甲型肝炎病毒(L-A-1株)基因型分析

目的 分析甲肝病毒基因型,为确定我国甲肝的分子流行病学及疫苗的安全性和免疫原性奠定基础。方法 采用抗原捕获聚合酶链反应（AC/PCR）,依据国际上甲肝病毒分型标准,扩增VP1/2A结合处的168个核苦酸（nt2909～3264）。结果 经生物信息学软件分析,得出L-A-1株病毒属于甲肝病毒基因IB亚型。结论 在我国有IA和IB两个亚型甲肝病毒流行。

甲型肝炎减毒活疫苗(H_2株)人体免疫学效果观察

从４个观察点筛选出ＡＬＴ正常、抗ＨＡＶ阴性、无禁忌症的４～１８岁易感者５０８名，进行了５个不同批号的甲型肝炎减毒活疫苗（Ｈ２株）人体接种观察。接种疫苗后３天内每日观察接种反应，所有接种者无局部及全身反应。１个月随访期间未见与肝炎有关的副反应。免后８～１２周抗体阳转率为８８．７％～９１．５％，ＧＭＴ为２．７３～４．８８％。３～５周ＨＡＶＩｇＭ阳转率为３．６％～１８．１％。收集了３２名志愿者的大便２０５份，用ＫＭＢ１７细胞分离，阳性９８份，分离率４７．８％。３２人中有３０人排毒，排毒率９３．８％。

甲型肝炎减毒活疫苗(H_2株)的免疫原性研究

本文对国产甲型肝炎减毒活疫苗（Ｈ２株）的免疫原性进行了研究。使用随机分组对照的方法，给１９５名儿童和青年易感者分别接种３种剂量甲型肝炎减毒活疫苗，近期免疫应答效果显著，阳转率分别为７９．５％、９０．４％、９７．５％；几何平均浓度分别为８１．２、１０１．５、２６６．３ｍＩｕ／ｍｌ；免疫应答呈明显的剂量－效应关系。在本研究使用的剂量条件下，年龄因素对抗体应答没有明显的影响。

甲型肝炎减毒活疫苗生产中病毒释放的最佳方法探索

目的 探索甲型肝炎减毒活疫苗 (简称甲肝活疫苗 )生产中感染细胞释放病毒的最佳方法。方法 采用超声波细胞粉碎仪、- 70℃及液氮冻融 3种方法粉碎细胞 ,对细胞破碎情况、病毒抗原滴度和感染性滴度进行了比较。结果 超声波连续粉碎 3次 (90秒 /次 )、- 70℃反复冻融粉碎 4次和液氮冻融粉碎 6次 ,细胞破碎率分别为 94%、82 %和 81% ;病毒抗原滴度和感染性滴度均达高峰 ;抗原滴度均为 1∶2 5 6 ,感染性滴度 (logCCID50 /ml)分别为 8 6 7、6 5和 6 0。继续超声和 -70℃冻融粉碎细胞 ,病毒抗原滴度和感染性滴度基本不变 ,而液氮冻融至第 10次时 ,抗原滴度无明显变化 ,感染性滴度下降2 0logCCID50 /ml。结论 超声波破碎率最高 ,细胞碎片最小 ,病毒充分释放 ,且不损伤病毒 ;- 70℃和液氮冻融破碎率较低 ,细胞碎片较大 ,病毒释放效率低 ,病毒损伤以液氮冻融为重。

HBsAg阳性者接种甲型肝炎减毒活疫苗的反应及免疫效果

通过对HBsAg阳性志愿者接种甲型肝炎减毒活疫苗的抗体应答及其它有关临床反应观察，表明HBsAg阳性者接种甲肝减毒活疫苗后，其局部及全身临床反应与对照组差异无显著意义，肝酶检测2、4、8周（SGPT）与免疫前相对照，未见有意义的改变，但却能同样地产生良好的抗体反应，两组抗体水平相似。证实甲肝减毒活疫苗不仅可对此类易感人群接种，还可提供同样的保护。

离心、超滤技术在甲型肝炎减毒活疫苗生产工艺中的应用

采用离心和超滤技术进行甲型肝炎减毒活疫苗生产 ,达到提高病毒的收获率。将含有甲型肝炎病毒的细胞收获液离心 ,上清进行超滤浓缩 ,回收病毒 ,病毒回收效果好。实验证明 ,该方法适合规模化生产。

