骨质疏松模型体内铁调素(Hepcidin)基因表达的相关研究

目的观察维甲酸制作的大鼠骨质疏松模型中,肝脏内铁调素(Hepcidin)基因在不同时间表达变化,探讨其与骨质疏松形成的相关性。方法取80只SD大鼠,分成实验组和对照组。实验组用维甲酸(70mg/kg.d)每天灌胃,14d后形成骨质疏松模型;在实验组中采用RT-PCR方法分别观察灌胃第1、3、5、8、9、10、12、14d肝脏铁调素基因表达变化;在第14d还检测大鼠骨密度、分析脱钙骨切片、观察肝组织切片。结果与对照组相比,实验组大鼠肝脏铁调素基因表达在维甲酸灌胃的不同时间组存在明显不同:早期铁调素相对表达量逐渐下降,在第8、9d达到最低值,随后有回升。另外,维甲酸灌胃第14d的骨密度比灌胃前明显降低、骨切片中骨小梁稀松皮质骨变薄;维甲酸灌胃第14d的肝组织切片与对照组比较差异无显著性。结论①本研究骨质疏松模型采用人工干预方法,没有其他影响因素。实验结束时大鼠骨密度、骨组织学检查表明骨质疏松形成;因此,同期不同时间组大鼠体内铁调素基因表达可以代表体内铁代谢不同时间的变化。②在本研究中实验组与对照组研究结果的差异表明:铁调素基因RT-PCR变化与维甲酸制作的大鼠骨质疏松模型形成有实验相关性。

饲料中维生素D_3水平对黄鳝抗菌肽hepcidin基因表达的影响

本试验旨在探索饲料中维生素D3水平对黄鳝(Monopterus albus)抗菌肽hepcidin基因表达的影响。挑选体质健康、平均体重为(21.7±2.1)g的黄鳝360尾,随机分为6组,每组2个重复,每个重复30尾。6组黄鳝分别饲喂在基础饲料(0 IU/kg维生素D3)中添加0、250、500、1 000、2 000和4 000 IU/kg维生素D3的试验饲料。于投喂试验饲料后20、40和60 d,从各组随机选择6尾黄鳝,分别采集其肝胰脏、脾脏、头肾和后肠组织,采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测样品中hepcidin基因表达量。结果表明:投喂20、40和60 d后,黄鳝4种组织中均有hepcidin基因表达,并且肝胰脏中显著高于脾脏、头肾和后肠中(P<0.05);随维生素D3添加水平的增加,黄鳝hepcidin基因在4种组织的表达量同一时间点均呈现出先升高后降低的趋势;第20天时4种组织中的表达量均以2 000 IU/kg组为最高,显著高于其他各组(P<0.05);第40和60天时肝胰脏、头肾中的表达量均以500 IU/kg组为最高,其中第40天时显著高于0、250、4 000 IU/kg组(P<0.05),第60天时显著高于其他各组(P<0.05)。结果提示,短期(20 d)内在饲料中添加2 000 IU/kg的维生素D3可显著提高黄鳝内脏组织中hepcidin基因的表达量;饲喂周期较长(40或60 d)时,饲料中添加500 IU/kg维生素D3可显著提高hepcidin基因在黄鳝肝胰脏和头肾中的表达量。

尼罗罗非鱼Hepcidin基因结构与序列分析

Hepcidins是一类具有调节铁代谢功能的抗菌肽.利用RT-PCR、RACE和LA等技术,以尼罗罗非鱼[Oreochro-mis niloticus(Linnaens)]肝脏中分离和克隆到Hepcidin基因.其全长cDNA为505 bp(不包括polyA),5′端非翻译区有85 bp,3′非编码区为156 bp,阅读框为264 bp.其编码的氨基酸包括信号肽和前体肽等,前体肽进一步酶解产生22个氨基酸的活性肽,该活性肽具有Hepcidin基因家族特有8个半胱氨酸的保守序列.罗非鱼的Hepcidin基因结构包含3个外显子和2个内含子.本研究为今后阐明Hepcidin基因表达特性、表达产物理化性质、抗菌活性及其相关功能等奠定基础.

