天名精内生真菌的分离鉴定及抗肝癌活性研究

目的对天名精内生真菌进行分离和鉴定,并从中筛选出具有抗肝癌作用的活性菌株,为寻找新的抗肝癌先导化合物提供菌株资源。方法采用植物组织切块法和平板划线法对天名精内生真菌进行分离纯化;MTT法筛选对肝癌HepG2细胞增殖具有抑制作用的活性菌株,并计算活性显著内生真菌的IC50值;运用形态学鉴定和分子鉴定的方法对活性菌株进行鉴定。结果从天名精中共分离得到60株内生真菌,其中TMJ-03、TMJ-13、TMJ-15、TMJ-23、TMJ-54为活性内生真菌,其发酵物抑制HepG2细胞增殖的IC50值分别为19.49(TMJ-C-03)、31.13(TMJ-C-13)、88.65(TMJ-C-15)、37.42(TMJ-D-23)、17.22(TMJ-D-54)、32.72(TMJ-C-54)μg·mL^(-1)。5株活性菌株均鉴定到种,分别为Aspergillus terreus、Chaetomium globosum、Alternaria tillandsiae、Fusarium proliferatum、Alternaria arborescens。结论首次从天名精中筛选出对HepG2细胞增殖具有抑制作用的活性内生真菌,为寻找新的抗肝癌药物提供了菌株资源。

miR-195表达载体构建及其对肝癌细胞株HepG2植瘤抑制效果的影响

目的研究miR-195对人肝癌细胞株HepG2肿瘤形成的影响。方法应用分子克隆技术构建miR-195表达载体;用脂质体转染以及克隆筛选技术,建立miR-195高表达HepG2细胞株,并通过测序及序列比对等进行鉴定;建立荷瘤小鼠模型,检测不同细胞系的肿瘤生长能力。结果通过测序及序列比对,证明miR-195表达载体构建成功;荧光显微镜观察结果显示,miR-195高表达HepG2细胞株成功构建,实时定量PCR鉴定结果表明,构建的miR-195高表达HepG2细胞株miR-195表达量为对照培养HepG2细胞株的2 000倍(P<0.01);植瘤实验证明,miR-195高表达可以抑制肿瘤的形成过程。结论作为抑癌的miRNA,miR-195有望成为肝癌基因治疗的效应分子。

全反式维甲酸对肝癌HepG2细胞chemerin基因表达的调控

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对chemerin基因表达的调控并初探其调控机制。方法:培养HepG2细胞,加入全反式维甲酸,观察其对chemerin表达的影响。采用实时PCR检测chemerin在mRNA水平的表达变化;蛋白质印迹法检测chemerin在蛋白水平的表达变化。通过构建含不同长度chemerin启动子区域的报告质粒,用检测荧光素酶活性的方法,研究ATRA与维甲酸受体(RAR)β结合对chemerin启动子区域的影响。结果:ATRA可呈量效关系诱导HepG2细胞chemerin的mRNA及蛋白水平的表达升高,在10μmol/L时作用最强(P<0.05);呈时效关系诱导HepG2细胞chemerin的蛋白水平表达升高,在作用36 h时诱导作用最强(P<0.05);去除chemerin启动子-258bp/+121bp区后,ATRA对chemerin启动子的转录激活作用骤然下降,提示ATRA-RARβ与chemerin启动子的-258bp/-90bp区域结合。结论:ATRA可上调HepG2细胞chemerin的表达,RARβ介导ATRA对chemerin启动子区的转录激活作用。

伊立替康及联合5-氟尿嘧啶、顺铂对人肝癌细胞株的细胞毒作用实验研究

[目的]探讨伊立替康(CPT-11)及联合5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)对人肝癌细胞株的细胞毒性作用。[方法]利用MTT比色法检测CPT-11,5-FU,DDP 3种药物对人肝癌HepG2细胞株的抑制率,进一步测定3种药物单药及联合用药对细胞生长抑制的情况并进行比较。[结果]不同浓度CPT-11,5-FU,DDP作用细胞后,细胞生长受到不同程度的抑制,这一抑制作用随药物浓度的升高而增强(P<0.01),单药对肝癌细胞株抑制作用最强的为CPT-11,其次为DDP,5-FU(三药作用于相同起始浓度的肝癌细胞株48、72、96、120 h后细胞数量分别为4.70±0.25、12.71±0.23、20.30±1.59、24.20±2.31;6.50±0.81、16.25±0.72、24.60±0.65、31.30±2.31;9.50±0.06、17.75±0.19、30.00±0.41、38.40±1.01;单位为1×104个/孔,与对照组比较P<0.01)。联合用药时抑制作用最强的为CPT-11、DDP、5-FU联合用药组,后依次为CPT-11、DDP联合、CPT-11、5-FU联合、5-FU、DDP联合(四组药物作用于相同起始浓度的肝癌细胞株48、72、96、120 h后细胞数量分别为6.30±0.79、9.50±0.66、14.50±0.03、21.40±0.66;6.60±0.54、12.20±0.71、20.90±0.45、28.80±0.36;9.00±0.61、16.40±0.29、30.40±0.37、37.30±0.25;12.00±0.02、18.80±0.39、30.70±0.07、35.40±0.08;单位为1×104个/孔,与对照组比较P<0.01)。[结论]CPT-11对肝癌细胞株具有一定的细胞毒性作用,并强于目前肝癌临床常规用药5-FU、DDP,CPT-11可与DDP、5-FU联合应用于原发性肝癌的治疗。

灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤血管生成的抑制作用

目的研究灵芝孢子粉对裸鼠移植性人肝肿瘤血管生成的影响,并初步探讨其抑瘤机制。方法建立裸鼠移植性人肝肿瘤模型,采用随机区组设计法随机分为空白对照组、阳性对照组及灵芝孢子粉组,观察裸鼠肿瘤生长。采用苏木精-伊红染色法、SP免疫组织化学法及病理Imagepro Plus5.0彩色图像定量分析法检测裸鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)。结果灵芝孢子粉为2.1 g/kg时,对裸鼠移植瘤的抑制率为57.0%,与空白对照组比较有显著差异(P<0.01)。镜下观察,灵芝孢子粉组与空白对照组相比,肿瘤坏死组织较多,细胞异型性较小。灵芝孢子粉组VEGF、MVD表达水平较空白对照组有明显下降。结论高浓度及大剂量的灵芝孢子粉对肝肿瘤有明显抑制作用,并能抑制肿瘤新生血管生成,其机制可能与对VEGF表达的抑制有关。