基于转录组测序技术挖掘游泳运动抗肝细胞癌作用的潜在干预机制

目的基于转录组测序技术挖掘游泳运动对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)裸鼠肿瘤生长发挥抑制作用的潜在机制。方法将12只4周龄BALB/C雄性裸鼠随机区组分为运动组、对照组,每组各6只。运动组裸鼠游泳适应1周后与对照组均进行皮下瘤接种,之后运动组裸鼠进行游泳训练(0%体重负荷,30 min/d,每周5天,连续4周)。训练结束后处死裸鼠收集血清并测量瘤重,同时使用细胞计数试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)试验验证游泳运动血清对于HCC细胞增殖的抑制能力,并进一步运用转录组测序探究游泳运动干预HCC的潜在机制。结果运动组裸鼠瘤重较对照组显著下降[(0.136±0.020)g vs.(0.290±0.099)g,t=26.000,P<0.05];CCK-8试验结果显示,运动组36 h[(0.418±0.001)g vs.(0.431±0.002)g,t=6.000,P<0.05]以及72 h[(0.402±0.019)g vs.(0.452±0.022)g,t=2.955,P<0.05]的细胞光密度(optical density,OD)值较对照组均显著降低。转录组测序分析结果显示,运动组与对照组相比,测序共筛选差异基因1263个,与HCC靶标基因交集后共获得89个交集靶标基因。蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析结果显示,信号转导与转录激活因子1(signal transducerand activator of transcription 1,STAT1)、抗原加工相关转运物1(transporters associated with antigen processing 1,TAP1)、多功能肽酶(recombinant proteasome subunit beta type 9,PSMB9)、人类白细胞抗原B(human leukocyte antigen B,HLA-B)、干扰素调节因子1(interferon regulatory factor 1,IRF1)以及β2-微球蛋白(beta-2 microglobulin,β2M)等基因各算法得分靠前。基因本体(gene ontology,GO)富集分析结果显示,下调基因的GO条目共20个,上调条目共13个,其中“negative regulation of canonical Wnt signaling pathway”等条目与肿瘤密切相关。京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析结果显示,下调基因的KEGG条目共11个,其中“TNF signaling pathway”“IL-17 signaling pathway”等条目与肿瘤密切相关。基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)结果显示,与肿瘤相关条目有“Prostate cancer”“Pathways in cancer”“Leukocyte transendothelial migration”等。结论游泳运动可以抑制HCC模型裸鼠的肿瘤生长,且其干预调控机制可能是多途径的,Wnt信号通路,肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)信号通路与磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路等均可能是其潜在的干预机制。

Wnt/β-catenin信号因子在HepG2以及L02细胞中的表达

目的:比较Wnt/β-catenin信号分子在HepG2和L02细胞中的表达,探讨Wnt/β-catenin信号转导通路在肝癌发生中的作用机制,为肝癌的防治提供新的思路。方法:选取Wnt/β-catenin信号转导通路中上下游关键因子Wnt1、Wnt4、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等,应用RT-PCR的方法观察他们在正常肝脏L02细胞和肝癌HepG2细胞中的转录水平。用免疫细胞化学染色方法和Western blot检测研究Wnt/β-catenin信号转导通路中最关键的成员β-catenin在上述2个细胞株中的定位和定量表达。结果:在正常的L02肝细胞中,用RT-PCR的方法未检测到Wnt1、Wnt4、cyclin D1以及c-myc的mRNA转录,只有β-catenin的基因被转录表达。同时用免疫细胞化学染色观察到β-catenin在L02细胞膜处存在表达。而在HepG2肿瘤细胞中,不仅检测到β-catenin的基因转录,同时也检测到Wnt1、cyclin D1以及c-myc的mRNA转录,只有Wnt4未转录。用免疫细胞化学的方法观察β-catenin在肿瘤细胞中的表达明显增强,表现为胞膜着色减弱而胞质甚至是胞核的阳性染色。采用Western blot检测也验证了β-catenin蛋白在肿瘤细胞中的表达水平明显高于正常细胞。结论:Wnt/β-catenin信号转导通路在人的肝癌细胞HepG2中存在异常活性,Wnt1可能是导致信号通路激活的始动因素之一。

