牛BLG/hEPO和大鼠WAP/hEPO基因在家兔乳腺中的表达

将人红细胞生成素 (h EPO)基因组 DNA(g DNA)与 1.1kb牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因的 5′端上游调控序列融合 ,构建了 p CMV- BL G- EPO- b GH poly A(p CBEA)乳腺定位表达载体。该载体与已构建的大鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′端上游调控序列和 h EPO融合基因 p WAP- EPO- WAP3′U TR(p WE3′)和 p CMV- WAP- EPO- b GH poly A (p CWEA )经脂质体包裹后 ,通过显微外科方法 ,经乳腺导管注入妊娠中后期家兔乳腺内 ,进行短暂表达。于家兔分娩后 1～ 2 5 d采奶 ,EL ISA检测乳汁中 EPO含量 ,3个载体均获得表达。表达水平从高到低依次为 p CWEA、p CBEA、p WE3′;表达量为 0 .116～ 0 .75 3μg/ L 。

用点杂交法检测人促红细胞生成素(hEPO)的整合

目的为制作生产人促红细胞生成素的转基因鸡,把人促红细胞生成素(hEPO)基因以质粒介导用脂质体法导入鸡胚内,然后检测人促红细胞生成素基因的整合。方法以PCR方法进行筛选后,再用点杂交法进行鉴定。即把人促红细胞生成素基因PCR扩增阳性产物用地高辛标记,作为探针和鸡整个基因组进行点杂交。结果点杂交阳性结果有4个。结论得到了整合人促红细胞生成素基因的鸡胎。

用荧光原位杂交技术检测hEPO转基因山羊染色体上外源基因的整合状况

目的 对采用受精卵显微注射方法获得的 3头hEPO转基因山羊进行检测和整合状况分析。方法 用荧光原位杂交的方法 ,以正常羊及正常人染色体标本为对照 ,通过生物素标记的探针与转基因羊染色体标本进行杂交。结果 经信号放大及DAPI染色后 ,3头转基因羊分别在不同染色体上各有一对明显的荧光信号 ,而对照组无信号。结论 hEPO基因在转基因山羊染色体上的整合是单位点整合 。

hEPO cDNA重组逆转录病毒的构建

通过ＤＮＡ重组技术，将不含非编码区的ｈＥＰＯｃＤＮＡ片段重组到逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ，ｐＬＮＣＸ中重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞培养上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，使之在筛选培养基中形成典型的Ｇ４１８抗性克隆，该克隆细胞染色体中成功地整合了ＥＰＯｃＤＮＡ，并且表达出有生物学活性的红细胞生成素（ＥＰＯ）产物。

人促红细胞生成素基因在家蚕体中的高效表达

人促红细胞生成素(EPO)是一种调控红系干细胞增殖、分化和成熟的糖蛋白激素。将合成的EPOcDNA插入杆状病毒转移载体pBlueBacⅢ,使其置于Ph基因强启动子控制之下,获得了转移载体pBlueBacEPO。将pBlueBacEPODNA与野生型BmNPVDNA共转染BmN细胞,经空斑纯化,获插入EPOcDNA的重组病毒rBmNPVEPO。经Sonthern杂交和PCR扩增鉴定证明人EPO基因已正确组建于BmNPV的预定位置。将重组病毒rBmNPVEPO穿刺接种5龄幼虫和蛹,收集感染第3～5d的幼虫血淋巴和3～65d蛹血淋巴。用ELISA检测幼虫血淋巴中EPO表达量高达62800u/mL,蛹血淋巴中表达量达74000u/mL。Westernblot结果显示幼虫血淋巴和蛹血淋巴均有一条明显的免疫杂交带,分子量均约为26kD。用TF1细胞对幼虫表达产物进行了生物活性测定,每毫升血淋巴中EPO活性约为63000u。