黄鳝抗菌肽hepcidin基因cDNA的克隆及表达分析

根据已知鱼类抗菌肽hepcidin的同源性设计简并引物,利用同源克隆结合RACE法从黄鳝(Monopterus albus)肝脏中扩增得到了黄鳝hepcidin基因全长cDNA序列(GenBank accession number FJ436808).结果表明,黄鳝hepcidin基因cDNA全长712bp,5′端非翻译区有133bp,3′端非翻译区有306bp,包含1个273bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽.同源性分析表明,黄鳝hepcidin推测的氨基酸序列与其他鱼类报道的hepcidin具有较高的同源性,并具有8个半胱氨酸这一典型特征,是hepcidin家族的1个新成员.采用半定量PCR法对该基因在健康成体不同组织的转录本和脂多糖(LPS)对该基因表达的影响进行了分析.结果发现,该基因在肝脏中表达量最高,其次是肾脏,在心脏、皮肤、脑、血液、小肠、脾脏和胃中的表达量较低,而在肌肉中没有检测到该基因的转录本;LPS注射24h后,各组织的hepcidin基因表达量都有明显升高.

牙鲆抗菌肽hepcidin基因在成鱼组织和不同发育时期胚胎中的表达分析

抗菌肽hepcidin是由hepcidin基因编码产生的小分子多肽,是机体天然免疫的重要因子。本文利用RT-PCR的方法分析表明,抗菌肽hepcidin基因在牙鲆成鱼不同组织和不同发育时期胚胎中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。

军曹鱼Hepcidin基因全长cDNA克隆及其组织表达分析

本试验采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）的方法，得到714bp的军曹鱼（Rachycentron canadum）Hepcidin基因全长cDNA序列。该序列包括213bp的5’末端非编码区（UTR）、228bp的3’UTR及273bp的开放阅读框（ORF），编码90个氨基酸，预测其蛋白分子质量约为10．03ku，等电点为7．54，预测的蛋白包括信号肽、前肽和成熟肽。通过构建Hepcidin氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸同源性比对，结果显示军曹鱼与已知鱼类及哺乳动物Hepcidin氨基酸的同源性在24．4％～85．6％之间。实时荧光定量PCR（quantitative Real-timePCR，qRT-PCR）检测结果显示Hepcidin基因在正常军曹鱼组织中均表达，但表达量在各个组织中有所不同，其中以肝脏表达量最高。经脂多糖（LPS）和甲醛灭活的鲨鱼弧菌（Vibrio carchariae）刺激后，肝脏、头肾、脾脏中Hepcidi”基因表达均上调。

大菱鲆Hepcidin基因的克隆和真核表达载体的构建

Hepcidin是鱼类的一种重要的抗菌肽。通过比较GenBank中不同Hepcidin基因的同源相似性,设计出特异性的引物,以我国海水养殖大菱鲆(Scophthal mus maxi musL)肝脏为模板利用RT-PCR技术克隆获得了一条基因。使用生物信息学手段对该基因序列进行了比对和分析,证实这条基因为Hepcidin1precursor基因,属于Hepcidin基因家族。通过设计引物在Hepcidin基因的5′和3′端分别引入EcoRI和NotⅠ酶切位点。经过双酶切后获得具有EcoRI和Not I酶切位点的Hepcidin成熟肽片段,并与同样使用该酶线性化的表达载体pPIC3.5K连接。构建了表达载体pPIC3.5K/Hepc1,并将其导入到酵母基因组中,完成了真核表达载体的构建,为Hepcidin的真核表达作了基础性的准备工作。