茶多酚在树肝癌形成中的化学预防作用

目的 探讨茶多酚对黄曲霉素B1(AFB1)和乙型肝炎病毒(HBV)诱发树肝细胞癌作用的影响。方法 成年树分成三组:A组(AFB1+HBV+茶多酚组)、B组(AFB1+HBV组)和C组(空白对照组),实验期间定期抽血检查HBV感染标志和进行剖腹手术取肝组织活检,观察各组肝癌发生率、肝癌出现时间、HBV感染持续时间,并采用免疫组化方法检测肝癌形成过程中p53、bcl- 2、bax、survivin、GSTA1、SOD1、IL -2和SCF等蛋白在各组各时段的表达情况。结果 在实验第90、105、120、135、150、165周各个时段中,A组的肝癌发生率均低于B组;A组首例肝癌出现时间及肝癌平均出现时间均晚于B组;A组HBV感染标志(HBsAg,HBeAg和HBcAb)的平均持续时间短于B组;在诱癌中期(实验第60 周)及肝癌组织内突变型p53、凋亡抑制基因bcl -2和survivin蛋白的表达率均为A组低于B组。但上述差异在统计学上大部分无显著性。结论 茶多酚对黄曲霉毒素B1和HBV诱发树肝癌有一定程度的保护作用;可以促进树体内的HBV感染标志的消除。茶多酚可能是通过促进终致癌物的解毒、抗氧化作用、提高免疫功能、诱导肿瘤细胞凋亡等途径起到预防树肝癌的作用。

GP73、AFP-L3、TIP30联合检测对乙型肝炎源性肝癌肝硬化的诊断价值

目的探究血清高尔基体蛋白73(GP73)、甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)、Tat结合蛋白30(TIP30)联合检测对乙型肝炎源性肝癌、肝硬化的诊断价值。方法收集乙型肝炎病毒携带患者血清标本150份,其中慢性乙型肝炎患者50例、肝硬化患者50例、原发性肝癌患者50例,及另外健康对照者血清标本40份。用酶联免疫分析定量检测各组人群血清GP73、TIP30水平,微量离心柱分离AFP-L3,电化学发光法测定血清总AFP和分离洗脱液中AFP-L3水平,并计算AFP-L3/AFP比例。结果随着慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌的进程,GP73、AFP-L3水平呈现上升趋势,而TIP30呈下降趋势。GP73、AFP-L3、TIP30对乙型肝炎源性肝硬化的诊断临界值分别为0.72IU/mL、9.81%、6.89ng/mL,单项TIP30诊断乙型肝炎源性肝硬化的灵敏度、特异度和曲线下面积最高,分别为70.00%(35/50)、67.78%(61/90)和0.747;联合检测GP73、AFP-L3、TIP30诊断乙型肝炎源性肝硬化的灵敏度、特异度及曲线下面积为80.00%(40/50)、75.55%(68/90)和0.767。肝癌组与对照组、肝炎组、肝硬化组血清GP73、AFP-L3、TIP30水平比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。GP73、AFP-L3、TIP30对乙型肝炎源性肝癌的诊断临界值分别为1.13IU/mL、12.40%、3.50ng/mL;单项TIP30诊断乙型肝炎源性肝癌灵敏度、特异度和曲线下面积最高,分别为70.00%(35/50)、77.14%(108/140)和0.936;联合检测GP73、AFP-L3、TIP30诊断乙型肝炎源性肝癌灵敏度、特异度及曲线下面积为92.00%(45/50)、91.43%(128/140)和0.977。结论单独检测TIP30对乙型肝炎源性肝硬化和肝癌的诊断价值较高,GP73、AFP-L3、TIP30联合检测可提高诊断价值,用于乙型肝炎源性肝硬化、肝癌辅助检测。

