hIL-12及HER2/neu ECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定

目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu。将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu。将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析。结果酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达。经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因。结论成功获得hIL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础。

HER2/neu ECD毕赤酵母工程菌大规模发酵工艺研究

采用补料分批培养方法,在80 L发酵罐中对HER2/neu ECD工程菌进行高密度发酵,发酵温度28℃,pH值为4.4,溶氧范围25%以上。在湿重值达到180 g/L时开始诱导,甲醇诱导体积分数为0.5%,发酵时间96 h。发酵液离心后,上清经阳离子交换层析,对其表达产物进行纯化。结果表明:在优化发酵条件下,发酵上清通过阳离子交换层析纯化,可获得纯度较高的重组HER2/neu ECD,产量为600 mg/L。

早期乳腺癌患者手术、化疗后血清HER-2/neu ECD水平变化

目的:探讨乳腺癌患者手术或化疗后血清HER-2/neuECD水平变化的临床意义。方法:双抗体夹心ELISA法检测早期乳腺癌患者及其配对手术、化疗前后血清HER-2/neuECD水平,进行统计分析。结果:82例乳腺癌患者手术后,血清HER-2/neuECD水平90.24%(74/82)下降,3.66%(3/82,C.V≤5%)未变化,6.10%(5/82)升高;46例乳腺癌患者化疗后HER-2/neuECD水平升高组(15/46)对化疗的反应率73.33%(11/15)与HER-2/neuECD水平非升高组(HER-2/neuECD水平下降或不变,C.V≤5%,31/46)对化疗的反应率77.42%(24/31)无差别(P>0.05)。结论:检测乳腺癌患者血清HER-2/neuECD水平变化对预后可能具有一定的临床提示意义。

胃癌患者血清Her-2/neu ECD水平与肿瘤组织Her-2/neu表达的相关性及与临床特征的关系

目的从临床的角度探讨血清Her-2/neu胞外域部分(ECD)与肿瘤组织Her-2/neu表达之间的相关性及与临床特征的关系。方法初治胃癌患者46例进入研究,术前收集血清,采用ELISA方法检测Her-2/neu ECD水平,术后采用免疫组化方法对组织标本进行Her-2/neu表达的检测;同时获取15例正常人、22例胃良性病变患者血清为对照。结果胃癌患者中,7/46(15%)血清Her-2/neu ECD水平高于正常,组织Her-2/neu表达阳性者中38%血清Her-2/neu阳性,而组织表达阴性者中仅6%血清Her-2/neu ECD阳性,二者有相关性(P<0.05)。血清Her-2/neu ECD水平与年龄,性别,T分期,淋巴结转移,术后病理分期及肿瘤分化程度均无相关性(P>0.05);组织Her-2/neu表达与年龄,性别,T分期,术后病理分期及肿瘤分化程度均无相关性(P>0.05),但与有无转移淋巴结有相关性(P<0.05)。结论胃癌患者血清Her-2/neu ECD与肿瘤组织Her-2/neu表达有一致性,前者可以作为后者的补充检测方法。

可手术胃癌血清HER-2/neu ECD水平与临床特征及疗效的研究

目的:探讨可手术胃癌患者血清HER-2/neu胞外域部分(ECD)水平与临床特征及疗效的关系。方法:收集江苏省连云港市第二人民医院2010年01月至2010年12月,可手术胃癌患者46例进入研究,术前、术后收集血清,同时获取15例正常人、22例胃良性病变患者血清为对照组。另外收集7例血清HER-2/neuECD阳性患者四周期化疗后血清。采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测血清HER-2/neu ECD水平。结果:胃癌患者中,7/46(15%)血清HER-2/neu ECD水平高于正常;血清HER-2/neu ECD水平与患者年龄,性别,T分期,淋巴结转移,术后病理分期及肿瘤分化程度均无相关性(P>0.05);胃癌术后血清HER-2/neu ECD水平较术前有明显的降低,四周期辅助化疗后较术后血清HER-2/neu ECD水平无明显降低。结论:可手术胃癌患者血清HER-2/neu ECD水平与年龄,性别,T分期,淋巴结转移,术后病理分期及肿瘤分化程度均无相关性;血清HER-2/neu ECD水平可以作为疗效判断的指标。