乳腺特异高表达人促红细胞生成素转基因奶山羊的制备

目的制备乳腺特异性高表达人促红细胞生成素(hEPO)转基因奶山羊。方法采用牛β-乳球蛋白基因(BLG)调控元件和hEPO全长编码序列基因组DNA构建真核表达载体,应用受精卵原核注射的方法制备hEPO转基因山羊。结果在原核注射获得的188头羔羊中,经Southern blot法检测有4头羊含有hEPO基因,其中3头为母羊,1头公羊于出生后20d死亡;3头转基因母羊hEPO基因的拷贝数分别为1、10、2;Western blot检测结果显示转基因羊乳中的hEPO分子质量为32kDa;MTT法检测结果表明,在泌乳10d的3只转基因羊乳汁中,每毫升乳汁中hEPO活性分别达到1.17×102IU、1.90×104IU、1.91×104IU。结论牛BLG能够调控hEPO基因在山羊乳腺中高表达,为实现其他药用蛋白在山羊乳腺中表达奠定了基础。

人红细胞生成素单克隆抗体的制备研究

将杂交瘤细胞接种子BAIB/C小鼠腹腔内,令细胞增殖,抽取接种杂交瘤细胞后两周左右的腹水,采用硫酸胺盐析,饱和度为50％,然后上DEAE-Cellulose DE52柱,NaCl浓度梯度洗脱,所得单克隆抗体纯度达90％,可用于免疫亲和柱的制备。

贺州沙田客家话音系

贺州沙田客家话主要是长乐声,来自广东梅州地区。全浊声母今读塞音、塞擦音时基本送气,有舌尖前不圆唇音韵母[()],晓匣二母合口基本读[f],没有[y]音,声调6类,浊上读阴平,有两套塞擦音及同部位擦音,全浊声母今读不送气,这反映了沙田客家话的变异。

人促红细胞生成素鸡输卵管特异表达载体的构建

通过PCR技术从产蛋鸡输卵管基因组中扩增出 1 1kb的鸡卵清蛋白 5’端调控区 ,将其亚克隆入pMD18-T载体的多克隆位点 )命名为pOV) ,经酶切和测序鉴定可作为调控序列来启动外源基因的表达。然后从pOV上切下卵清蛋白 5’端调控区 ,再将其亚克隆入pBCE经SalI和HindⅢ双酶切的切口处 ,酶切鉴定为正向插入 ,成功构建了鸡卵清蛋白 5’端调控区调控人促红细胞生成素的质粒表达载体pOV -hEPO 。

人红细胞生成素单克隆抗体的制备、鉴定及应用研究

用rhEPO作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合,用碱性PAGE方法进一步分离并纯化的rhEPO,包被PVC板,对杂交瘤用ELISA方法进行筛选,获得两株稳定分泌抗hEPO单抗的杂交瘤细胞株。经鉴定分别属于IgG_1、IgG_(2b),轻链均为k链,K_d分别为5.53×10^(-10)mol/L和1.34×10^(-10)mol/L。用Western blot方法证明两者对hEPO具有高度的专一性,能特异地识别rhEPO和尿源hEPO。所制备单抗可作为亲和层析的配体,用于再生障碍性贫血病人尿中EPO及哺乳类工程细胞所表达的hEPO的分离、纯化,并可用于hEPO的定量检测。

河婆茶乌龙茶香气成分分析研究

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法,对河婆茶冷冻乌龙茶成品茶进行香气分析。试验结果表明:从河婆茶乌龙茶中共鉴定出包括醇类、醛类、酯类、酮类、碳氢化合物和其他香气物质等40种香气化合物,其中醇类物质相对含量最高,其次是碳氢化合物;河婆茶乌龙茶的主导香气成分为橙花叔醇(17.44%)、α-法尼烯(14.17%)、吲哚(10.76%)、顺-己酸-3-己烯酯(6.19%)、顺-β-罗勒烯(4.54%)和水杨酸甲酯(4.06%)。

