经皮穿刺微波凝固联合TACE治疗肝癌

目的探讨经皮穿刺微波凝固治疗（PMCT）联合经导管肝动脉化疗栓塞术（TACE）治疗肝癌的疗效。方法原发性肝癌患者59例，单个肿瘤直径≤5cm，总数不超过3个，随机分为2组：联合组39例，TACE治疗后1～3周内行超声引导下PMCT治疗；PMCT组20例，单纯接受PMCT治疗。结果治疗后，彩超检查结节血流消失率联合组、PMCT组分别为94．9％（37／39）、95．0％（19／20）；联合组、PMCT组分别有34例（87．2％）、16例（80．0％）患者AFP转为正常水平；治疗后随访6～36个月，联合组、PMCT组的1、2、3年生存率分别为97．4％（38／39）、89．7％（35／39）、82．0％（32／39）和90．0％（18／20）、80．0％（16／20）、70．0％（14／20），联合组、PMCT组1、2、3年复发率分别为7．7％（3／39）、20．5％（8／39）、30．8％（12／39）和10．0％（2／20）、30．0％（6／20）、40．0％（8／20）。2组比较，差异均有显著性（P均〈0．05）。发热和疼痛的发生率联合组和PMCT组分别为61．5％（24／39）、60%（12／20）和25．6％（10／39）、30％（5／20）（P均〉0．05）。结论PMCT术前联合TACE治疗可明显提高肿瘤的完全坏死率，获得更为确切的临床疗效，减少术后肿瘤的复发；是一种安全有效的治疗手段。

小鼠肝癌微波消融对宿主Th2/Th1免疫应答的影响

目的探讨小鼠肝癌微波消融(microwaveablation,MA)对宿主Th2/Th1免疫应答的影响。方法建立C57BL/6J小鼠Hepa1-6细胞移植肝癌模型,对肿瘤微波消融或手术切除,取正常、荷瘤、手术后及MA后四组小鼠,每组6只,用ELISA法检测各组周围血血浆Th1(IL-12I、FN-γ)和Th2(IL-4I、L-10)细胞因子水平(pg/ml)。结果荷瘤组比正常组,细胞因子IL-10增加,IL-4I、L-12和IFN-γ下降(均P>0.05)。MA组较荷瘤组,IL-12、IFN-γ显著上升(均P<0.01),IL-4明显降低(P<0.05),IL-10有所下降(P>0.05)。手术组比荷瘤组,IL-12I、FN-γ上升,IL-4I、L-10下降(均P>0.05)。MA组比手术组,IL-12明显上升(P<0.05),IFN-γ升高,IL-4和IL-10下降(均P>0.05)。结论MA原位灭活小鼠肝癌可促进宿主免疫应答的Th2/Th1偏移,并且MA较手术切除具有较强的免疫刺激效应。

小分子差异蛋白在HBV相关性肝病患者血清中的SELDI-TOF-MS筛选

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝病患者血清中小分子差异蛋白在HBV感染后病情发展过程中的意义.方法:采用蛋白芯片及表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface-enhanced laserdesorption/ionization time-of-flight massspectrometry,SELDI-TOF-MS)技术对已用乙腈去除高丰度蛋白的正常对照(NC)、乙型肝炎病毒携带者(ASCs)、慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)及原发性肝细胞癌(HCC)患者术前血清进行检测,筛选各自的血清小分子差异表达蛋白,并分别建立诊断模型.在蛋白数据库expasy寻找相关差异蛋白信息,对差异蛋白峰的可能结构及功能进行评价.结果:与NC组比,ASCs组有63个蛋白质波峰的强度值存在统计学差异(P<0.05),其中29个上调,34个下调;CHB组有57个,其中21个上调,36个下调;LC组有68个,其中33个上调,35个下调;HCC组有74个,其中28个上调,46个下调;通过对比分析,发现在4个病例组表达均为上调的m/z为15889.8,蛋白峰强度值在NC<ASC<CHB<LC组,HCC组较CHB和LC组低;11742.2蛋白峰强度值在NC<ASC<CHB<LC组和NC<ASC<CHB<HCC组,在LC和HCC组最高,用此蛋白峰诊断HBV感染相关性LC的灵敏度和特异度分别为90%和86.67%,诊断HCC的灵敏度和特异度分别为93.33%和83.33%.结论:成功去除高丰度蛋白和应用SELDI-T O F-M S技术筛选H B V感染相关性肝病患者血清中小分子差异蛋白,m/z为8709.7、13759.8、14004.0、15361.89、16072.3、2746.8、3449.1、3941.06、4098.3、9445.5的10个蛋白峰可能与HBV感染有关;m/z为15889.8的蛋白峰可能成为H B V感染后进展为LC早期诊断的标志物,而m/z为11742.2的蛋白峰也许是HBV相关性LC或HCC的一个重要标志.