树鼩经甲型肝炎减毒活疫苗、乙型肝炎疫苗及联合硫酸乙酰肝素佐剂免疫后的免疫效果评价

目的探讨甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-1)、乙型肝炎疫苗(Hbv)以及HepA-1、Hbv分别与佐剂硫酸乙酰肝素(HS)联合对树鼩进行免疫后树鼩体液免疫应答的影响。方法按照疫苗种类、佐剂以及免疫途径将树鼩随机分组,同时设空白对照组,分别于末次免疫后的4周、8周、12周、16周和20周尾静脉采血,用ELISA法检测树鼩血清中的特异性IgG抗体水平。结果除空白对照组外,实验组均在末次免疫的第四周检测到抗甲型肝炎病毒(HAV)及抗乙型肝炎病毒(HBV)抗体,抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高并于12周达到峰值,此后逐渐下降。同时,联合HS佐剂组的体液免疫效果均优于单纯疫苗免疫组。并且不同抗原以及联合佐剂采用不同的免疫途径免疫树鼩其免疫效果存在显著性差异。结论通过对树鼩进行疫苗免疫原性和增强免疫效果检测,证实以树鼩作为动物模型进行疫苗评价的可行性。

三批甲肝减毒活疫苗的人体接种观察

三批甲型肝炎减毒活疫苗（Ｈ２株）接种２．５～１２岁的１１９６０名易感儿童结果显示，免疫后未发现有局部和全身性的不良反应，也无肝功酶活性异常升高的现象；接种后四周，抗－ＨＡＶ的阳转率为８２％～９２．５％，说明疫苗安全、有效和免疫原性良好。

应用树鼩对硫酸乙酰肝素佐剂的安全性初步评价

目的通过检测佐剂硫酸乙酰肝素(HS)对树鼩皮肤的刺激性反应以及佐剂与甲型肝炎减毒活疫苗(Hep A-1)联合免疫树鼩后主要组织器官的病理分析,探讨以树鼩作为动物模型进行安全性评价的可行性。方法根据给药次数和皮肤是否完整将树鼩随机分组,采用树鼩同体自身左右对比的方法进行皮肤刺激性实验。根据疫苗及佐剂种类将树鼩随机分组,采用皮下免疫方式,免疫后20周取主要组织器官制备病理切片,HE染色,观察主要组织器官病理学特征。结果佐剂HS单次及多次给药对树鼩完整皮肤组和破损皮肤组的受试部位均不产生红斑、水肿等刺激性变化。与对照组相比,HepA-1免疫组以及HepA-1联合HS免疫组的心、肝、脾、肺、肾及大脑组织病理观察,均未见明显异常。结论证实了以树鼩作为动物模型进行疫苗安全性评价的可行性,为以后疫苗及药物评估平台建设提供了基础数据。

甲型肝炎减毒活疫苗及灭活疫苗灌胃免疫小鼠后的抗体应答

目的 :测定甲肝减毒活疫苗及灭活疫苗灌胃免疫小鼠后的抗体应答效应。方法 :将活或灭活的甲肝疫苗加或不加明胶 ,经胃免疫小鼠 ,于末次免疫后 2w取血清及肠液 ,用间接ELISA法分别检测其中的特异性IgG和IgA抗体水平 ,并与空白及肌注组比较。结果 :实验组特异抗体水平明显高于肌注组 (P <0 0 1) ;加明胶组的免疫效果较不加者好 (IgG :P <0 0 0 1,IgA :P <0 0 5 )。结论 :甲肝活疫苗及灭活疫苗经消化道免疫小鼠后 ,均可诱导全身及局部的抗体应答 ;明胶有增强抗体产生的作用 ,可作为一种安全、廉价的粘膜佐剂被进一步开发与利用。