人促红细胞生成素N糖图谱离子色谱分析方法的联合验证

目的对离子色谱(ion chromatography,IC)联用脉冲安培检测器(pulsed amperometric detector,PAD)分析重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)N糖图谱方法进行多实验室联合验证。方法将rhEPO供试品用25 mmol/L磷酸盐缓冲液超滤置换缓冲体系,调整浓度至2 mg/mL,用糖苷酶F酶切后,经乙醇沉淀,取上清冷冻干燥,获得rhEPO游离N糖。色谱条件:分析柱为Dionex CarboPac PA200,保护柱为Dionex CarboPac PA200;流动相A为50 mmol/L氢氧化钠溶液,流动相B为200 mmol/L氢氧化钠溶液,流动相C为250 mmol/L乙酸钠溶液;进样体积为25μL;流速为0.5 mL/min;柱温为30℃;梯度洗脱;使用仪器自带分析软件进行峰簇最高峰保留时间和峰簇面积百分比积分。选择3家实验室(L1~L3)进行方法的联合验证,包括准确度、精密度、线性、检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)、稳定性。结果rhEPO N糖各峰簇清晰可见;3个实验室不同浓度供试品各峰簇面积百分比均在84%~116%之间,方法准确度良好;各峰簇最高峰保留时间RSD均<5%,面积百分比RSD均<10%,方法重现性良好;蛋白浓度在1.0~3.0 mg/mL范围内,线性良好,R2>0.98;LOD约为0.10 mg/mL,LOQ约为0.32 mg/mL;在2~8℃下存放48 h,稳定性良好。结论建立了rhEPO N糖图谱IC法,联合验证指标良好,为rhEPO质量标准的提高提供了技术支持。

UHPLC-MS分析人促红素产品中CHO宿主细胞蛋白残留

目的:利用超高效液相色谱-质谱联用技术(UHPLC-MS)分析人促红素(human erythropoietin,hEPO)产品中CHO宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留。方法:将hEPO原液和蛋白标准品一起进行变性、还原烷基化、酶切处理;采用Accucore Vanquish C18色谱柱串联超高效液相色谱和Q ExactiveTM Plus组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪对样品进行分离和检测;使用BioPharma Finder 4.1软件中的HCP工作流程进行定性及定量分析。结果:10种HCP在4批hEPO原液样品中均被检测到,且不同样品中HCP总量有较大差异,从25×10^(-6)至约1000×10^(-6);含量>50×10^(-6)的HCP,CV值均<10%。结论:UHPLC-MS法可对CHO细胞表达的hEPO产品中HCP进行定性定量分析,不同来源hEPO样品中HCP种类和含量均有差异。

重组人促红细胞生成素四环素调控真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定含有四环素调控的pTRE顺式作用元件的质粒型载体pTRE2hyg-rhEPO。方法设计含BamHI和ClaI酶切位点的hEPO基因引物,采用RT-PCR法从含有rhEPO基因的CHO细胞中克隆hEPO基因片段,亚克隆至pTRE2hyg真核表达载体。转化感受态大肠杆菌Top10,酶切鉴定阳性重组子,并进行序列测定。结果经RT-PCR能扩增出604bp的片段,与预期片段大小相符,构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段,测序结果与预期序列完全一致。结论成功构建了重组人EPO四环素调控真核表达载体pTRE2hyg-rhEPO。

马来西亚与中国台湾三山国王庙的比较研究

马来西亚与中国台湾在三山国王庙祀神、神诞与祭典组织等所呈现的不同样貌表明,个案之间的信仰表征与族属认同之间存在很大差异。其中,信仰表征是庙宇的外显形式,信仰表征的差异,说明两地三山国王信仰的多元发展有在地化的倾向;在族属认同上,马来西亚三山国王信仰可以直接连结中国原乡"河婆",信徒大致认为自己是"河婆客家人",而中国台湾三山国王信徒的族属认同则表现为"客底"(福佬客)或福佬的现象。