诱导性大鼠肝癌模型中HIF-1α、VEGF的表达

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)在诱导性大鼠肝癌模型中的表达及其相关性。方法 70只SD大鼠分为模型组(60只)和正常对照组(10只),联合应用二乙基亚硝胺(DEN)和N-亚硝基吗啉(NMOR)诱发大鼠实验性肝癌,于诱癌第4、8、12、16周分批处死实验大鼠,常规制作肝脏病理切片。用免疫组织化学法检测大鼠肝脏癌变过程中不同时期的HIF-1α及VEGF的表达情况。结果实验第8、12、20周,模型组大鼠肝脏呈现典型的脂肪变性,炎性细胞浸润、肝硬化、肝癌的病理变化;肝脏HIF-1α及VEGF在大鼠肝脏癌变过程中表达明显增强(P<0.01);且HIF-1α与VEGF之间存在着显著正相关(r=0.953,P<0.01)。结论 HIF-1α及VEGF参与大鼠肝癌的发生与发展,其机制可能与HIF-1α、VEGF促进肿瘤血管生成有关。

免疫抑制剂西罗莫司对walker-256肿瘤细胞系的抑制作用

目的:探讨肝癌肝移植术后应用西罗莫司的临床意义。方法:体外实验:应用MTT比色法观察西罗莫司对walker-256肿瘤细胞增殖的影响;应用流式细胞仪观察西罗莫司对walker-256肿瘤细胞周期的影响。体内实验:观察西罗莫司对肝癌肝移植术后肝癌复发大鼠模型肿瘤生长情况、肿瘤组织PCNA指数、肿瘤复发率及生存情况的影响。结果:体外试验:MTT比色法示西罗莫司对walker-256肿瘤细胞有抑制作用,IC50为6.36ng/ml;细胞周期检测示西罗莫司组G1/G0期比例为(55.2±0.1)%较对照组(45.2±0.4)%高(P<0.05)。体内实验:西罗莫司组大鼠肿瘤复发率为90%,对照组为95%,两组比较差异无统计学意义;西罗莫司组生存时间为(26.5±2.5)天,对照组为(14.8±2.3)天,两组差异有统计学意义(P<0.05)。西罗莫司组大鼠PCNA指数为(64.1±2.1)%,较对照组(80.8±1.0)%低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:西罗莫司能明显抑制肿瘤生长速度,延长带瘤生存时间。

CTLs相关的免疫疗法在肝癌治疗中的新前景

癌细胞内多种蛋白加工处理所产生的异常多肽通过主要组织相容性复合物Ⅰ类分子递呈,激发肿瘤细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs),从而对肿瘤产生免疫作用.但受多因素影响,肝癌组织中的CTLs功能受抑制或呈无功能状态,影响其抑癌作用.近年来,在肝癌重新活化和增强CTLs功能的研究方面,已取得不同程度的成果.现就其新进展,从强化抗原提呈及直接诱导两条途径,作一综述.

HELQ蛋白在原发性肝细胞性肝癌中表达的临床意义

目的分析HELQ蛋白表达与原发性肝细胞性肝癌临床病理特征和预后的关系。方法收集71例原发性肝细胞性肝癌,应用免疫组化技术检测HELQ蛋白在原发性肝细胞性肝癌中的表达情况。结果 HELQ蛋白在原发性肝细胞性肝癌中的阳性表达率为30.99%,HELQ蛋白阳性表达与原发性肝细胞性肝癌患者的肿瘤大小、卫星灶、肿瘤Edmonson-steiner分级、血清AFP水平、TNM分期有显著相关性,HELQ蛋白阳性表达与原发性肝细胞性肝癌患者的性别、年龄、包膜受侵、门静脉癌栓脉和脉管浸润无显著相关性。结论 HELQ蛋白在原发性肝细胞性肝癌中表达水平下降,HELQ蛋白在原发性肝细胞性肝癌中发挥抑癌基因的作用。

