处理前后细胞的EMT形态及分子特征变化。结果 HBx基因的转染导致Hep G2细胞形态发生改变,呈现出成纤维细胞样改变,细胞连接松散。HBx蛋白有效下调了上皮细胞标志E-cadherin的表达(P<0.05),上调了间质细胞标志N-cadherin和vimentin的表达(P<0.05),符合EMT改变。c-Src特异性抑制剂PP2能够有效阻断HBx所介导的Hep G2细胞的EMT改变。结论 HBx基因的转染导致肝细胞癌Hep G2细胞发生EMT改变,c-Src分子在HBx蛋白介导的EMT改变中发挥了至关重要的作用。

丙型肝炎病毒特异性核酶对HepG2.9706细胞HCV5′NCR基因表达的抑制作用

为探讨锤头型核酶抗丙型肝炎病毒的作用 ,根据HCV 5′NCR及翻译起始区的二级结构 ,设计及合成了 1个锤头型核酶RzA .将其插入pCI neo表达载体的多克隆位点 ,构建了表达RzA的质粒pHCV RzA .采用转基因细胞模型HepG2 970 6细胞 ,评价了pHCV RzA质粒对HCV 5′NCR调控荧光素酶表达的抑制活性 .结果表明 ,在HepG2 970 6细胞中 ,pHCV RzA以序列特异性、剂量依赖性方式抑制荧光素酶基因的表达 ,抑制率达 80 % ,提示核酶有可能作为HCV感染基因治疗的一种有效途径 .

蛋白激酶C活性与电离辐射诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡的关系(英文)

目的探讨蛋白激酶C(PKC)活性与X线电离辐射诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡的关系。方法PKC调节剂PMA和SP预处理HepG2细胞,分辐射组、PMA0.5h组、PMA24h组、SP组;32P掺入法检测细胞的PKC活性,Varian2100直线加速器辐射细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果6GyX线辐射诱导HepG2细胞凋亡率是21.9%,辐射后细胞PKC活性是辐射前的2.79倍。辐射组、PMA0.5h组、PMA24h组、SP组的PKC活性分别为1.07、3.86、0.51、0.48pmol/(min·μg),细胞凋亡率分别为21.9%、5.73%、31.70%和32.83%。结论辐射可以引起HepG2细胞凋亡,PKC活性增加/降低对辐射诱导的凋亡起抑制/促进作用,提示PKC可能参与了细胞凋亡保护机制。

维生素C和多西环素联用对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的抑制作用

目的探讨维生素C和多西环素(Doxycycline)联用对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的抑制作用及其作用机制。方法在体外用细胞培养技术培养人肝癌HepG2细胞,用维生素C和多西环素联合干预,倒置显微镜下观察肿瘤细胞的生长情况,MTT法检测Vitmin C和Doxycycline联合应用对HepG2细胞增殖活性的影响,同时测定肝癌细胞肿瘤标志物(AFP、γ-GT)和凋亡蛋白(Fas、Bcl-2、Bax)的含量。结果用维生素C和多西环素联合干预HepG2细胞72h,能明显抑制肿瘤细胞的增殖(p<0.05);肿瘤标志物(AFP、γ-GT)和凋亡抑制蛋白Bcl-2含量下降(p<0.05);凋亡蛋白(Fas、Bax)的含量升高(p<0.05)。结论维生素C和多西环素联合应用在肝癌HepG2细胞体外培养时能够抑制肿瘤细胞的生长,其作用机制与增加癌细胞的凋亡作用有关。