miR-146a G>C基因多态性与中国原发性肝癌患者遗传易感性的Meta分析

目的:对国内外公开发表的中国原发性肝癌与miR-146a G>C(rs2910164)遗传易感性的相关文献进行Meta分析。方法:检索Pub Med数据库、Cochrane Library数据库、中国学术期刊全文数据库(CNKI)和万方数据库获得文献。检索时限为自建库至2017年3月。采用Stata 12.0软件进行Meta分析,计算各基因型的合并比值比(OR)及95%置信区间(CI)。结果:共纳入9篇病例对照研究,累计病例组3 937例,健康对照组5 025例,研究间存在中等强度的异质性。固定效应的合并OR值及95%CI在显性模型[(GG+GC)/CC]和隐性模型[GG/(GC+CC)]分别为1.26(1.12,1.41)(P=0.00)和1.23(1.12,1.34)(P=0.00),随机效应等位模型(G/C)为1.17(1.10,1.25)(P=0.00)。Meta回归分析发现显性模型样本的地域来源与合并OR值正相关。亚组分析表明,在中东人群和西部人群及采用PCR-RFLP分型时,miR-146a G>C与原发性肝癌的遗传易感性密切相关;而在西南人群和采用非PCR-RFLP(Non-PCR-RFLP)分型时无明显相关性。三个基因型的敏感性分析结果稳定,也没有发表偏倚。结论:miR-146a G>C与原发性肝癌的遗传易感性密切相关,携带G等位的个体有更高的发病风险,该位点基因多态性具有成为原发性肝癌的生物标记物的潜能。

原发性肝细胞肝癌的家族聚集性研究——附8个家系34例患者的临床分析和家系调查

目的总结原发性肝细胞肝癌（primary hepatocellular carcinomas, PHC）的家族聚集现象和家族性PHC的临床特点。方法回顾性分析了34例家族性PHC的临床表现，并进行了家系调查。结果34例PHC患者分布在8个家系中，平均4．25例（3．9例）；患者发病年龄平均41．3岁（32-62岁），肝炎病毒感染率94．1％（32／34），肝炎或肝硬化率61.8％（21／34）．AFP阳性率82．4％（28／34），就诊时TNM分期Ⅱ期2例，Ⅲ期23例，Ⅳ期9例；生存时间1-25月，平均7．3月。结论通过家族史明确高危人群、有重点地定期检查，提高治疗效果，为目前切实可行的PHC防治策略和思路。

缺氧诱导因子-1分子组成、活化机制及肝癌靶向治疗

肝癌是世界常见恶性肿瘤之一,其发生是多中心,多病因和多基因参与的复合过程.其目前的治疗仍以手术切除为主,而肝癌确诊时大多已属中晚期,治疗效果很差.因此开发新的分子标志物早期诊断肝癌和寻找新的基因治疗靶点成为肝癌研究的热点.缺氧诱导因子-1(HIF-1)参与肝癌发生、发展、转移及术后复发的多个环节,对肝癌的早期诊断和分子靶向治疗具有潜在的应用前景.本文就HIF-1的分子组成、活化机制以及与肝癌靶向治疗相关进展作一综述.

肝脏影像报告及数据系统2017版(LI-RADS~ v2017)解读

肝脏影像报告及数据系统(LI-RADS)是针对肝细胞肝癌(HCC)高危人群制定的影像检查规范。2011年由美国放射学会(ACR)发布第1版,对HCC高危人群肝脏CT/MR检查中影像异常发现的分类进行规定,并对数据采集做出明确规范。第1版LI-RADS发布后医学影像界对此广泛开展验证研究,基于这些研究反馈,2013年、2014年ACR先后2次发布LI-RADS的修订版。2017年7月发布目前最新的修订版本——LI-RADS~v2017,其中加入新的诊断思路并规定了新的LI-RADS分类,定义和修改了多项征象识别标准,使其更为合理,实用性更强。本文对LI-RADS~v2017的CT/MR更新内容进行解读。