肝癌荷瘤小鼠调节性T细胞数量的改变及其与肿瘤生长的关系

目的研究肝癌荷瘤小鼠调节性T细胞数量的改变及其与肿瘤生长的关系。方法采用小鼠肝癌细胞系H22接种BALB／c小鼠,建立肝癌模型;采用流式细胞术方法检测CD4^＋ CD25^＋T／CD4^＋T细胞的比例;以RT-PCR和流式细胞术检测Foxp3基因的表达。以免疫磁珠分选法纯化CD4^＋CD25^＋T和CD4^＋CD25^-T细胞;在体外,用3H-TdR掺入法检测T细胞的增殖情况;在体内,观察荷瘤小鼠来源的CD4^＋CD25^＋T细胞对肿瘤生长的作用。结果（1）荷瘤小鼠在引流淋巴结中,CD4^＋CD25^＋T细胞占CD4＋T细胞（18．80％±0．06％）比例增高,与对照组（9．50％±0．03％）相比,差异有统计学意义（P〈0．01）;在非引流淋巴结（LN）和脾脏（SP）中,荷瘤小鼠CD4^＋CD25^＋T／CD4^＋T比例分别为16．28％±0．02％和17．28％±0．06％,与对照组9．50％±0．03％和11．08％±0．04％相比,差异有统计学意义（P〈0．01,P〈0．05）;同时,调节性T细胞特异性标志Foxp3 mRNA的表达也升高。在同一只荷瘤小鼠中,引流淋巴结中CD4^＋CD25^＋T细胞数量（18．8％±0．06％）较对侧非引流淋巴结（16．28％±0．02％）略有升高,但差异无统计学意义（P〉0．05）。（2）从荷瘤小鼠中纯化的CD4^＋CD25^＋T细胞,在体外对抗CD3单抗的刺激无反应,但能抑制CD4^＋CD25^-T细胞的增殖。（3）CD4^＋CD25^＋T／CD4＋T比例与肿瘤大小呈正相关,并且可以抑制CD4^＋CD25^-T细胞的抗肿瘤效应。结论肝癌细胞在小鼠体内的生长可以提高调节性T细胞的数量,其数量的高低与肿瘤的大小呈正相关,提示清除调节性T细胞将是肿瘤免疫治疗的策略之一。

N—cadherin、β-连环素在肝癌组织中的表达及与Wnt信号途径的关系

目的观察肝癌（HCC）中N—cadherin分子是否调控β-连环素（β-catenin）的表达及Wnt信号途径的活化。方法免疫组织化学分析64例肝癌组织中N—cadherin及p-catenin的表达及相互关系。调控肝癌细胞株HCCLM3、SMMC-7721中N—cadherin表达并检测β-catenin的表达及Wnt信号途径的活化。结果64例肝癌中，N—cadherin表达缺失34例；β-catenin在细胞膜上表达，无细胞核内聚集，且13例细胞膜表达缺失；细胞膜上β-catenin表达缺失与N—cadherin表达缺失呈正相关（P〈0．05）。下调HCCLM3细胞或上调SMMC-7721细胞中的N—cadherin表达导致细胞膜上β-catenin表达减弱或增强，但均未导致Wnt信号途径的活化。结论在肝癌中，N—cadherin表达与细胞膜上β-catenin的表达水平呈正相关，但N—cadherin分子并不参与Wnt信号途径的调控。