南蛇藤乙酸乙酯提取物通过活化caspase依赖的线粒体通路诱导HepG2细胞凋亡

目的通过检测南蛇藤乙酸乙酯提取物在诱导肝癌细胞HepG2凋亡过程中产生的凋亡蛋白表达量探讨其凋亡途径。方法应用Annexin V-FITC与碘化丙啶(promide iodine,PI)双染色法,通过流式细胞技术检测不同浓度(15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml和240μg/ml南蛇藤乙酸乙酯提取物)干预HepG2细胞24小时后的细胞凋亡情况;应用蛋白质印迹法检测不同浓度(30μg/ml、60μg/ml及120μg/ml)南蛇藤乙酸乙酯提取物作用HepG2细胞24小时及60μg/ml和120μg/ml南蛇藤乙酸乙酯提取物作用HepG2细胞48小时后细胞中细胞色素c、裂解的胱冬蛋白原9(cleaved caspase-9)和胱冬蛋白酶3(caspase-3)的表达。结果当南蛇藤乙酸乙酯提取物浓度为15μg/ml、30μg/ml和60μg/ml时,可诱导HepG2细胞出现细胞凋亡,且细胞色素c、裂解的胱冬蛋白原9和caspase-3的表达量增加;随南蛇藤提取物浓度的增加(30μg/ml、60μg/ml及120μg/ml),蛋白表达亦增强。结论南蛇藤乙酸乙酯提取物可能是通过促使膜间蛋白细胞色素c表达和释放活化caspase-9与caspase-3而诱导HepG2细胞的凋亡。

HCV 1a/1b型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达

采用HCV 1a/1b嵌合体cDNA构建表达质粒转染HepG2细胞,以免疫组化和Western blotting检测HCV蛋白表达,RT-PCR检测HCV正、负链RNA,研究丙型肝炎病毒(HCV)1a和1b型嵌合体全长cDNA在HepG2细胞中的复制和表达。结果证明,转染细胞中检测到分子量约70kDa的HCVNS3蛋白,转染细胞连续传20代,仍能检测到HCV正、负链RNA。表明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV 1b型的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)可以起始含1a型非编码区的病毒复制。HCV 5′端非翻译区第11、12、13、34和35位核苷酸改变可不影响其与核糖体结合。3′非翻译区9400,9403和9407位核苷酸改变,9435位缺失“A”,9409,9410位及9495,9496,9497位分别插入“TT”和“AAT”可不影响RORp的生物活性。本研究对阐明HCV复制和翻译机制有重要意义。

外源HCV核心基因表达载体在HepG2中蛋白表达的亚细胞定位

目的研究HCV全长(天然)核心蛋白(C蛋白)和成熟C蛋白在HepG2细胞内的亚细胞定位,为进一步研究C蛋白与宿主细胞蛋白因子相互作用提供实验依据。方法设计HCV全长和成熟核心基因引物,以pBRTM/HCV1-3011为真核表达载体为模版行PCR;将PCR扩增产物酶切纯化后定向插入pEGFP-C1的BeglⅡ和EcoRⅠ位点,得到能表达全长HCV核心蛋白(C191aa.)和成熟核心蛋白(C173aa.)的真核表达载体pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173;将扩增pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173质粒转染到HepG2细胞中,28h、5d在荧光显微镜下观察两种C蛋白的亚细胞定位。5d后再用免疫细胞化学法观察两种C蛋白在HepG2细胞中着色现象。结果HCV核心基因PCR产物和构建的pEGFP-C1-C191、pEGFP-C1-C173经扩增测序证实。pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞28h后融合荧光全长C蛋白C191主要出现在核膜和胞质中,少部分出现在胞核及其膜中;而pEGDP-C1-C173转染HepG2细胞28h后主要定位在核中和核膜上。但pEGDP-C1-C191转染HepG2细胞5d后,其表达的融合荧光蛋白主要出现在核内和核膜上,少量在胞质中;而成熟C蛋白C173则仍然在胞核内及核膜上。pEGDP-C1-C转染HepG2细胞5d后进行免疫细胞化学显示,C191蛋白和C173蛋白主要在核中、核膜着色,胞质有少量着色。结论HCV全长C蛋白的亚细胞定位是一动态过程,先出现在胞质中和核膜上,最后定位在核中和核膜上;成熟C蛋白主要定位在核中和核膜上。这种现象为解释瞬时转染HCV不同长度C基因对p53/p21通路作用出现相反结果奠定基础。