4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响

目的研究4-苯基咪唑(4-PI)+氢氧化铝[Al(OH)_3]复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-1)诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法实验设置7个分组,分别是:阴性对照组(1×PBS),铝佐剂组[HepA-1+Al(OH)_3],疫苗组(HepA-1),M1[HepA-1+Al(OH)_3+4-PI500μg]组,M2[HepA-1+Al(OH)_3+4-PI 1 mg]组,M3[HepA-1+Al(OH)_3+4-PI 1.5 mg]组和M4(HepA-1+4-PI 1mg)组,200μL HepA-1,24μL Al(OH)_3,随机分配小鼠,7只/组,分别皮下注射300μL,接种一次。用间接酶联免疫吸附法测试抗-甲型肝炎病毒(HAV)IgG抗体滴度,检测时间为免疫后4周、8周、12周、16周。实验过程中,观察和记录小鼠的健康情况。结果除阴性对照组,其余各组4个时间点均检测到抗-HAV IgG抗体,12周达到峰值。M2组在整个检测阶段抗体水平最高,显著高于疫苗组(t=4.449、3.633、2.565、6.809,P<0.05)和M4组(t=6.256、4.796、4.153、4.113,P<0.05),且第4周高于铝佐组(t=-2.877,P<0.05);M4组在4个时间点检测到的抗体水平与疫苗组相当。4-PI最佳剂量组是1 mg/只。实验全程观察到小鼠每项生理指标均正常。结论 4-PI+氢氧化铝复合佐剂能增强HepA-1诱导的小鼠体液免疫应答,有望开发成HepA-1新型复合佐剂。

吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂联合铝佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效应分析

目的探讨吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂INCB024360类似物与铝佐剂联合对甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-1)诱导小鼠体液免疫应答的影响,以评价其复合佐剂效应。方法分别将三种不同剂量的INCB024360类似物(150μg,100μg,50μg)与Al(OH)_3(300μg)复合后与HepA-1共同免疫ICR小鼠分别作为复合佐剂1组,2组,3组,同时设空白对照组、单纯疫苗组、铝佐剂对照组和单一INCB024360类似物(100μg)组,共免疫一次,于免疫后4周、8周、12周、16周进行尾静脉采血,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清抗甲型肝炎病毒(HAV)IgG抗体水平。结果除空白对照组外,各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周,均产生抗HAV IgG抗体,抗体水平随免疫时间的延长逐渐升高,于12周达到峰值。复合佐剂2组[HepA-118 EU+Al(OH)_3 300μg+INCB024360类似物100μg]产生的抗体水平最高且持续时间较长,在8周和12周时,其对HepA-1的免疫增强效应显著高于单一佐剂组以及铝佐剂对照组(P<0.05,t值分别为3.169、2.439)。4周、8周、12周、16周,单一佐剂组与单纯疫苗组差异均不具有统计学意义(P>0.05)。结论 IDO抑制剂INCB024360类似物与铝佐剂复合后具有较强的复合佐剂效应,免疫增强效应优于铝佐剂对照组;但是单一的INCB024360类似物不具有显著佐剂效应。

壬二酸佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答效应分析

目的探讨壬二酸作为佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-1)诱导小鼠体液免疫应答的影响,以评价其佐剂效应。方法分别将四种不同剂量的壬二酸(0.5 mg,1 mg,2 mg,3 mg)与HepA-1共同免疫ICR小鼠分别作为佐剂组1、佐剂组2、佐剂组3、佐剂组4,同时设空白对照组、单纯抗原组、铝佐剂组,共免疫1次,于免疫后4周、8周、12周、16周进行尾静脉采血,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清抗甲型肝炎病毒(HAV)IgG抗体水平。结果除空白对照组外,各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周,均产生抗HAVIgG抗体,抗体水平随免疫时间的延长逐渐升高,于8、12周达到峰值。免疫后4周,佐剂组4(壬二酸3 mg)产生的抗甲型肝炎病毒(HAV)IgG抗体水平与铝佐剂组相比较差异有统计学意义(P<0.05,t=2.640)。同时,佐剂组4在免疫后4周、8周和12周产生的抗甲型肝炎病毒(HAV)IgG抗体水平较高,显著高于单纯抗原组(P<0.05,t值分别为3.134、2.751、2.743)。结论适当剂量的壬二酸可快速、显著提高HepA-1诱导小鼠的体液免疫应答,有望成为一种新型的人用疫苗佐剂。