进展期胃癌患者新辅助化疗及术后血清Her-2/neuECD水平变化

目的探讨进展期胃癌患者行新辅助化疗及手术后血清Her-2/neu ECD水平的变化及临床意义。方法采用双抗体夹心ELISA法检测海口市人民医院胃肠外科2011年2月～2012年6月42例进展期胃癌患者在新辅助化疗及手术前后血清Her-2/neu ECD水平,并统计根治手术率,进行统计学分析。结果 42例进展期胃癌患者行新辅助化疗后,血清Her-2/neu/neu ECD水平57.14%(24/42)下降,33.33%(14/42)未变化,9.52%(4/42)升高;化疗后血清Her-2/neu ECD水平下降组根治性切除率75.0%(18/24),化疗后血清Her-2/neu ECD水平升高、不变组根治性切除率44.44%(8/18),组间差异有显著性(P<0.05);而且根治性手术后患者与姑息术后患者血清Her-2/neu ECD水平下降率比较(分别为80.77%、31.25%),组间差异有显著性(P<0.05)。结论动态检测进展期胃癌患者新辅助化疗及手术前后血清Her-2/neu ECD水平变化对判断化疗、手术疗效及预后具有一定的临床意义。

eglA p-Her2/neu-IL-12融合基因穿梭载体的构建

目的:构建重组厌氧芽胞梭菌saccharobutylicum内源性β-1,4葡聚糖酶启动子(eglA p人)-表皮生长因子受体2胞外区(hHer2/neu ECD人)-白细胞介素12(rhIL-12)融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,并探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础。方法:以含有全长hHer2/neu序列的真核表达质粒(pcDNA3.1 hHer2/neu)为模板,采用PCR方法,扩增hHer2/neu ECD基因片段;将其插入重组rhIL-12真核表达质粒pcD-NA6 rhIL-12(p1)中的rhIL-12基因上游,获得pcDNA6 hHer2/neu ECD-rhIL-12(p2)真核表达质粒;设计合成eglAp基因中一段55 bp序列作为模板,通过连续PCR的方法,扩增eglAp片段(335 bp),并构建T-eglA p(p3)亚克隆质粒;通过酶切连接的方法,将eglA p片段插入p2质粒中的hHer2/neu ECD基因上游,构建pcDNA6 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p4)真核表达质粒;通过in-fusion技术,将融合基因eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12插入pIMP1穿梭表达质粒,构建重组pIMP1eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p5)穿梭表达载体,并进行菌液PCR、酶切及测序鉴定。结果:获得的hHer2/neu ECD和eglA p片段及p2、p3、p4重组质粒、p5融合基因重组穿梭表达载体,其PCR产物和酶切片段大小与预期一致,测序结果证实各基因序列与GenBank中mRNA或DNA序列一致。结论:成功地构建了大肠杆菌-厌氧芽胞梭菌融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础。

HER-2/neu基因在鼻咽癌中的表达及其临床意义

目的:探讨HER-2/neu基因在鼻咽癌中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化法测定HER2/neu基因蛋白的表达。结果:69例鼻咽癌病人中52%(36/69)有HER2/neu基因蛋白表达。这种过表达与肿瘤分期、局部淋巴结和远处脏器转移以及5年总生存期、3年无病生存期均无相关性。同一病例原发病灶和复发或转移灶HER2/neu基因蛋白的表达较一致。HER2/neu基因蛋白过表达对鼻咽癌化疗的反应性不产生影响。结论:在鼻咽癌,HER2/neu基因蛋白过表达的临床意义不明,HER2/neu基因蛋白能否成为治疗新的靶点还有待进一步研究。

乳腺癌钼靶X线钙化与HER-2／neu表达的关系及其意义

目的探讨乳腺癌钼靶X线钙化与HER-2/neu表达的关系及其临床意义。方法分析152例乳腺癌钼靶X线片的钙化特点;并将切除的肿瘤标本行HER-2/neu检测,分析钼靶X线钙化特征与HER-2/neu表达之间的关系。结果乳腺癌钼靶X线钙化组HER-2/neu过度表达率高于无钙化组(61.6%vs.35.4%)(P<0.01);在73例钙化中,以钙化伴随毛刺征为主要表现者,HER-2/neu过度表达率高于单纯钙化组(P<0.05)。根据钙化形态特征,蠕虫状钙化组HER-2/neu过度表达率明显高于非蠕虫状钙化组(P=0.01)。钼靶X线钙化簇最大径≥25 mm者,多在HER-2/neu过度表达组(P<0.05),而钙化颗粒数≤20枚/cm2者,多在HER-2/neu阴性表达组(P<0.01)。结论乳腺癌钼靶X线钙化与HER-2/neu过度表达关系密切,可为乳腺癌治疗策略的制定和预测预后提供参考。