桑根酮C对游离脂肪酸诱导人肝癌HepG2细胞脂质蓄积的改善作用

目的:研究桑根酮C对游离脂肪酸诱导的人肝癌HepG2细胞脂质蓄积的改善作用。方法:将HepG2细胞分为对照组、模型组、非诺贝特组(10μmol/L)和桑根酮C低、中、高浓度组(2、4、8μmol/L),除对照组外,其余各组细胞加入1 mmol/L游离脂肪酸以诱导建立脂质蓄积模型,且各给药组加入相应含药培养基进行培养。采用油红O染色法观察细胞中脂质蓄积情况,并测定脂质水平和三酰甘油(TG)含量;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法和Western blot法检测细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、肉碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)、成脂甾醇元件结合蛋白固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FAS)、沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α(PGC-1α)的mRNA和蛋白表达水平。结果:与对照组比较,模型组细胞核明显萎缩、体积变小,脂滴数明显增加;细胞中脂质水平、TG含量以及SREBP-1c、FAS的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),PPARα、CPT-1、SIRT1、PGC-1α的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。与模型组比较,桑根酮C各浓度组细胞核萎缩不明显、体积大小正常,脂滴数明显减少;细胞中脂质水平、TG含量以及上述PPARα通路相关基因的mRNA和蛋白(桑根酮C低浓度组的SREBP-1c蛋白除外)表达水平均显著逆转(P<0.05或P<0.01)。结论:桑根酮C可改善HepG2细胞的脂质蓄积;其作用机制可能与调节PPARα信号通路、提高细胞脂质氧化能力、抑制脂质合成有关。

尼古丁通过Raf/MEK/ERK信号通路调节HepG2细胞中PCSK9的表达

目的探讨尼古丁对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)表达的影响以及分子机制。方法采用不同浓度的尼古丁(0、5、10、20μmol/L)处理HepG2细胞0、24、48 h,观察与低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)代谢密切相关的PCSK9的变化情况。实验分(n=3):对照组(CON组,细胞正常培养);尼古丁组(NIC组,加入10μmol/L的尼古丁孵育24 h);尼古丁+尼古丁抑制剂组(MH组,10μmol/L尼古丁抑制剂盐酸美加明);尼古丁+Raf抑制剂组[PLX组,1μmol/L Raf抑制剂(PLX4720)];尼古丁+MEK抑制剂组[PD组,1μmol/L MEK抑制剂(PD0325901)];尼古丁+ERK抑制剂组[CC组,1μmol/L ERK抑制剂(CC-90003)]。后4组预处理1 h后再加入10μmol/L的尼古丁一起孵育24 h。采用CCK-8实验检测HepG2细胞的活性,划痕实验检测细胞迁移能力,油红O染色检测尼古丁处理后的脂质沉积。运用网络药理学筛选LDL-C与尼古丁的共同靶点和作用通路。分别使用Western blot和RT-qPCR分析PCSK9以及MAPK通路(Raf、MEK、ERK)的蛋白和mRNA的表达水平。用免疫荧光染色、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测PCSK9蛋白的表达水平。结果随着尼古丁浓度的升高,HepG2细胞的活性不断降低,并且相同尼古丁浓度下48 h比24 h下降更多。与CON组比较,NIC组HepG2细胞的迁移能力和脂质沉积增加(P<0.01),而MH组相较于NIC组迁移能力和脂质沉积下降(P<0.01)。LDL-C与尼古丁的交集靶点多达257个,二者的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction networks,PPI)核心靶点涉及MAPK通路;生物过程包含“MAPK活性的正向调节”,且通路分析中的“脂质和动脉粥样硬化”富集分数最高。与CON组比较,NIC组Raf、MEK、ERK的蛋白和mRNA表达增强(P<0.05,P<0.01),MH组的相关蛋白和mRNA表达较NIC组明显下调(P<0.05,P<0.01)。NIC组的PCSK9蛋白和mRNA较CON组上调(P<0.05),MH组、PLX组、PD组和CC组的PCSK9蛋白和mRNA较NIC组下降(P<0.05)。结论尼古丁可增加HepG2细胞脂质沉积和迁移能力,并通过Raf/MEK/ERK信号通路调节HepG2细胞中PCSK9的表达;上调的PCSK9可能是细胞内脂质沉积的重要原因。