血清MMP9蛋白ELISA检测方法的建立及在肝癌患者血清检测中的初步应用

目的建立基质金属蛋白酶9(MMP9)的双抗体夹心 ELISA 检测方法,探讨血清中MMP9在正常人及肝癌患者中的差异。方法从人肝组织中经过反转录扩增出 MMP9基因721～1 156 bp 区段,插入到原核表达质粒 pQE30中,在大肠埃希菌 M15中诱导蛋白表达。以纯化的融合蛋白 HIS-MMP9为抗原免疫实验用兔及豚鼠,得到的 MMP9抗血清经过纯化后,建立双抗体夹心 ELISA法。对227份正常及193份肝癌患者血清中的 MMP9进行检测。结果 SDS-PAGE 显示所表达的HIS-MMP9融合蛋白相对分子质量约为17 000;以原核表达蛋白为抗原制备的 MMP9抗血清可有效地识别重组 MMP9和中性粒细胞和 HepG2细胞内源性 MMP9蛋白;利用建立的 MMP9 ELISA 检测技术发现肝细胞癌患者血清中 MMP9的含量高于正常人群,差异具有统计学意义,P<0.001。结论建立的双抗体夹心 ELISA 方法可用于血清 MMP9的检测,为建立以 MMP9为检测指标的肝细胞癌患者转移复发筛查方法提供了科学基础。

Janus激酶／信号传导子和转录激活子信号通路重建对MHCC97细胞干扰素α应答的影响

目的阐明原发性肝癌M H C C97细胞中Janus激酶／信号传导子和转录激活子信号通路对干扰素α抗肿瘤增殖作用的影响。方法用Dosper转染干扰素调节因子9(IRF9)表达质粒入MHCC97细胞;用Western blot和寡核苷酸迁移率实验分别检测肝癌细胞中IRF 9、细胞周期调控蛋白和干扰素刺激基因因子3的表达;用四甲基偶氮唑盐和流式细胞术分别检测细胞的增殖水平及各期细胞的分布情况。结果通过高表达1 R F 9因子可恢复M H C C 9 7细胞对干扰素α抗增殖的应答能力,同时阻滞细胞由S期过渡到G 2 期。结论完整的Janus激酶／信号传导子和转录激活子信号通路对介导干扰素α抗肝癌MHCC97细胞的增殖作用至关重要。

干扰素-α对CCL13／HBx细胞生长及侵袭转移潜能的抑制作用

目的观察干扰素-α对恶性转化的CCL13／HBx细胞的生长和侵袭转移潜能的抑制效应。方法采脂质体法将pcDNA3．1-HBx质粒转入CCL13细胞，将CCL13／HBx细胞分别在普通条件下培养或与干扰素-α共培养，采用绘制生长曲线、平板集落形成实验、划痕愈合实验、体外侵袭力、体内裸鼠成瘤实验分别检测CCL13／HBx、INF—α-CCL13／HBx、CCL13／pcDNA3．1细胞在体内、体外的生长及运动迁移能力的差异。结果pcDNA3．1-HBx质粒转染CCL13细胞后在该细胞中稳定表达，CCL13／HBx细胞生长明显快于INF—α—CCL13／HBx和CCL13／pcDNA3．1细胞，克隆生成率明显增高（31．2％比10．8％比12．4％，P〈0．05），划痕愈合能力明显增强，穿过人工基底膜的细胞数明显增多[（41．6±3．1）／HP比（7．4±1．2）／HP比（9．2±1．6）／HP，P〈0．05]。干扰素-α治疗组CCL13／HBx细胞裸鼠皮下成瘤体积减小[（2．4±0．2）cm^3比（4．2±0．3）cm^3，P〈0．05]。结论CCL13／HBx细胞较CCL13／pcDNA3．1细胞具有更强的生长和侵袭转移潜能，干扰素-α能明显抑制HBx蛋白所诱导的细胞恶性表型。

巨噬细胞移动抑制因子小干扰RNA对肝癌细胞表达血管内皮生长因子的抑制效应

目的观察巨噬细胞移动抑制因子（MIF）小干扰RNA（siRNA）对肝癌细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法Western blot检测MIF和VEGF在肝癌和癌旁组织的表达情况；人工化学合成MIFsiRNA和对照siRNA，将其转染PLC、HepG2肝癌细胞株，定量聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测MIF和VEGFmRNA及其蛋白的表达。结果MIF、VEGFmRNA和蛋白在肝癌组织中高表达。MIFsiRNA（50、100nmol／L）转染肝癌细胞株后，PLC细胞MIF和VEGFmRNA水平分别下调（78．8±7．2）％、（90．4±2．9）％和（60．6±2．6）％、（79．8±1．2）％；HepG2细胞MIF和VEGFmRNA水平分别下调（74．3±8．9）％、（88．4±4．6）％和（65．6±4．6）％、（80．7±2．2）％。MIF蛋白分别下调（57．3±3．4）％、（78．7±1．2）％和（54．8±6．8）％、（77．9±2．3）％，并呈剂量依赖关系；伴随MIFmRNA和蛋白的表达下调VEGF蛋白分别下调（52．6±12．9）％、（87．4±2．3）％和（52．4±11．1）％、（68．5±2．8）％，亦呈剂量依赖关系，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01），两干预组间的差异也有统计学意义（P〈0．05）。结论MIFsiRNA能特异性阻断PLC及HepG2细胞MIFmRNA和MIF蛋白的表达，并且同时有效下调VEGFmRNA及其蛋白的表达，MIF可能通过调控VEGF基因和蛋白的表达，参与肿瘤血管的生成和促进肿瘤细胞的转移。