硒化卡拉胶对甲型肝炎减毒活疫苗诱导的小鼠体液免疫应答的影响

目的研究硒化卡拉胶(KSC)对甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-1)诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法随机分成7个组,每组7只ICR小鼠。分组:阴性对照组(生理盐水)、单纯抗原组(18EU HepA-1)、铝佐剂组[Al(OH)_3 0.3 mg+18EU HepA-1]、KSC实验组(KSC 1 mg+18EU HepA-1、KSC 0.5 mg+18EU Hep A-1、KSC 0.25 mg+18EU HepA-1、KSC 0.1 mg+18EU HepA-1),皮下多点免疫注射,注射总体积300μL,免疫1次。免疫注射后及其后4周、8周、12周、16周尾静脉采血,取血清用间接酶联免疫吸附法测定抗-甲型肝炎病毒(HAV)IgG抗体滴度。在实验期间,观察小鼠的健康状况,并于免疫后16周,取KSC最佳剂量组及阴性对照组小鼠肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、心脏组织,制备病理切片,进行对比观察。结果除阴性对照组外,其余各组在各个检测时间点均检测到抗HAVIgG抗体,且存在先升高后降低的趋势,铝佐剂组在12周达到峰值,其余各组在8周达到峰值。KSC0.5 mg组在8周、12周抗体水平高于单纯抗原组(t=3.103,t=2.573,P<0.05),KSC 0.25 mg组在12周抗体水平高于单纯抗原组(t=2.602,P<0.05)。本次实验的最佳剂量为KSC0.5mg。试验期内,观察小鼠各项生理指标未见异常,KSC0.5mg组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织均未观察到病变。结论 KSC能够作为佐剂增强HepA-1诱导的小鼠体液免疫反应。

儿童水痘减毒活疫苗和甲肝减毒活疫苗联合接种免疫原性及安全性的研究

目的 了解水痘减毒活疫苗和甲肝减毒活疫苗联合接种的免疫原性和安全性,为制订水痘疫苗的免疫程序和策略提供科学依据.方法 选择686名18-24月龄儿童分为3组：水痘和甲肝疫苗联合接种组、水痘疫苗接种组和甲肝疫苗接种组,分析免疫前后水痘抗体和（或）甲肝抗体水平和疫苗接种安全性;水痘血清抗体检测采用膜免疫荧光法测定血清中的抗体水平,甲肝血清抗体检测使用酶联免疫竞争法测定.结果 水痘甲肝联合接种组与水痘接种组免疫后水痘抗体阳转率均为100%,抗体几何平均滴度（GMT）分别为33.37和20.00,二者差异有统计学意义（P〈0.001）,水痘甲肝联合接种组与甲肝接种组免疫后甲肝抗体阳转率均为100%,组间免疫前、免疫后甲肝抗体水平差异均无统计学意义（P=0.94,P=0.77）;水痘甲肝联合接种组、水痘接种组、甲肝接种组接种疫苗后不良事件发生率分别为23.63%、19.08%、28.49%,均为发热和红肿,3组之间差异无统计学意义.结论 水痘和甲肝疫苗联合接种的免疫原性和安全性评价不低于两种疫苗单独接种,两者联合接种具有可行性.

H_2株甲肝减毒活疫苗K_7的核苷酸全序列分析

应用ＲＴ－ＰＣＲ获取Ｈ２株甲肝减毒活疫苗（Ｋ７）的ｃＤＮＡ片段，经末端终止测序ＰＣＲ试剂盒和全自动测序仪（ＡＢＩ３７７）作序列测定，用Ｍａｘｔｒｉｇｅｎｅ软件进行计算机分析，Ｋ７疫苗病毒的核苷酸全长含７４４３个碱基．Ｋ７对比其亲代Ｈ２株，减毒的ＨＭ１７５株以及ＨＭ１７５野毒株，同源性分别为９９．７５％，９９．９５％和９９．６１％；彼此间在Ｐ１和Ｐ２连接区１６８个碱基的同源性为９９．４％～１００％，均为ⅠＢ基因亚型．前三者在５’非编码区均有１３１～１３４位和２０３位５个碱基缺失，且结构蛋白基因区序列完全一致．本文用分子病毒学方法证实了Ｋ７疫苗的优异纯毒水平。