甲胎球蛋白/肿瘤体积比对原发性肝癌根治术后患者复发的临床评估

目的研究甲胎球蛋白（AFP）／肿瘤体积比在评估原发性肝癌根治切除术后复发中的临床作用。方法回顾分析广西医科大学第四附属医院2006年1月-2011年12月行原发性肝癌根治术后复发的临床分期相同的30例患者的临床资料，根据临床随访复发的时间进行分组，其中半年内复发组（A组）18例，半年后复发组（B组）12例。比较两组间患者的术前AFP值、术前肿瘤体积、AFP／肿瘤体积比以及术后组织病理分化程度对原发性肝癌根治切除术后复发的影响，分析AFP／肿瘤体积与患者术后复发的关系。结果A、B两组术前肿瘤体积分别为（48．90±35．92）、（37．25±20．29）mL，两者比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；A组术前AFP值为（140．06±106．22）ng／mL，明显比B组[（83．21±33．29）ng／mL]高，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；A组术后组织的病理分化程度为：高分化3例，中分化8例，低分化例7例，B组为：高分化7例，中分化3例，低分化2例，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．05），A组的AFP／肿瘤体积比均值为（3．51±1．39），明显比B组（2．47±0．91）高，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。相关分析表明，AFP／肿瘤体积与原发性肝癌根治术后复发存在显著相关性（r=0．574，P=0．021），AFP／肿瘤体积比值越大原发性肝癌根治切除术后半年内复发的可能性越大。结论AFP／肿瘤体积比可以作为原发性肝癌根治切除术后复发的临床评估指标，当AFP／肿瘤体积比大于3．5时原发性肝癌根治切除术后患者半年内复发的可能性比较大。

甲胎蛋白:治疗肝癌的新靶点

甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)在肝癌发生过程中所起的生物学作用一直是个谜。由于其是肝癌细胞高特异性表达的蛋白质,临床上作为诊断肝癌的金标准,但是AFP在肝癌发生过程有何功能并不清楚。最近我们的研究发现,AFP具有信息调控分子样作用,AFP不仅能与维甲酸受体-β(RAR-β)结合,阻遏RAR-β进入细胞核内调节靶基因的表达,同时也能抑制Caspase-3的活性,阻断凋亡信号的传递,更重要的是AFP激活PI3/AKT等生长信号途径,提示AFP具有抗凋亡诱导的功能,靶向抑制AFP表达能增加肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和全反式维甲酸(ATRA)的敏感性,新发现AFP的这些功能,预示它是肝癌细胞耐药的新靶点,为肝癌的生物治疗提供新的思路和策略。

高迁移率蛋白B1对肝细胞癌血管生成的影响

目的探讨高迁移率蛋白B1(HMGB1)在人肝细胞癌组织中的表达及其与血管生成的关系。方法选择30例肝细胞癌,运用免疫组织化学方法检测HMGB1和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并测定微血管密度,进行统计学相关性分析。结果 HMGB1和VEGF在肝细胞癌中呈强弱不等的表达,总阳性率分别为20/30(66.7%)和23/30(76.7%),高于癌旁组织及正常对照组织(P<0.05),并且HMGB1与VEGF的表达具有相关性(r=0.408,P<0.05)。HMGB1与肝细胞癌微血管密度正相关(r=0.529,P=0.008);当HMGB1阳性细胞数<25%时,微血管密度无明显增加;当阳性细胞数>25%时,癌组织微血管密度增加。结论在肝细胞癌中,HMGB1与VEGF表达上调有关,与肝细胞癌血管生成相关,HMGB1可能参与了肿瘤血管生成。

异常凝血酶DCP基因克隆表达、纯化及单克隆抗体制备与鉴定

目的:通过克隆、表达一种有前景的肝癌肿瘤标志物人去羟基凝血素(Des--carboxy prothrombin,DCP),制备抗DCP单克隆抗体并初步鉴定其特性.方法:依据DCP基因序列,合成DCP全长基因,构建原核表达载体pColdⅡ-DCP,转化至Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,以Ni2+亲和层析柱纯化带有His标签的DCP蛋白.纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠,制备抗DCP单克隆抗体.以ELISA法检测抗体效价与亚型;Western blot和免疫组织化学染色鉴定抗体特异性.结果:成功表达并获得DCP蛋白,其相对分子量约为23000;获得1株稳定分泌抗人DCP单克隆抗体杂交瘤细胞株3B5;Western blot和免疫组织化学结果显示抗人DCP单克隆抗体能与DCP发生特异性结合,且ELISA检测抗体的效价为1∶2.43×105,其亚类为IgG2a.结论:成功制备了抗人DCP单克隆抗体,为进一步将该抗体应用于肝癌的早期诊断提供了重要工具.

