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Hesl基因沉默促进骨髓间充质干细胞向GABA能神经元分化的实验研究

目的探索Hesl基因沉默对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向GABA能神经元分化的影响。方法体外分离纯化2-3周的sD大鼠BMSCs，通过RNAi技术沉默BMSCs中的Hesl基因，而后条件诱导BMSCs向GABA能神经元分化，最后通过免疫细胞化学和Westernblot分析细胞分化趋向。结果Hesl沉默的BMSCs经条件诱导后，免疫细胞化学结果示GAD67和NeuN阳性细胞数分别为（35．7±2．8）％和（72．4±3．2）％，均明显多于对照组（P〈0．05）；Westernblot结果示实验组GAD67蛋白条带灰度值与B-actin的比值（GAD67／p-actin）为（0．282±0．042），NeuN／13-actin为（0．728±0．039），同样高于对照组（P〈0．01）。结论Hesl基因沉默可促进BMSCs向GABA能神经元分化。

Notch1、Hes1在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

目的:探讨Notch1及Hes1在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组织中的表达及其与患者临床特征的相关性。方法:采用免疫组织化学法对比观察54例DLBCL及20例淋巴结炎组织中Notch1、Hes1的表达及与患者临床特征的关系。同时利用Oncomine数据库数据,分析DLBCL组织中Notch1、Hes1 mRNA和DNA水平。结果:免疫组化结果显示,Notch1、Hes1在DLBCL患者中的阳性表达率高于对照组(P<0.05)。Notch1表达与DLBCL患者临床B症状、Ann Arbor分期、淋巴细胞计数及乳酸脱氢酶水平密切相关(P<0.05),而Hes1在B症状患者中显著高表达(P<0.05)。在DLBCL组织中,Notch^(+)/Hes1^(+)表达21例(38.9%),Notch1与Hes1表达具有相关性(r=0.296,P<0.05)。生信分析Oncomine数据库中多个数据集发现,在Brune数据集中Notch1、Hes1 mRNA表达显著高于对照组织(P<0.05)。结论:DLBCL组织中Notch1、Hes1表达明显高于淋巴结炎组织,其表达与B症状、Ann Arbor分期等具有相关性,提示Notch1、Hes1在DCBCL的发生发展中发挥重要作用。

长链非编码RNA SLC26A4反义RNA 1通过Notch信号抑制乳腺癌细胞增殖与转移

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)SLC26A4反义RNA 1(SLC26A4-AS1)在乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及潜在生物学机制。方法 2017年6月~2020年12月乳腺癌组织及对应癌旁组织(距离癌组织边缘5 cm以上)40例,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测SLC26A4-AS1在乳腺癌组织和细胞系的表达。选择乳腺癌细胞MCF7作为研究对象,将细胞分为control组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-SLC26A4-AS1组和pcDNA3.1-SLC26A4-AS1+Notch激动剂组。qRT-PCR检测SLC26A4-AS1对Notch信号通路中关键因子Notch1和Hes1表达的影响。MTT比色法、划痕实验和Transwell小室实验分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。结果 SLC26A4-AS1在乳腺癌组织和细胞表达降低。pcDNA3.1-SLC26A4-AS1组Notch1和Hes1的表达量低于pcDNA3.1组,差异有统计学意义(P<0.01)。pcDNA3.1-SLC26A4-AS1组MCF7细胞活力、伤口愈合率和穿膜细胞数量均低于pcDNA3.1组,差异有统计学意义(P<0.01)。pcDNA3.1-SLC26A4-AS1+Notch激动剂组MCF7细胞活力、伤口愈合率和穿膜细胞数量均高于pcDNA3.1-SLC26A4-AS1组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 SLC26A4-AS1在乳腺癌中表达下调,其过表达抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。SLC26A4-AS1参与抑制Notch信号通路活化提供了一种新的表观遗传学调控机制。

Hes1蛋白在神经细胞生成中的作用

Hes1蛋白被广泛地表达于哺乳动物体内,并在生物进化过程中高度保守。其表达受Notch、Hedgehog信号系统等多种机制的调控,而且研究发现,Hes1蛋白表达量的高低与其功能有密切的关系。在神经系统发育过程中,Hes1蛋白功能的缺失可造成胚胎的无脑畸形,而其过高表达则可抑制神经祖细胞的增殖和分化,使神经祖细胞保持在未分化状态。由此可见,Hes1蛋白表达量的精确调控在神经细胞生成、神经系统发育过程中具有重要作用。