鲢抗菌肽Hepcidin的基因克隆和表达及抑菌活性分析

利用同源克隆的方法从鲢(Hypophthalmichthys molitrix)的肝脏中克隆出抗菌肽Hepcidin cDNA(GenBank登入号KF312213)后,通过pET32a(+)构建含抗菌肽Hepcidin的重组质粒的pET-Hep/Rosetta菌株,在37℃、28℃和16℃下分别用0.5 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1IPTG诱导表达,产物用Ni SepharoseTM亲和层析柱纯化并进行体外抑菌试验。鲢Hepcidin cDNA总长度755 bp,ORF为282 bp,5'UTR为108 bp,3'UTR为365 bp,编码93氨基酸,信号肽24个氨基酸,前域42个氨基酸和成熟肽27个氨基酸。pET-Hep/Rosetta在28℃和16℃主要是可溶性表达,37℃主要是包涵体表达。纯化的产物经15%SDS-PAGE电泳验证为目的产物。目的产物、pET32/Rosetta产物以及氟苯尼考的体外抑菌试验表明,目的表达产物对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等具有很好的抑菌效果。

花鲈肝脏hepcidin相关cDNA Hepc2的克隆及序列分析

Hepcidin(Hepc)是一类性质独特的抗菌肽,具有广谱的抗革兰氏阳性、阴性细菌和真菌等作用。利用RT-PCR和RACE等技术,从经过多种细菌攻毒的花鲈(Lateolabrax japonicus)肝组织中克隆出Hepc全长cDNA,命名为Hepc2,Genbank登录号为AY604195。Hepc2有581个碱基,其中阅读框有258个碱基,编码86个氨基酸。预测氨基酸序列和白鲈及其他鱼种在相同保守的区域有8个半胱氨酸,相对分子量为9418.55dal。在3’非编码区有225bp,包含终止密码子下游189nt处的多腺苷酸化AATAAA信号和212nt处的polyA信号。预测蛋白的信号肽断裂位点在第24和第25个密码子之间。通过与白鲈(Morone chrysops)、人和其他鱼种来源的Hepc cDNA和蛋白质同源性分析表明,从花鲈肝中分离的Hepc2 cDNA属于Hepc基因家族的新成员。

牙鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法设计简并引物从牙鲆（Paralichthys olivaceus）肝脏中克隆了牙鲆hepcidin抗菌肽基因。牙鲆抗菌肽hepcidin基因组DNA全长821bp，序列分析表明该基因具有3个外显子和2个内含子。cDNA全长588bp，包含一个270bp的开放阅读框，编码一个长89氨基酸的前体肽。RT-PCR分析表明：该抗菌肽基因在正常牙鲆的肝脏、头肾、鳃、脾脏中表达量较高，在心脏、小肠中表达量较低；受到病原鳗弧菌感染的牙鲆各组织该基因表达量明显上升。牙鲆抗菌肽基因的克隆为水产养殖等领域的抗耐病品种的选育提供了基因源，为开发新的生物工程药物提供了基础理论和实验数据。

海洋鱼类和青蟹抗菌肽hepcidin和scygonadin的研究

抗菌肽或抗微生物肽因具有杀死或抑制微生物的共同特性,近年来科学家又将这些肽类称为"天然抗生素",有望在将来作为一种新型的生物药物替代现有的化学类抗生素.海洋动物中蕴藏着世界上丰富的抗菌活性物质,研究与开发应用海洋动物抗菌肽成为近年来的研究热点.结合国内外的相关研究进展,简要总结了课题组近年来在我国海水养殖鱼类抗菌肽hepcidin和青蟹抗菌肽scygonadin的研究进展,从抗菌肽的蛋白分离、纯化、基因克隆、基因表达模式、基因工程表达以及抗菌肽合成与表达产品的抗菌活性等进行了简要细致的叙述,对深入探索海洋动物抗菌肽在我国水产养殖业的开发应用具有重要的参考价值.