Cripto-1基因沉默对人肝癌MHCC-97H细胞侵袭、迁移能力的影响

目的:探讨Cripto-1蛋白在人肝癌组织和肝癌细胞系中的表达,研究沉默Cripto-1基因后对肝癌细胞MHCC-97H侵袭和迁移能力的影响及可能的机制。方法:采用Western blot检测11对肝癌组织及相应的癌旁组织和不同肝癌细胞株中Cripto-1蛋白的表达;收集80例肝癌石蜡标本,免疫组织化学方法检测Cripto-1蛋白的表达情况;Cripto-1 siRNA转染肝癌细胞MHCC-97H细胞后,real-time PCR和Western blot分别检测转染效率;Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞的迁移和侵袭能力;Western blot分别检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白的表达。结果:Western blot检测结果显示肝癌组织中Cripto-1蛋白的表达明显高于对应的癌旁组织,Cripto-1蛋白在各肝癌细胞系中均有表达,且表达量高于对照细胞,其中高侵袭性肝癌细胞MHCC-97H表达量最高;免疫组织化学结果显示Cripto-1蛋白在88.7%的肝癌组织中表达;Cripto-1 siRNA转染MHCC-97H细胞后能显著降低Cripto-1mRNA和蛋白的表达水平,并且能降低其侵袭和迁移能力;Western blot结果表明,Cripto-1基因沉默后能抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达。结论:Cripto-1在肝细胞癌中的高表达可能与肝癌的发生发展密切相关,下调Cripto-1的表达可以抑制肝癌细胞侵袭和迁移能力,其机制可能与下调MMP-2、MMP-9的表达有关。

整合素α6在肝细胞癌黏附过程中诱导PI3K及MAPK双信号传导通路

目的:探讨肝细胞癌与细胞外基质发生黏附过程中所引起的信号转导通路的变化.方法:LN作为细胞外基质,BSA作为对照基质,常规培养人肝细胞癌细胞系BEL-7402细胞;以整合素α6单抗作用后检测细胞黏附于LN之后的变化以及所诱导的信号传导通路.Boyden小室检测细胞迁移及侵袭能力;Western blot分析检测细胞ERK磷酸化,RT-PCR方法检测PI3K及Akt基因mRNA表达的变化.结果:细胞在不同基质上发生黏附的时间为30min-1h,但没有明显差异.细胞在LN基质上的黏附率为187.2%,而以整合素α6抗体作用后黏附率为104.4%,细胞黏附率明显下降(P<0.05).BEL-7402细胞穿过Matrigel发生侵袭的细胞数分别为每高倍视野103.2±16.5个,抗整合素α6单抗10mg/L作用后为88.7±9.9个,有显著性差异(P<0.01);BEL-7402细胞PI3K及Akt的表达在黏附于细胞外基质后明显增加,而且ERK磷酸化明显增加,整合素α6抗体可以部分降低表达及磷酸化.结论:细胞在黏附过程中有PI3K及ERK两条传导信号分子参与,并与整合素α6及LN相关.