丹龙醒脑方对脑缺血再灌注大鼠海马区Notch信号通路相关蛋白表达的影响

目的探讨丹龙醒脑方对脑缺血再灌注模型大鼠海马区Notch信号通路相关蛋白Notch1、Notch2及Hes1表达的影响。方法将80只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、丹龙醒脑方小剂量组(丹小组7.4 g/kg)、大剂量组(丹大组14.8 g/kg),线栓法建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,再灌注7 d取缺血侧海马组织。采用免疫组织化学法、免疫印迹法检测大鼠海马区Notch1、Notch2及Hes1蛋白表达。结果与假手术组比较,各组Notch1、Notch2及Hes1蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,丹小组、丹大组Notch1、Notch2及Hes1蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论丹龙醒脑方能通过上调海马区Notch1、Notch2及Hes1蛋白表达水平,调节Notch信号转导通路,这可能是其促进脑缺血损伤后神经功能修复的机制之一。

Hes1在烟草诱导人支气管上皮细胞恶性转化过程中的作用

目的:探讨转录因子发状分裂相关增强子1(hairy and enhancer of split,Hes1)在香烟烟气凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)诱导永生化人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化中的作用。方法:CSC(1L空气中点燃1支香烟)慢性染毒BEP2D细胞至第70代,软琼脂集落形成实验检测CSC诱导的细胞恶性转化表型;采用RT-PCR和Western blot法检测各代细胞的Hes1表达;MTT法、细胞集落形成实验和流式细胞术检测Notch通路阻断剂DAPT或脂质体转染Hes1-siRNA对CSC染毒BEP2D细胞增殖与凋亡的影响。检测吸烟大鼠外周小气道组织中Hes1的表达;采用免疫组化法和RT-PCR法检测非小细胞肺癌组织及正常气道组织中Hes1的表达。结果:第70代BEP2D细胞具备恶性转化表型;Hes1在CSC染毒BEP2D细胞中的表达总体呈逐渐增高的趋势;DAPT和Hes1-siRNA均能通过下调Hes1显著抑制第70代BEP2D细胞的增殖,诱导其凋亡;Hes1在卷烟烟气暴露大鼠气道黏膜1月和6月组的表达较同期对照组显著增高;吸烟显著诱导肺癌组织和正常气道表达Hes1。结论:Hes1可能通过促进凋亡与增殖失衡,参与吸烟诱导的肺癌发生。

金匮肾气丸对庆大霉素诱导肾损伤大鼠肾组织Notch2/hes1信号通路的影响

目的:动态观察肾气丸对Notch2/hes1通路在庆大霉素诱导肾损伤及修复过程中表达的影响。方法:72只大鼠随机分成空白组(生理盐水灌胃,6ml/kg;生理盐水腹腔注射,3ml/kg,1次/d,持继10d)、金匮肾气丸组(金匮肾气丸灌胃:0.6g·kg-1·d-1);Gen,120mg/kg(3ml/kg,1次/d,腹腔注射,持继10d)和模型组(生理盐水灌胃,6ml/kg;Gen,120mg/kg,1次/d,腹腔注射,持继10d)。应用光镜观察肾小管损伤情况;应用免疫印迹蛋白、实时定量PCR观察大鼠Notch2/hes1信号通路在造模后1、14、28d肾脏的动态表达情况。结果:肾脏病理切片显示:在第1、14天,与空白组相比,模型组、肾气丸组造成的肾脏损伤程度有所不同;在第28天,各组肾小管基本恢复正常。免疫印迹蛋白、RT-PCR显示:在第1、14天,与空白组相比,模型组和金匮肾气丸组Notch2/hes1的表达明显增高(P<0.05);在第28天,各组表达差异无统计学意义(P>0.05);在第1、14天,与模型组相比,金匮肾气丸组Notch2/hes1的表达明显减少(P<0.05);在第28天,两组表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Notch2/hes1信号通路可能是庆大霉素诱导肾损伤及修复过程中的重要角色之一,肾气丸可能通过抑制Notch2/hes1信号通路减轻肾脏损伤并促进肾小管上皮细胞修复。

