牛BLG/hEPO和大鼠WAP/hEPO基因在家兔乳腺中的表达

将人红细胞生成素 (h EPO)基因组 DNA(g DNA)与 1.1kb牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因的 5′端上游调控序列融合 ,构建了 p CMV- BL G- EPO- b GH poly A(p CBEA)乳腺定位表达载体。该载体与已构建的大鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′端上游调控序列和 h EPO融合基因 p WAP- EPO- WAP3′U TR(p WE3′)和 p CMV- WAP- EPO- b GH poly A (p CWEA )经脂质体包裹后 ,通过显微外科方法 ,经乳腺导管注入妊娠中后期家兔乳腺内 ,进行短暂表达。于家兔分娩后 1～ 2 5 d采奶 ,EL ISA检测乳汁中 EPO含量 ,3个载体均获得表达。表达水平从高到低依次为 p CWEA、p CBEA、p WE3′;表达量为 0 .116～ 0 .75 3μg/ L 。

用点杂交法检测人促红细胞生成素(hEPO)的整合

目的为制作生产人促红细胞生成素的转基因鸡,把人促红细胞生成素(hEPO)基因以质粒介导用脂质体法导入鸡胚内,然后检测人促红细胞生成素基因的整合。方法以PCR方法进行筛选后,再用点杂交法进行鉴定。即把人促红细胞生成素基因PCR扩增阳性产物用地高辛标记,作为探针和鸡整个基因组进行点杂交。结果点杂交阳性结果有4个。结论得到了整合人促红细胞生成素基因的鸡胎。

用荧光原位杂交技术检测hEPO转基因山羊染色体上外源基因的整合状况

目的 对采用受精卵显微注射方法获得的 3头hEPO转基因山羊进行检测和整合状况分析。方法 用荧光原位杂交的方法 ,以正常羊及正常人染色体标本为对照 ,通过生物素标记的探针与转基因羊染色体标本进行杂交。结果 经信号放大及DAPI染色后 ,3头转基因羊分别在不同染色体上各有一对明显的荧光信号 ,而对照组无信号。结论 hEPO基因在转基因山羊染色体上的整合是单位点整合 。

hEPO cDNA重组逆转录病毒的构建

通过ＤＮＡ重组技术，将不含非编码区的ｈＥＰＯｃＤＮＡ片段重组到逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ，ｐＬＮＣＸ中重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞培养上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，使之在筛选培养基中形成典型的Ｇ４１８抗性克隆，该克隆细胞染色体中成功地整合了ＥＰＯｃＤＮＡ，并且表达出有生物学活性的红细胞生成素（ＥＰＯ）产物。

人促红细胞生成素基因在家蚕体中的高效表达

人促红细胞生成素(EPO)是一种调控红系干细胞增殖、分化和成熟的糖蛋白激素。将合成的EPOcDNA插入杆状病毒转移载体pBlueBacⅢ,使其置于Ph基因强启动子控制之下,获得了转移载体pBlueBacEPO。将pBlueBacEPODNA与野生型BmNPVDNA共转染BmN细胞,经空斑纯化,获插入EPOcDNA的重组病毒rBmNPVEPO。经Sonthern杂交和PCR扩增鉴定证明人EPO基因已正确组建于BmNPV的预定位置。将重组病毒rBmNPVEPO穿刺接种5龄幼虫和蛹,收集感染第3～5d的幼虫血淋巴和3～65d蛹血淋巴。用ELISA检测幼虫血淋巴中EPO表达量高达62800u/mL,蛹血淋巴中表达量达74000u/mL。Westernblot结果显示幼虫血淋巴和蛹血淋巴均有一条明显的免疫杂交带,分子量均约为26kD。用TF1细胞对幼虫表达产物进行了生物活性测定,每毫升血淋巴中EPO活性约为63000u。

乳腺特异高表达人促红细胞生成素转基因奶山羊的制备

目的制备乳腺特异性高表达人促红细胞生成素(hEPO)转基因奶山羊。方法采用牛β-乳球蛋白基因(BLG)调控元件和hEPO全长编码序列基因组DNA构建真核表达载体,应用受精卵原核注射的方法制备hEPO转基因山羊。结果在原核注射获得的188头羔羊中,经Southern blot法检测有4头羊含有hEPO基因,其中3头为母羊,1头公羊于出生后20d死亡;3头转基因母羊hEPO基因的拷贝数分别为1、10、2;Western blot检测结果显示转基因羊乳中的hEPO分子质量为32kDa;MTT法检测结果表明,在泌乳10d的3只转基因羊乳汁中,每毫升乳汁中hEPO活性分别达到1.17×102IU、1.90×104IU、1.91×104IU。结论牛BLG能够调控hEPO基因在山羊乳腺中高表达,为实现其他药用蛋白在山羊乳腺中表达奠定了基础。