测定HepG2细胞内^13C标记氨基酸及代谢物同位素丰度的方法

目的利用稳定同位素和气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)衍生化法检测四君子汤(Sijunzi Decoction,SJZD)与丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)联用对HepG2细胞内丙氨酸代谢的影响,探讨不同给药组与空白组HepG2细胞内丙氨酸代谢的差异及其意义。方法 HepG2细胞分4组(空白组、SJZD组、MMC组和SJZD与MMC联用组),分别给^13C标记丙氨酸(^13C-labeled alanine,^13C-Ala)培养12 h,回收细胞并加入体积分数为80%的甲醇溶液超声破碎后,离心取上清液,氮吹仪吹干,用体积分数为1%三甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane,TMCS)的N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide,MSTFA)衍生化,利用GC-MS检测并分析检测结果。结果 ^13C-Ala同位素丰度在10.00%~98.00%内均可以被准确测定,所建立的方法具有良好的准确度和精密度,用该方法对10组供试品进行测定,并根据EI图谱的离子碎片信息对^13C-Ala同位素丰度进行计算,统计分析结果显示,空白组与SJZD组无显著性差异(P>0.05),空白组与MMC组有极显著性差异(P<0.01),联用组与MMC组有极显著性差异(P<0.01);采用相对峰面积(Area%)比较各组之间的差异,所得结果与采用同位素丰度进行计算的结果一致。^13C-Ala下游产物乳酸的代谢采用同位素丰度进行计算,结果显示:各组之间无显著性差异。但Area%结果显示:SJZD组与空白组比较无显著性差异(P>0.05),MMC组与空白组有极显著性差异(P<0.01),联用组与MMC组相比有极显著性差异(P<0.01)。结论 SJZD单独作用对丙氨酸及其代谢产物乳酸的影响不大,与MMC联用给药后对MMC的干扰有明显的抑制作用,所得结果与前期靶向代谢组学的结论相一致,本方法可作为HepG2细胞内氨基酸更为精确的测定方法,具有良好的应用前景。

白茅苷抑制β-catenin/TCF4通路的活化对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭和间质转化的调节作用

目的研究白茅苷(Imp)对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭和间质转化的调节作用及其作用机制。方法体外实验:将细胞随机分为Control组、Imp(50μmol/L)组、Imp(100μmol/L)组和Imp(200μmol/L)组,给予对应处理后,通过Brdu染色、Transwell、划痕实验和Western blot分别检测肝癌HepG2细胞增殖、侵袭、迁移能力、上皮间质转化相关蛋白和信号通路蛋白表达情况;体内实验:皮下注射肝癌HepG2细胞建立肝癌移植瘤模型,给予对应处理后记录各组肿瘤体积,并通过免疫组化检测肿瘤组织Ki67和血管内皮生长因子(VEGF)表达。结果Imp剂量依赖性地抑制体外培养的肝癌HepG2细胞增殖和Ki67、PCNA表达量(P<0.05),侵袭细胞数(P<0.05),划痕闭合率(P<0.05);调节VEGF、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达(P<0.05);下调β-catenin、TCF4和c-Myc相对蛋白表达(P<0.05)。Imp剂量依赖性地抑制移植瘤肿瘤生长体积(P<0.05)和肿瘤组织中增殖相关蛋白Ki67、PCNA表达(P<0.05)。结论Imp能抑制肝癌HepG2细胞体外增殖、侵袭和间质转化能力及移植瘤的体内生长,其机制与抑制β-catenin/TCF4通路活化相关。