黑米花青素对HER-2/neu高表达人乳腺癌细胞株MDA-MB-453移植瘤血管生成的影响

目的观察黑米花青素对HER-2/neu高表达人乳腺癌细胞株MDA-MB-453移植瘤血管生成的影响。方法以24只雌性BALB/c裸鼠建立MDA-MB-453细胞移植瘤模型,按照完全随机设计原则平均分入对照组、VEGF组、黑米花青素组和联合组4个处理组,分别以VEGF和黑米花青素提取物进行单独和联合干预;免疫组织化学法检测瘤组织核抗原Ki-67和Ⅷ因子相关抗原表达,评价移植瘤肿瘤细胞生长能力和瘤组织微血管密度(MVD)的变化;Western blot检测瘤组织促血管生成因子MMP-2、MMP-9和uPA表达水平的变化。结果相对于对照组,黑米花青素组瘤体积、MVD值和促血管生成因子的表达水平均显著降低(P<0.05),VEGF组上述指标则均有明显升高(P<0.05),联合组上述指标同对照组之间均无显著差异。相对于VEGF组,黑米花青素组和联合组的上述指标均有显著降低(P<0.05),其中黑米花青素组瘤体积有非常显著的降低(P<0.01)。与对照组相比,黑米花青素组核抗原Ki-67表达强阳性的细胞数显著减少,VEGF组核抗原Ki-67表达强阳性的细胞数显著增多。结论黑米花青素可能通过抑制移植瘤内血管生成而抑制肿瘤生长。

胃癌HER-2/neu基因表达与预后的相关性

目的研究胃癌人表皮生长因子受体(HER)-2/neu基因的表达与生存期的关系,探讨其作为胃癌预后指标的可行性。方法应用免疫组织化学方法检测103例胃癌标本HER-2/neu基因的表达,并将检测结果与患者的随访资料及临床病理参数进行综合分析。结果103例胃癌组织中HER-2/neu基因的阳性表达率为31.1%(32/103);HER-2/neu基因在胃良性病变和癌旁组织中均无表达;HER-2/neu基因表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、分化程度均无相关性(P>0.05),而与肿瘤的浸润深度、临床分期、淋巴结转移、远处转移及患者的生存时间相关(P<0.05)。结论HER-2/neu基因与胃癌的浸润、转移及预后密切相关,可作为判断胃癌生物学行为和预后的重要参考指标。

HER-2/neu在新辅助化疗乳腺癌中的表达及其意义分析

目的：检测并分析HER－2／neu在新辅助化疗乳腺癌组织中的表达，探讨新辅助化疗患者中HER－2／neu的临床意义。方法：采用免疫组织化学法分别检测HER－2／neu在165例新辅助化疗及73例未化疗乳腺癌组织中的表达状况，统计分析HER－2／neu表达与化疗、病理类型及腋淋巴结转移情况的关系。结果：新辅助化疗组HER－2／neu表达低于未化疗组（29．7％比43．8％，P＜0．05）；浸润性非特殊型乳腺癌HER－2／neu阳性表达明显高于浸润性特殊型（粘液腺癌0／4），但浸润性非特殊型乳腺癌之间HER－2／neu表达差异无显著性意义；腋淋巴结转移组HER－2／neu表达明显高于腋淋巴结阴性组（40．1％比25．0％，P＜0．05）。结论：HER－2／neu可能成为在新辅助化疗乳腺癌患者优于淋巴结状况的一个评价肿瘤生物学行为、预测治疗效果指导综合治疗方案制定以及判断预后的重要标志。