人红细胞生成素单克隆抗体的制备研究

将杂交瘤细胞接种子BAIB/C小鼠腹腔内,令细胞增殖,抽取接种杂交瘤细胞后两周左右的腹水,采用硫酸胺盐析,饱和度为50％,然后上DEAE-Cellulose DE52柱,NaCl浓度梯度洗脱,所得单克隆抗体纯度达90％,可用于免疫亲和柱的制备。

贺州沙田客家话音系

贺州沙田客家话主要是长乐声,来自广东梅州地区。全浊声母今读塞音、塞擦音时基本送气,有舌尖前不圆唇音韵母[()],晓匣二母合口基本读[f],没有[y]音,声调6类,浊上读阴平,有两套塞擦音及同部位擦音,全浊声母今读不送气,这反映了沙田客家话的变异。

人促红细胞生成素鸡输卵管特异表达载体的构建

通过PCR技术从产蛋鸡输卵管基因组中扩增出 1 1kb的鸡卵清蛋白 5’端调控区 ,将其亚克隆入pMD18-T载体的多克隆位点 )命名为pOV) ,经酶切和测序鉴定可作为调控序列来启动外源基因的表达。然后从pOV上切下卵清蛋白 5’端调控区 ,再将其亚克隆入pBCE经SalI和HindⅢ双酶切的切口处 ,酶切鉴定为正向插入 ,成功构建了鸡卵清蛋白 5’端调控区调控人促红细胞生成素的质粒表达载体pOV -hEPO 。

人红细胞生成素单克隆抗体的制备、鉴定及应用研究

用rhEPO作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合,用碱性PAGE方法进一步分离并纯化的rhEPO,包被PVC板,对杂交瘤用ELISA方法进行筛选,获得两株稳定分泌抗hEPO单抗的杂交瘤细胞株。经鉴定分别属于IgG_1、IgG_(2b),轻链均为k链,K_d分别为5.53×10^(-10)mol/L和1.34×10^(-10)mol/L。用Western blot方法证明两者对hEPO具有高度的专一性,能特异地识别rhEPO和尿源hEPO。所制备单抗可作为亲和层析的配体,用于再生障碍性贫血病人尿中EPO及哺乳类工程细胞所表达的hEPO的分离、纯化,并可用于hEPO的定量检测。

河婆茶乌龙茶香气成分分析研究

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法,对河婆茶冷冻乌龙茶成品茶进行香气分析。试验结果表明:从河婆茶乌龙茶中共鉴定出包括醇类、醛类、酯类、酮类、碳氢化合物和其他香气物质等40种香气化合物,其中醇类物质相对含量最高,其次是碳氢化合物;河婆茶乌龙茶的主导香气成分为橙花叔醇(17.44%)、α-法尼烯(14.17%)、吲哚(10.76%)、顺-己酸-3-己烯酯(6.19%)、顺-β-罗勒烯(4.54%)和水杨酸甲酯(4.06%)。

UHPLC-MS分析人促红素产品中CHO宿主细胞蛋白残留

目的:利用超高效液相色谱-质谱联用技术(UHPLC-MS)分析人促红素(human erythropoietin,hEPO)产品中CHO宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留。方法:将hEPO原液和蛋白标准品一起进行变性、还原烷基化、酶切处理;采用Accucore Vanquish C18色谱柱串联超高效液相色谱和Q ExactiveTM Plus组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪对样品进行分离和检测;使用BioPharma Finder 4.1软件中的HCP工作流程进行定性及定量分析。结果:10种HCP在4批hEPO原液样品中均被检测到,且不同样品中HCP总量有较大差异,从25×10^(-6)至约1000×10^(-6);含量>50×10^(-6)的HCP,CV值均<10%。结论:UHPLC-MS法可对CHO细胞表达的hEPO产品中HCP进行定性定量分析,不同来源hEPO样品中HCP种类和含量均有差异。

重组人促红细胞生成素四环素调控真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定含有四环素调控的pTRE顺式作用元件的质粒型载体pTRE2hyg-rhEPO。方法设计含BamHI和ClaI酶切位点的hEPO基因引物,采用RT-PCR法从含有rhEPO基因的CHO细胞中克隆hEPO基因片段,亚克隆至pTRE2hyg真核表达载体。转化感受态大肠杆菌Top10,酶切鉴定阳性重组子,并进行序列测定。结果经RT-PCR能扩增出604bp的片段,与预期片段大小相符,构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段,测序结果与预期序列完全一致。结论成功构建了重组人EPO四环素调控真核表达载体pTRE2hyg-rhEPO。

马来西亚与中国台湾三山国王庙的比较研究

马来西亚与中国台湾在三山国王庙祀神、神诞与祭典组织等所呈现的不同样貌表明,个案之间的信仰表征与族属认同之间存在很大差异。其中,信仰表征是庙宇的外显形式,信仰表征的差异,说明两地三山国王信仰的多元发展有在地化的倾向;在族属认同上,马来西亚三山国王信仰可以直接连结中国原乡"河婆",信徒大致认为自己是"河婆客家人",而中国台湾三山国王信徒的族属认同则表现为"客底"(福佬客)或福佬的现象。