γ分泌酶抑制剂DAPT对庆大霉素致大鼠耳损伤及修复过程中听力及Notch2/hes1信号通路表达的影响

目的观察γ分泌酶抑制剂DAPT对庆大霉素致大鼠耳损伤及修复过程中听力变化及Notch2/hes1信号通路表达的影响。方法 72只成熟大鼠随机分成三组,每组24只;对照组给予生理盐水3ml.kg-1.d-1腹腔注射,连继10天,庆大霉素组给予Gen 120mg.kg-1.d-1腹腔注射,连继10天,DAPT组给予DAPT 5mg.kg-1.d-1腹腔注射,连用5天后停用2天,再用3天,同时腹腔注射Gen 120mg.kg-1.d-1,连继10天。各组注射前及注射后1、14、28天进行ABR检测后处死动物,应用免疫印迹蛋白、实时定量PCR观察大鼠Notch2/hes1信号通路的表达。结果对照组注射前后ABR反应阈无明显变化,与注射前相比,DAPT组和庆大霉素组注射后1、14、28天ABR阈值均明显升高,但随时间的延长阈值有所下降(P<0.05),其中,第28天DAPT组ABR反应阈较庆大霉素组下降明显(P<0.05);与对照组相比,DAPT组和庆大霉素组Notch2/hes1的表达均明显增高(P<0.05);与庆大霉素组相比,DAPT组的Notch2/hes1表达明显降低(P<0.05)。结论在庆大霉素致耳损伤及修复过程中,DAPT可能通过抑制Notch2/hes1信号通路减轻耳蜗毛细胞损伤并促进耳蜗毛细胞修复,进而促进听功能恢复。

Hes1 mRNA在神经干细胞向神经细胞分化过程中表达变化的研究

目的探讨Hes1mRNA在神经干细胞(NSC)向神经细胞分化过程中的表达变化。方法构建乳鼠海马NSC的细胞培养模型,对NSC增殖分化进行形态学观察。细胞分化前后,采用免疫化学染色法分别检测巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,以鉴定细胞类型。流式细胞仪检测细胞周期以确定细胞增殖活性。用逆转录-PCR(RT-PCR)检测NSC中Hes1mRNA的表达变化情况。结果从海马分离培养的细胞生长状态良好,有克隆增殖能力,呈Nestin表达阳性,细胞分化后呈NSE表达阳性。流式细胞仪检测结果显示,诱导前NSC增殖活跃,其S期的细胞比例明显高于诱导分化各阶段的细胞比例(P<0.01)。与诱导前NSC相比,分化细胞各阶段G0G1期细胞比例则显著增多(P<0.01),细胞停滞于G0G1期。RT-PCR结果表明,Hes1mRNA在NSC诱导分化前后均有表达,与诱导前相比,分化后的各阶段Hes1mRNA表达量均明显减少(P<0.05),而分化各阶段Hes1mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Hes1mRNA的高表达可能与NSC的增殖有关,而Hes1mRNA表达的减弱则有利于神经细胞的大量分化。

BMSCs诱导分化为胆碱能神经元过程中干扰Hes1表达对Stmn1和Sept9基因的影响

目的:通过检测体外培养的骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)定向诱导分化为胆碱能神经元过程中干扰Hes1基因对Stmn1和Sept9基因的表达变化情况,探讨骨髓基质细胞定向分化为胆碱能神经元的机制。方法:采用全骨髓培养法体外分离培养获得BMSCs,将第三代培养的BMSCs进行诱导分化,实时定量PCR技术分析干扰Hes1基因后,在骨髓基质细胞诱导分化为胆碱能神经元过程中Stmn1和Sept9基因的表达变化情况。结果:BMSCs诱导分化为胆碱能神经元后,经免疫荧光检测有乙酰胆碱转移酶阳性细胞表达;Hes1基因表达在诱导组和干扰后诱导组中均较对照组高(P<0.05);Stmn1基因表达水平在干扰后诱导组、干扰组、诱导组均较对照组高(P<0.05);Sept9基因在干扰后诱导组和干扰组中表达水平均较对照组高(P<0.05),诱导组和对照组间无统计学意义。结论:在BMSCs向胆碱能神经元分化过程中,干扰Hes1基因可调控Sept9,Stmn1的表达,Hes1基因的表达变化导致与分化和增殖相关基因的表达改变。

大鼠Hes1腺病毒干扰载体构建及功能鉴定

目的构建高滴度大鼠Hes1腺病毒干扰载体(Ad-Hes1-shRNA)。方法设计3对Hes1-shRNA寡核苷酸序列,通过定向克隆构建pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA干扰质粒,将pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA和pHBAd-BHG共转染293T细胞,以包装Ad-Hes1-shRNA,利用改进TCID50法进行病毒滴度测定。Ad-Hes1感染H9c2心肌细胞,Western blot检测Hes1表达。结果 pHBAd-U6-CMV-Hes1-shRNA构建成功,Ad-Hes1-shRNA包装顺利,滴度为1.0×10^(11) PFU/mL,并可在H9c2心肌细胞内发挥干扰效应。结论 Ad-Hes1-shRNA包装成功,在心肌细胞中具有Hes1的干扰效应。