HER-2/neu与胃癌临床病理及预后的相关性研究

目的研究HER-2/neu基因蛋白表达与胃癌临床病理特征以及预后的相关性,探讨该基因在胃癌中作为预后因素的价值。方法应用免疫组织化学染色法对229例胃癌组织芯片进行HER-2/neu基因蛋白表达的检测,并将检测结果与患者的临床病理特征以及生存随访结果进行统计分析。结果 229例胃癌组织中HER-2/neu基因蛋白表达阳性率为14.85%,其表达与患者Lauren分型、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移和生存时间相关(P<0.05);Log-rank单因素分析显示,HER-2/neu基因蛋白表达与预后相关(P<0.05);Cox风险比例模型分析显示,HER-2/neu基因蛋白表达、Lauren分型、肿瘤大小、脉管浸润和TNM分期均为独立预后因素(P<0.05)。结论 HER-2/neu基因蛋白表达与胃癌的浸润、转移相关,是胃癌独立的预后因素之一。

EGFR、HER-2/neu蛋白在胃癌中的表达及其预后价值研究

目的研究胃癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)、HER-2/neu蛋白的表达与临床病理特征及生存时间的关系,探讨其作为胃癌预后指标的可行性。方法应用免疫组织化学法检测103例胃癌标本中EGFR、HER-2/neu蛋白的表达,并将检测结果与患者临床病理特征进行综合分析。结果在103例胃癌组织中,EGFR、HER-2/neu蛋白的阳性表达率分别为42.7%(44/103)、31.1%(32/103),而胃正常组织中均无表达。EGFR、HER-2/neu蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、分化程度均无相关性(P>0.05),而与肿瘤的浸润深度、病理分期、淋巴结转移、远处转移相关(P<0.05)。EGFR、HER-2/neu蛋白表达阳性患者的中位生存时间分别为11.0和10.1个月,表达阴性患者的中位生存时间分别为65.2和64.5个月,表达阳性与阴性患者的生存时间有显著性差异(P<0.05)。EGFR与HER-2/neu蛋白联合表达与生存时间相关(P_(EGFR)=0.027,P_(HER-2/neu)=0.000,r_(EGFR)=1.965,r_(HER-2/neu)= 3.153),二者阳性表达时有减少胃癌患者生存时间的危险,HER-2/neu阳性表达的危险度相对较大。结论测定胃癌组织中EGFR、HER-2/neu蛋白的表达,有助于判断患者预后,也为分子靶向治疗药物在胃癌的应用提供了理论依据。

乳腺癌病人血清HER-2/neu检测及其临床意义

【目的】本研究分析晚期乳腺癌患者血清HER-2/neu的水平与预后的关系,并探讨其临床意义。【方法】酶联免疫法(ELISA)检测94例晚期乳腺癌患者血清HER-2/neu的浓度,分析血清与组织中HER-2/neu表达的相关性,并分析其与患者预后的关系。【结果】94例晚期乳腺癌患者就诊时的血清HER-2/neu浓度为0.34～275.25μg/L(平均浓度为23.69μg/L)。血清HER-2/neu浓度的高低与化疗的有效性、疾病进展时间的长短无关。晚期乳腺癌患者的血清HER-2/neu浓度与肿瘤组织中HER-2/neu表达强阳性是一致的。【结论】血清HER-2/neu尚不能确立为独立的预后指标,需要更多的病例进行分析。

基质金属蛋白酶-2和p185^(HER-2/neu)蛋白在卵巢癌中的研究进展

基质金属蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)是基质金属蛋白酶家族的重要成员,能降解明胶蛋白和Ⅳ型、V型胶原,在细胞外基质的降解过程中起着关键作用,能够促进肿瘤细胞发生侵袭和转移。p185HER-2/neu蛋白是一种相对分子质量185×103的跨膜糖蛋白,由HER-2/neu基因编码,属于酪氨酸激酶受体家族,p185HER-2/neu蛋白在人类多种癌症中存在扩增及过量表达,并与肿瘤的侵袭性表型及生存期短密切相关。就基质金属蛋白酶-2和p185HER-2/neu蛋白的生物学特性,与卵巢癌侵袭转移和预后的关系及MMP-2和p185HER-2/neu蛋白的研究情况等予以综述。