CT强化小结节在肝癌高发人群中的随访结果分析

目的在肝癌高发人群中对CT动脉增强期所发现的小结节（5—10mm）（SAENs）进行随访观察，以确定肝细胞癌（HCC）发生率和危险因素。方法研究对象包括112例患者（男：女=100：12；年龄36—92岁），通过最初的CT检查中共发现175个SAENs。在随访期间（1．4—41．8个月，平均35．7个月）对CT检查结果进行观察分析，以最终阐明结节为肝癌的危险因素和比例。结果随访期间的175结节中，有101（57．7％）消失，34个（19．4％）持续存在，40个（22．9％）结节最终确诊为肝癌（33例患者）。其中患者有肝癌治疗史（P=0．005，风险比=7．429），较大尺寸的SAEN（P=0．003，风险比=1．630），肝内有同时发现的HCC（P=0．021，风险比=3．777）和缺乏共存的典型的动静脉分流（P=0．003，风险比=4．459）是在CT影响学上肝内结节可能为HCC的风险因素。结论在肝癌高发人群中经常能发现SAEN，其中有22．9％的硬结节有可能为肝癌，特别是当有下列因素存在包括合并有肝癌病史，有同时存在的肝癌、结节较大以及没有发现共存的典型动静脉分流时，肝癌发生率会明显升高。

影响肝细胞癌根治性切除术后预后因素的Cox模型分析

目的探讨影响肝细胞癌根治性切除术后预后的相关因素，为肝细胞癌的术后综合治疗及判断预后提供依据。方法回顾性分析194例肝细胞癌的临床病理资料，对潜在的可能影响术后预后的临床病理因素进行单因素分析，将单因素分析后有统计学意义的因素带人Cox比例风险回归模型进行多因素分析。结果全组患者的术后1、3、5年的累积生存率分别为81．4％、50．6％、33．9％。单因素分析结果显示：术前AST、ALP、GGT、肿瘤最大直径、肿瘤病灶数目、手术持续时间、手术中总失血量、手术中输血情况、术后2年内复发是有统计学意义的因素。Cox模型多因素分析结果示术后2年内复发、术前AST浓度是有统计学意义的因素。结论HCC根治性切除术后的预后取决于多种因素的共同作用，术后2年内复发、术前AST浓度是影响术后预后的最重要因素。

抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高特异性和高亲和力的抗人肝细胞肝癌（HCC）的单克隆抗体（MAb）,为肝癌的靶向诊断及治疗提供依据.方法 用人肝细胞肝癌细胞株HepG-2经＂尾静脉.脾脏联合方法＂免疫BALB/c小鼠.取其脾脏细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合,经ABC免疫组化初筛抗体、有限稀释法亚克隆化、染色体分析、免疫组化鉴定抗体特异性、共聚焦显微镜扫描技术（LSCM）进行组织定位、ELISA分析鉴定抗体的亚型及荷人肝癌裸鼠牛物分布等进一步鉴定其生物学特性.结果 （1）获得一株分泌抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的杂交瘤;该抗体与肝癌组织结合的特异性高达98.5%（67/68）;（2）注射131I-MAb后瘤部位放射性分布有逐渐增加的趋势,血液、肝脏、肾脏和肺脏放射性有逐渐减低的趋势,72 h肿瘤/血液和肿瘤,肝脏比值分别为15.76±3.28和7.23±1.70.结论 成功制备抗人肝细胞肝癌的单克隆抗体,具有较好的肝癌特异性、靶向性,对原发性肝癌有潜在的诊断及治疗作用.