特异性的shRNA抑制c－Jun蛋白表达对HepG2细胞增殖和迁移的影响

目的：构建c－Jun特异性的shRNA及研究其抑制c－Jun蛋白表达对人类肝癌细胞HepG2增殖和迁移的影响。方法根据c－Jun编码序列设计并构建shRNA质粒，利用LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞，荧光显微镜观察转染效率。 Western blot检测其对c－Jun蛋白表达的影响。 CCK－8增殖实验、平板克隆形成实验观察HepG2细胞的增殖情况，transwell和划痕愈合实验方法观察细胞的迁移情况。结果构建了c－Jun小干扰质粒shRNA－1和shRNA－2。荧光显微镜观察到shRNA质粒在HepG2细胞转染效率约在80％。 Western blot显示shRNA－2小干扰质粒对c－Jun抑制效果要强于shRNA－1小干扰质粒。功能实验结果显示，与阴性对照组相比，shRNA－2能显著抑制HepG2细胞的增殖、克隆形成及其迁移能力（P均＜0．05）。结论成功构建了对c－Jun有效shRNA干扰质粒，下调c－Jun的表达能够明显抑制肝癌细胞的增殖和迁移，为进一步研究c－Jun在肝癌中的作用及相关机制提供了工作基础。

硼酸钠对人肝癌细胞HepG2内质网应激蛋白Grp78和CHOP表达的影响

目的观察硼酸钠(Borax)对人肝癌细胞HepG2内质网应激(ERS)蛋白葡萄糖调节蛋白78(Grp78)及下游靶基因C/EBP家族同源蛋白(CHOP)表达的影响,探讨其促凋亡的机制。方法将HepG2细胞分为两组,观察组用0.1 mmol/L Borax处理,对照组未经Borax处理,分别采用qRT-PCR法和免疫印迹法检测观察组Borax作用1、2、3、4 h和对照组HepG2细胞中Grp78、CHOP mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,观察组Grp78 mRNA相对表达量在Borax作用2 h达到最高,在作用3、4 h下降(F=29.233,P<0.01);与对照组比较,观察组CHOP mRNA相对表达量在Borax作用4 h内表达持续升高(F=208.207,P<0.01)。与对照组比较,观察组Grp78蛋白相对表达量在Borax作用2 h内表达上调,在作用3、4 h下降(F=79.936,P<0.01);与对照组比较,CHOP蛋白相对表达量在Borax作用4 h内持续升高(F=200.324,P<0.01)。结论 Borax通过活化ERS蛋白Grp78,并进一步激活促凋亡蛋白CHOP,从而启动ERS依赖的凋亡途径,诱导HepG2细胞凋亡。

去氢骆驼蓬碱诱导HepG2细胞凋亡并增强其对5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性

目的:研究去氢骆驼蓬碱体外诱导HepG2细胞凋亡过程中c-Jun N末端激酶(JNK)途径的作用,并观察其联合化疗药物对HepG2细胞的影响。方法:CCK-8法检测联合或不联合使用JNK特异性抑制剂SP600125对细胞增殖的抑制作用;克隆形成实验观察不同浓度药物对细胞克隆形成的影响;Hoechst 33258染色法观察细胞形态变化;PI单染检测细胞亚二倍体率;Annexin V-PI双染测定细胞早期凋亡水平;Western blotting检测细胞聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、JNK和p-JNK蛋白表达的改变;联合5-氟尿嘧啶(5-FU)或顺铂(DDP)观察细胞对化疗药物的敏感性。结果:去氢骆驼蓬碱随药物浓度的升高而抑制作用增强,48 h后IC50为9.80 mg/L;去氢骆驼蓬碱能显著抑制细胞克隆形成,并且导致细胞凋亡形态学变化;PI单染检测发现细胞周期的G1期前有亚二倍体凋亡峰,Annexin V-PI双染检测细胞出现明显的早期凋亡细胞群;Western blotting检测到随着去氢骆驼蓬碱浓度增加PARP及p-JNK蛋白表达增加,JNK蛋白表达减少;联合使用SP600125对细胞增殖的抑制作用减弱;联合5-FU或顺铂明显增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用,增敏倍数分别为1.47和5.78倍。结论:去氢骆驼蓬碱对HepG2细胞有增殖抑制作用,并诱导其凋亡,激活JNK信号通路可能是其主要机制之一;同时去氢骆驼蓬碱可以增强HepG2细胞对5-FU和顺铂的敏感性。