普通PCR与TD-PCR扩增叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因的比较

为了比较普通PCR和降落PCR(TD-PCR)扩增Hepcidin基因的效果,通过Trizol法提取叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA并合成cDNA,分别利用普通PCR和降落PCR扩增Hepcidin基因片段。结果显示,降落PCR能有效扩增叶尔羌高原鳅Hepci-din。测序结果显示:叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因与普通鱼类基因同源性达90%,而普通PCR则不能扩出明显目的条带。本研究结果表明在相同反应体系中,降落PCR在不影响PCR特异性的条件下,能提高扩增效率,可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段。

人hepcidin真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的构建人hepcidin全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系,以应用于拮抗hepcidin从而增强铁吸收的活性药物筛选。方法化学合成结合PCR拼接hepcidin全长结构基因,插入原核表达载体pMD18-T中,测序正确后再经HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,定向插入真核表达载体pcDNA3.0内,酶切鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转染人HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,ELISA检测转染细胞hepcidin的蛋白表达。结果经酶切鉴定,成功构建hepcidin真核表达载体pcDNA3-hepcidin;重组质粒转染HepG2,经G418筛选3周获得抗性细胞克隆,其hepcidin蛋白表达量为普通HepG2细胞表达量的3倍。结论成功构建了稳定高表达hepcidin的HepG2细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究hepcidin降低肠道铁吸收的分子机制以及筛选拮抗hepcidin作用的活性药物奠定了实验基础。

炎症刺激对新生仔猪铁含量 血清生化指标及Hepcidin基因表达量的影响

挑选刚出生杜长大三元杂交仔猪10头,随机分为对照组和脂多糖(LPS)刺激组,每组5头。LPS刺激组分别于3日龄、5日龄和7日龄时腹腔注射100μg/kg·bw LPS,建立炎症刺激模型;对照组仔猪分别在相同日龄注射相同体积生理盐水。7日龄时将所有仔猪全部处死,采集血清,并分离肝脏和脾脏.。结果表明,与对照组相比,LPS刺激可显著降低仔猪肝脏铁含量(P<0.05),极显著降低血清铁含量(P<0.01),但对脾脏铁含量无显著影响(P>0.05)。LPS刺激显著降低了仔猪血清中总蛋白、球蛋白、总胆红素和葡萄糖含量(P<0.05),显著提高了肝脏中Hepcidin mRNA表达量(P<0.05)。表明LPS刺激可显著增加仔猪肝脏中Hepcidin mRNA表达量,因而降低机体铁含量。

猪hepcidin基因质粒载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

为构建猪hepcidin毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体,实现其真核表达,本文采用RT-PCR方法获得猪肝脏中的铁代谢调节基因hepcidin,通过连接酶使其与真核表达载体pGAPZaA相连构建重组表达质粒pGAPZaA-hepcidin。利用高压电击处理,使质粒载体转入到毕赤酵母中,用含Zeocin抗生素的YPD平板筛选阳性转化子,并做PCR鉴定。结果表明:hepcidin基因准确地插入表达载体pGAPZaA,并已整合到酵母基因组中,并成功构建了酵母重组表达质粒。

团头鲂hepcidin基因单核苷酸多态性及与抗病性状的相关性

为了解hepcidin(铁调素)基因的多态性及其与抗病性状的相关性,以团头鲂(Megalobrama amblycephala)为研究对象,从公共数据库中获得hepcidin基因序列,对团头鲂进行嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)人工感染来区分易感和抗病个体,采用PCR扩增及测序技术筛选hepcidin基因序列中的SNP(单核苷酸多态,single nucleotide polymorphisms)位点,对SNP位点运用高分辨率熔解曲线法(high-resolution melting,HRM)进行分型,分析其多态性及与抗病性状之间的关系。结果在hepcidin基因上共筛选出2个SNP位点,其中1个位点位于内含子部分,1个位于3′非编码区。经过统计分析发现,位于3 371bp(A/G)的这一SNP位点的基因型频率和等位基因频率在易感和抗病组间差异极显著,位于217bp(A/G)位点的基因型频率和等位基因频率在易感组和抗病组间差异显著。据此推测hepcidin的这2个SNP位点多态性与团头鲂抗病性状相关。

黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体。[方法]根据Genbank中黄鳝hepcidin基因序列设计引物进行PCR扩增,将测序正确的基因片段连接入载体pET-28a中。[结果]以黄鳝cDNA为模板,扩增出hepcidin基因片段,长度为291 bp,连接到pET-28a上。经PCR扩增、双酶切验证,证实成功构建原核表达载体。[结论]成功构建了黄鳝hepcidin基因大肠杆菌表达载体。

牦牛hepcidin基因编码区的克隆和原核表达

采用RT-PCR从牦牛肝中扩增到了hepcidin基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化DH5α感受态细胞,获得了阳性重组质粒,牦牛hepcidin基因编码区长289 bp,编码82个氨基酸(GenBank:EU863791);与黄牛相比,牦牛hepcidin基因编码区序列存在1个碱基的变异,但未引起氨基酸的改变;将牦牛hepcidin基因编码区连接至pGEX-4T-1表达载体,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-hepcidin;IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示,35 ku处有特异性蛋白条带,表明牦牛hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达。

牦牛Hepcidin基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的普通牛Hepcidin基因序列(登录号为XM-589792.3)设计1对特异性引物。采用RT-PCR技术从牦牛肝脏组织总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列并进行测序分析,同时构建Hepcidin蛋白物种进化树。结果显示,经克隆获得牦牛Hepcidin基因322bp的cDNA序列(GenBank登录号为EU863791),含289bp的开放阅读框,编码82个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽;预测Hepcidin蛋白分子质量和等电点分别为8.88ku和9.24;与已知普通牛Hep-cidin序列的同源性达99%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。本研究为Hepcidin基因cDNA全长克隆及基因功能研究奠定了重要基础。

铁调素过表达对雌性去势小鼠铁代谢和骨代谢指标的影响

目的探讨铁调素基因过表达对去势小鼠铁代谢和骨代谢指标的影响。方法假手术组(sham组)和双侧卵巢切除组(OVX组)均为8周C57/BL6雌性野生型小鼠,实验组(hamp组)为铁调素基因条件性过表达小鼠,每组8只。OVX组和hamp组切除双侧卵巢,sham组仅切除卵巢旁等量脂肪组织。三组小鼠均他莫昔芬诱导铁调素过表达。8周后检测小鼠血清铁调素、血清铁蛋白、骨形成指标血清骨钙素、骨吸收指标1型胶原羧基末端肽(carboxy terminal telopeptide of collagen type1,CTX)和骨组织相关基因表达。结果血清铁调素:sham组(629.30±109.43)pg/m L,OVX组(669.12±121.48)pg/m L,hamp组(1 094.34±156.43)pg/m L,hamp组高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05);血清铁蛋白:sham组(411.09±67.74)ng/m L,OVX组(385.39±54.57)ng/m L,hamp组(242.43±39.73)ng/m L,hamp组低于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05);血清骨钙素:sham组(83.42±21.66)ng/m L,OVX组(124.01±28.81)ng/m L,hamp组(113.84±30.29)ng/m L,hamp组与OVX组间差异无统计学意义(P>0.05);血清CTX:sham组(62.45±12.92)ng/m L,OVX组(109.38±18.90)ng/m L,hamp组(75.13±13.32)ng/m L,hamp组较OVX组显著降低(P<0.05)。骨组织实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)结果显示,与OVX组比较,hamp组Run X2基因表达无明显变化,TRAP基因表达显著下降;骨密度:sham组(0.126±0.016)mg/mm3,OVX组(0.052±0.012)mg/mm3,hamp组(0.073±0.012)mg/mm3,hamp组高于OVX组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论铁调素基因过表达后可降低去势小鼠血清铁蛋白,抑制破骨指标,对成骨指标无明显影响。