γ-分泌酶抑制剂DAPT通过下调NOTCH1信号通路抑制结肠癌HCT116细胞增殖的实验研究

目的探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT能否通过下调NOTCH1信号通路抑制结肠癌HCT116细胞增殖,以及对Hes1基因表达的影响。方法使用不同浓度的DAPT(0μM、1μM和10μM)对结肠癌HCT116细胞进行干预。在不同时间点(0h、24h和48h)使用MTT法对HCT116细胞活性进行测定。在干预48h后,使用RT-PCR对在不同浓度(0μM、1μM和10μM)DAPT干预后细胞NOTCH1和Hes1mRNA的表达水平进行测定。使用western blot对在不同浓度(0μM、1μM和10μM)DAPT干预后细胞NOTCH1和Hes1蛋白表达水平进行测定。结果使用不同浓度DAPT(0μM、1μM和10μM)对结肠癌HCT116细胞进行干预后,细胞活性呈时间依赖性和浓度依赖性降低,差异均存在显著统计学意义(P均<0.05)。不同浓度DAPT(0μM、1μM和10μM)干预48h后,结肠癌HCT116细胞NOTCH1和Hes1mRNA和蛋白的表达水平呈浓度依赖性的下降,差异均存在显著统计学意义(P均<0.05)。结论本实验表明γ-分泌酶抑制剂DAPT可以通过下调NOTCH1信号通路,抑制结肠癌HCT116细胞增殖。

Hes1对急性髓系白血病患者骨髓CD34^＋CD38^-细胞的作用及其机制研究

目的:研究Hes1对急性髓系白血病(AML)患者骨髓CD34+CD38-细胞的作用及其机制。方法:收集初治AML患者及正常供者骨髓样本后,通过密度梯度离心法获取单个核细胞,流式细胞术检测CD34+CD38-细胞比例及其细胞周期。通过免疫磁珠法分选CD34+CD38-细胞后,体外集落形成实验(CFC)检测其增殖能力,并通过Realtime PCR检测其Hes1的表达量。构建Hes1过表达逆转录病毒载体,感染正常供者骨髓CD34+细胞后,流式细胞术分析其细胞周期的改变,CFC检测其增殖的改变。结果:AML患者骨髓CD34+CD38-细胞比例明显低于正常对照,流式细胞术结果显示患者来源CD34+CD38-细胞大多数进入静止期,CFC结果显示患者CD34+CD38-细胞体外扩增能力下降。Realtime PCR结果发现患者CD34+CD38-细胞中Hes1表达上调。提高正常供者CD34+细胞中Hes1的表达后,细胞增殖减少,进入静止期。结论:在AML中CD34+CD38-细胞比例下降,进入静止期,与Hes1的表达上调有关。

Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中的作用及机制探讨

目的观察Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖和凋亡中的作用,并探讨其机制。方法将U87细胞随机分为A、B、C组,分别加入Notch信号激活剂rhNF-κB、抑制剂DAPT及PBS共培养48 h。用MTT法检测细胞吸光度值(A值)观察细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot法分别检测U87细胞中的Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白。结果培养24、48、72、96 h,A组细胞A值分别为0.185±0.007、0.398±0.012、0.735±0.015、1.083±0.031,B组分别为0.102±0.003、0.130±0.004、0.161±0.006、0.194±0.003,C组分别为0.167±0.005、0.265±0.008、0.496±0.011、0.737±0.016,A、B组与C组比较,P均<0.05。A、B、C组细胞凋亡率分为0.96%±0.17%、26.51%±3.74%、8.76%±1.40%,A、B组与C组比较,P均<0.05。与C组比较,A组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著增加(P均<0.05),B组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著降低(P均<0.05)。结论 Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中发挥了重要的调控作用,其机制可能与调节靶基因Hes1、抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关。

Hes1与小鼠海马齿状回神经再生

目的:观察幼年小鼠与成年小鼠海马齿状回中Hes1的表达差异,初步分析其对成年神经再生的影响。方法:将C57BL/6雄性小鼠分为幼年组(10 d,N组)和成年组(4个月,A组),每组8只。分别对Hes1、Brd U、Doublecortin(DCX)、Neu N采用免疫荧光技术染色并进行相应的细胞计数,初步分析Brd U、Hes1双阳性细胞的细胞类型及表达水平。在显微镜下分离海马齿状回,采用Western blot检测Hes1的蛋白水平,观察对比两组间Hes1蛋白表达的差异。结果:(1)Western blot检测中A组中的Hes1蛋白的表达水平明显高于N组,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。(2)Hes1(+)细胞主要分布于齿状回颗粒细胞下层,并且大部分Hes1阳性细胞同时表达Brdu;(3)A组Hes1(+)细胞数量明显多于N组,而Brd U(+)细胞明显少于N组,且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Hes1在幼年小鼠与成年小鼠齿状回颗粒细胞下层中的表达差异,导致了神经细胞增殖水平的不同,表明Hes1的高表达可能抑制了神经再生。