鲁甸地震灾区疫苗可预防疾病传播风险评估与群体性预防接种实施分析

目的对鲁甸地震灾区疫苗可预防疾病（Vaccine Preventable Diseases,VPD）进行风险评估,用麻疹-流行性腮腺炎（流腮）-风疹联合减毒活疫苗（Measles,Mumps and Rubella Combined Attenuated Live Vaccine;MMR）和灭活甲型肝炎（甲肝）病毒疫苗（Inactivated Hepatitis A Virus Vaccine,Hep A-I）实施群体性预防接种并进行评估。方法结合历年来VPD流行病学数据和灾区现状,对VPD进行风险评估,对报告和现场调查的接种数据进行分析。结果鲁甸地震灾区流腮、麻疹、甲肝流行风险级别较高;在灾区1-14岁儿童进行MMR和Hep A-I群体性预防接种;应种人数为33 902人,报告MMR实种33 018人,报告接种率为97.39%;报告Hep A-I实种33 047人,接种率为97.48%。对365名应种对象进行调查,其中356名均在本次群体性预防接种中接种了MMR和Hep A-I,快速评估接种率均为97.53%。结论鲁甸地震灾区MMR和Hep A-I群体性预防接种达到预期效果。

中国控制甲型肝炎之前景

展望中国控制甲型肝炎 (甲肝 )之前景 ,考虑与甲肝流行相关的几个问题 :甲肝病毒 (HAV)的致病特点 ;HAV经粪 口途径传播及人群抗体水平状况。控制甲肝流行的有利因素 :HAV的基因结构稳定 ;绝大多数人HAV可归于Ⅰ型 ,株间核苷酸差异 <15 % ,且HAV只有 1个血清型 ,中和抗体可以中和不同基因型的HAV ;中国控制甲肝已取得显著的效果 ,甲肝减毒活疫苗的研究、开发与应用 10余年取得了显著的成就。在理论上甲肝是一种可用疫苗消灭的疾病 ,中国应为此做出贡献。

细胞培养/链特异性RT-PCR方法检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度

目的建立检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度的细胞培养/链特异性逆转录聚合酶链式反应(strand-specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction,strand-specific RT-PCR)方法。方法根据甲型肝炎病毒(HAV)L-A-1株基因组序列,设计5条特异性引物。将甲型肝炎减毒活疫苗原液感染2BS细胞,收获增殖高峰期的HAV,提取RNA,进行2轮链特异性PCR扩增,检测HAV复制过程中的负链RNA,通过Reed-Muench公式计算HAV病毒滴度,并对建立的细胞培养/链特异性RT-PCR法进行特异性及敏感性验证,同时用该方法检测4批冻干甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度,并与《中国药典》三部(2010版)中甲型肝炎减毒活疫苗病毒滴度检测方法(细胞培养时间为28 d/ELISA法)进行比较。结果 HAV负链RNA经2轮扩增获得阳性扩增条带,大小与预期相符。该方法检测HAV复制过程中的负链RNA,特异性、敏感度均较好。两种方法检测的病毒滴度接近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论建立的细胞培养/链特异性RT-PCR方法检测周期短,灵敏度、特异性好,可用于疫苗的滴度检测。

中国部分甲型肝炎病毒流行株结构蛋白区基因特征分析

目的分析中国部分甲型肝炎（甲肝）病毒（Hepatitis A Virus,HAV）流行株结构蛋白VP3-VP1编码区核苷酸及氨基酸序列特点,并比较与甲肝减毒活疫苗（Hepatitis A Attenuated Live Vaccine,Hep A-L）标本序列差别。方法收集39份甲肝病例急性期血清样本及2份市售Hep A-L标本,经核酸提取、逆转录及巢式聚合酶链反应,测得结构-非结构蛋白VP3-VP1-2A编码区序列,进行基因亲缘关系、氨基酸序列同源性等分析。结果检测到的部分HAV流行株序列均为IA亚型,其在结构-非结构蛋白VP3-VP1-2A编码区核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.8%-100%和99.3%-100%,与检测的2份Hep A-L标本的核苷酸和氨基酸序列同源性为90.6%-91.9%和99.1%-99.4%。其中的1条序列在VP3-56位,发生丝氨酸（Serine,Ser）→脯氨酸（Proline,Pro）替代;3条序列在VP1-112位,发生苏氨酸（Threonine,Thr）→异亮氨酸（Isoleucine,Ile）替代,靠近中和抗原位点VP1-114位;所有序列在已发表的中和抗原位点处氨基酸无变化。选择压力分析表明,检测到的部分HAV流行株序列在VP3-VP1编码区处于负向选择。检测的2份Hep A-L标本序列均为IB亚型,在已发表的中和抗原位点处氨基酸无变化。结论HAV的结构蛋白编码区核苷酸序列存在一定差异,但其氨基酸序列相对保守。检测到的3条HAV流行株序列在中和抗原位点附近发生氨基酸替代,值得进一步研究。