淫羊藿苷联合丝裂霉素对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用

目的通过将淫羊藿苷(ICA)联合丝裂霉素(MMC)联合作用肝癌HepG2细胞的实验研究,探讨联合药物对HepG2细胞增殖的抑制作用及其可能的机制。方法 MTT法检测不同浓度ICA、MMC或两药联合处理48 h后及未处理组HepG2细胞的增殖活性,通过两药相互作用系数CDI评价两种药物的相互作用性质;RT-PCR检测药物处理后HepG2细胞内凋亡抑制蛋白质FLIP mRNA水平的变化。结果单独ICA或MMC处理后,均可抑制HepG2细胞的增殖,其抑制率随着药物剂量增加而增强(P<0.05),呈剂量依赖性;两药联合应用对HepG2细胞增殖的抑制作用明显,其抑制率呈剂量依赖性(P<0.01),且两药作用具有协同效应(CDI<1);与未处理组相比,ICA或MMC处理后HepG2细胞内FLIP mRNA水平降低,尤其以联合药物处理组降低更加显著(P<0.001)。结论 ICA与MMC联用可在体外抑制肝癌细胞的增殖,两药具有协同效应,其抑制机制可能通过抑制凋亡抑制蛋白FLIP的表达,从而增加癌细胞的凋亡而实现的。

白介素-18对肝癌裸鼠皮下移植瘤浸润的CD4+T细胞子集的影响

目的探讨白介素-18(IL-18)影响肝癌裸鼠皮下移植瘤浸润的T细胞子集变化的机制。方法以HepG2细胞在裸鼠皮下接种,形成人肝癌皮下移植瘤的同时,以不同剂量IL-18分为4组治疗,4组分别腹腔注射IL-18 0.75,1.00,1.25,0(模型组)μg(0.1 mL)/只,治疗4周,另设正常对照组。观察肿瘤的生长速度和瘤体大小的变化。4周后处死取肿瘤组织和脾组织,免疫磁珠阴选组织中CD4+T细胞,流式细胞术检测各组肿瘤组织及脾组织中IL-17+/IFN-γ-CD4+T(Th17细胞)、IL-17-/IFN-γ+CD4+T(Th1)和IL-17+/IFN-γ+CD4+T细胞的变化。结果 HepG2细胞株建立了裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,IL-18抑制人肝癌皮下移植瘤的形成及转移,治疗时间越长剂量越大,抑制效果越明显;与正常对照组比较,肿瘤组织中Th17和IL-17+/IFN-γ+CD4+T细胞浸润数目增加,Th1细胞降低,与脾组织中一致,与正常对照组比较有显著差异(P<0.05)。给IL-18后,随着剂量的增加,Th1细胞增加,IL-17+/IFN-γ+CD4+T细胞和Th17细胞浸润数目降低,给药组与模型组比较有显著差异(P<0.05或0.01)。结论 IL-17+/IFN-γ+CD4+T细胞数目在裸鼠移植瘤及其脾组织中增加,可能是在肿瘤环境中,促进其向Th17细胞分化;IL-18通过诱导IFN-γ的生成促进Th1细胞的生成,呈正反馈效应抑制肿瘤的增殖和转移。

丙型肝炎病毒核心区蛋白在HepG2细胞中的表达

目的 :构建能稳定表达丙型肝炎病毒核心区蛋白的哺乳动物细胞系 ,以便对丙型肝炎病毒核心区蛋白的抗原性及其他功能作进一步研究。方法 :通过PCR扩增丙型肝炎病毒核心基因 ,将其亚克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中 ,用脂质体包裹后转染肝癌细胞系HepG2 ,通过G4 18筛选获得稳定转染细胞系 ,并通过间接免疫荧光法检测HepG2中丙型肝炎病毒核心区蛋白的表达。结果 :克隆的基因全长 5 94bp ,并经测序和重组质粒双酶切证实为所需目的基因 ;经间接免疫荧光验证实转染了目的基因的HepG2细胞中有丙型肝炎核心区蛋白的表达。结论 :丙型肝炎病毒核心区蛋白能在HepG2细胞中稳定表达。