表皮生长因子受体及HER-2/neu蛋白在胃癌中的表达和意义

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)、HER-2/neu蛋白在胃癌中的表达及其与预后的关系。方法回顾性分析2006年11月至2013年11月我院收治的90例胃癌患者(观察组)的临床资料,另选取正常胃组织50例作为对照组。观察2组EGFR、HER-2/neu蛋白的表达情况,分析胃癌组织中EGFR、HER-2/neu蛋白表达和临床病理特征的关系。结果观察组EGFR、HER-2/neu蛋白表达阳性率高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。EGFR、HER-2/neu蛋白表达和胃癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径无相关性(P>0.05),而与胃癌分化程度、临床分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移密切相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。EGFR与HER-2/neu表达呈正相关。结论 EGFR、HER-2/neu蛋白的表达与胃癌的发生发展密切相关。EGFR与HER-2/neu的表达呈正相关。

HER-2/neu胞外配体结合区基因的克隆及原核表达

目的 克隆HER 2 /neu胞外配体结合区基因 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。方法 用PCR技术扩增HER 2 /neu胞外配体结合区的cDNA片段 ,并将该片段插入pET 2 8a(+)原核表达载体中 ,实现插入基因的融合表达 ;用SDS PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果 构建的重组质粒在大肠杆菌中获得高效稳定的表达 ,表达产物的相对分子质量与预期值一致 ,且所表达蛋白可被抗HER 2 /neu的特异性抗体识别。结论 获得了HER 2 /neu胞外配体结合区基因在原核系统中的表达 ,为HER 2

HER-2/neu胞外配体结合区2在大肠杆菌中可溶性表达及纯化

用PCR技术扩增HER 2 neu胞外配体结合区 2 (RLD2 )cDNA ,并将扩增的基因片段克隆于硫氧还蛋白 (TrxA)原核表达载体中 ,获得TrxA RLD2融合蛋白的可溶性表达 .通过插入偶联翻译序列 ,实现TrxA与RLD2蛋白在大肠杆菌中的共表达 .表达产物经免疫印记检测可被抗HER 2 neu特异性抗体识别 .经离子交换层析和钴亲和层析纯化 ,RLD2蛋白的纯度达 90 % .用质谱法分析RLD2蛋白的分子量 ,与预期值相符 .结果表明 ,利用TrxA表达体系在大肠杆菌中获得了HER 2

SUCI02选择性抑制HER-2/neu受体酪氨酸激酶磷酸化及其对HER-2/neu过表达乳腺癌细胞生长的影响

背景与目的:HER-2/neu受体过度表达与肿瘤的发生发展、对化疗的敏感性以及患者预后有关;我们通过大量筛选,发现SUCI02犤N-(4-乙氧苯基)-2-羟基酸胺犦能抑制HER2/neu受体酪氨酸激酶磷酸化。本研究拟探讨SUCI02对HER-2/neu过度表达的肿瘤细胞生长的影响。方法:用免疫沉淀、免疫印迹法检测HER-2/neu受体酪氨酸激酶磷酸化、酪氨酸激酶蛋白水平的变化;MTT法检测SUCI02对乳腺癌细胞的抑制作用。结果:SUCI02能抑制HER-2/neu受体的自身磷酸化,在乳腺癌MDA-MB-453m1细胞中,SUCI02对HER-2/neu受体自身磷酸化的IC50为4.34μg/ml,对HER-2/neu的表达没有任何影响。在用SUCI02处理MDA-MB-453m1细胞30min后,用培养液洗掉药物,继续培养不同时间,结果可见洗掉药物后30min,SUCI02对HER-2/neu受体磷酸化的抑制就开始恢复。SUCI02处理MDA-MB-453m1细胞后其下游靶分子MAPK和AKT激活明显受抑制,呈现剂量依赖性。SUCI02对EGFR受体酪氨酸磷酸化在最高剂量用到40μg/ml下没有明显的抑制作用。应用MTT法检测了SUCI02对过度表达HER-2/neu的MDA-MB-453m1细胞的生长抑制作用,同时应用过表达EGFR的乳腺癌MDA-MB-468细胞作为对照,结果可见SUCI02对HER-2/neu过表达的肿瘤细胞相对于过表达EGFR的肿瘤细胞有更明显的抑制作用。结论:SUCI02?