黑色素瘤抗原MAGE-B亚家族基因在肝细胞癌中的表达

目的 检测黑色素瘤抗原MAGE B基因 (MAGE B1,MAGE B2 )在肝细胞癌 (HCC)中的表达 ,以期找到可用于HCC免疫治疗的新靶位。方法 用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测MAGE B1、B2、A1和A3在 47例HCC患者癌组织和相应癌旁组织、3 0例肝硬化和正常肝组织中的表达 ,随机选择 4例RT PCR阳性扩增产物直接进行DNA序列测定 ,并将其表达结果与临床指标之间的关系进行分析。结果 47例HCC组织中 ,MAGE B1和MAGE B2基因阳性率分别为 44.7% (2 1/47)和61.7% (2 9/47) ,而相应癌旁组织、肝硬化组织和正常肝组织中均为阴性。测序结果证实 ,RT PCR产物确为这两种基因。MAGE A1和MAGE A3的阳性率分别为 74.5% (3 5/47)和 44.7% (2 1/47)。MAGE B和MAGE A的表达之间有显著相关性 (P <0 .0 5) ,但其中 12例不表达MAGE A1和 (或 )A3的病例中 ,有 5例表达MAGE B1和 (或 )B2。同时检测这 4种基因的表达 ,发现至少表达其中 1种、2种、3种和4种均表达者分别为 83 .0 % (3 9/47)、55.3 % (2 6/47)、48.9% (2 3 /47)和 3 8.3 % (18/47)。MAGE B基因的表达与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、血清甲胎球蛋白 (AFP)水平、HBV和HCV感染之间无显著相关性 (P >0 .0 5)。结论 MAGE B基因家族在HCC中呈相对高比例、高特异表达 。

黑色素瘤抗原基因在肝癌细胞系中的表达

目的 研究黑色素瘤抗原 (MAGE)基因在肝癌 (HCC)细胞系中的表达 ,为应用MAGE抗原肽作为疫苗治疗肝癌的体外实验筛选靶细胞。方法 分别用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)和免疫组织化学方法对MAGE 1和MAGE 3mRNA及MAGE 1蛋白在 8种HCC细胞系中的表达进行检测 ,用微量淋巴细胞毒法测定HCC细胞系的主要组织相容性复合物 (MHC)Ⅰ类分子的表达。结果 6种HCC细胞系MAGE 1基因mRNA阳性表达 ,2种MAGE 3阳性 ;有 5种细胞系MAGE 1基因蛋白阳性。BEL740 5HLA A2 4阳性 ,HLE和HpG2HLA A2阳性。 结论 MAGE基因在HCC细胞系中有较高的表达率 ,HLE和BEL740 5可作为阳性靶细胞 ,其他细胞系可作为相应的对照细胞 ,应用于用MAGE抗原肽疫苗治疗HCC的体外实验研究中。

Gd＋-EOB-DTPA与Gd＋-DTPA增强磁共振检查肝细胞癌的对照研究

目的 比较研究Gd＋-EOB-DTPA与Gd＋-DTPA两种增强磁共振对比剂对肝细胞癌检查的准确性.方法 21例肝细胞癌患者术前分别进行Gd＋-EOB-DTPA与Gd＋-DTPA两种增强磁共振检查,以病灶显示质量指数、病灶诊断敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、诊断准确率及对比噪声比为指标进行评价,重点比较两种对比剂的差异性.结果 21例肝细胞癌患者共25个病灶,其中＜1.0cm病灶9个.Gd＋-EOB-DTPA增强磁共振检查肝胆特异期呈低信号有24个病灶,仅1个病灶呈等信号.Gd＋-DTPA增强磁共振检查门脉期呈低信号病灶15个、等高信号5个、高信号5个.Gd＋-EOB-DTPA及Gd＋-DTPA增强磁共振检查对于肝细胞癌（特别是＜1.0cm）的病灶显示质量指数,病灶诊断敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、诊断正确率分别为17分、89％、89％、89％、89％及12分、33％、33％、33％、67％,肝胆特异期的对比噪声比为：639.35,Gd＋-DTPA动脉期及门脉期对比噪声比分别为：225.25及93.25,Gd＋-EOB-DTPA均优于Gd＋-DTPA增强磁共振检查.结论 采用Gd＋-EOB-DTPA对比剂能较Gd＋-DTPA对比剂更好地显示肝小病灶,可明显提高微小肝细胞癌（＜1.0 cm）诊断正确率.