β淀粉样肽对神经母细胞瘤细胞Notch信号通路的影响

目的:研究β淀粉样肽(Aβ)处理SH-SY5Y细胞以及α3神经型尼古丁受体(α3 nAChR)沉默细胞后细胞Notch信号通路的变化。方法:2μmol/L Aβ处理SH-SY5Y细胞以及α3 nAChR沉默细胞,用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time PCR)和蛋白印迹(western blot)方法分别检测细胞中Notch信号通路中Notch1和Hes1的mRNA及蛋白水平的变化,评价Aβ对细胞Notch信号通路的影响。结果:Aβ处理的SH-SY5Y细胞以及α3 nAChR沉默细胞中Notch1和Hes1的mRNA及蛋白水平表达均增加,且在α3 nAChR沉默细胞中增加更为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Aβ可增加细胞Notch信号通路基因表达,α3 nAChR沉默会增强Aβ对Notch信号通路基因表达的影响,这可能与阿尔茨海默氏病(AD)的发病有一定的关系。

小鼠胰岛β细胞(Min6)长链非编码RNA Meg3绑定PRC2沉默Hes1表达

目的细胞水平研究Meg3与PRC2复合物的关系以及对其下游基因的影响。方法实时定量PCR检测Meg3在Min6细胞细胞核和细胞质的定位,采用RIP技术、UCSC Genome Browser、CHIP技术验证Meg3与Ezh2及其下游基因Hes1的关系。结果 qRT-PCR检测Min6中转染Si-Ezh2、Si-Suz12后Hes1基因的表达显著受到抑制,CHIP结果表明Ezh2能直接绑定在Hes1的启动子区域并介导H3K27me3的修饰过程,而敲除Meg3和Ezh2的表达使Ezh2与H3k27的结合能力降低。结论 lncRNAMeg3在小鼠胰岛Min6细胞中能够绑定核心蛋白复合体PRC2,Ezh2可以直接调控下游转录因子基因Hes1的表达,该发现可以进一步丰富和完善胰岛功能的基因调控网络。

体外培养胚胎神经干细胞的增殖及中药有效成分对其增殖能力的影响

[目的]探讨中药有效成分对神经干细胞(NSCs)增值能力的影响并探讨其作用机制。[方法]从16天SD大鼠胚胎脑体外培养原代NSCs,增生并传代。用Nestin免疫细胞—化学染色(ICC)鉴定NSCs,用BrdU染色鉴定NSCs增生。限量稀释法观察了几种中药有效成分对NSCs增生的作用,如人参皂苷Rg1和黄芪皂苷(ASIV)。[结果]不同剂量的人参皂苷Rg1和黄芪皂苷ASIV能促进神经干细胞的体外增殖。与对照组比较,Rg1和AS的3种剂量可使神经球生成数目增加(P<0.05或P<0.01)。其中两种药物成分低剂量组比其他组效果更显著。Hes1,Hes5和细胞周期蛋白D1的实时定量逆转录—聚合酶链(RT-PCR)分析显示Rg1高剂量组的Hes1基因表达和AS高剂量组Hes5基因表达增长明显。同时,Rg1中剂量组的Hes5基因表达轻微增加(P>0.05)。两药各剂量组的周期蛋白D1(CyclinD1)基因表达可见有增加,但无统计学意义(P>0.05)。[结论]Rg1和ASIV可明显促进神经干细胞体外增殖,实时定量检测结果显示Hes1、Hes5和周期蛋白D1与Rg1和AS促进神经干细胞增殖有一定关系。

食管鳞癌细胞中LSD1通过与Notch靶基因启动子结合调控Notch通路相关蛋白表达

目的:探讨食管鳞癌细胞中LSD1对Notch信号通路的调控作用及调控机制。方法:Western blot法检测5种食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE790、Eca109、EC9706和TE-1中LSD1及Notch通路相关蛋白的表达情况。用LSD1抑制剂TCP处理KYSE450、KYSE790和Eca109细胞或用LSD1 siRNA处理Eca109细胞,Western blot检测处理前后细胞中LSD1、组蛋白H3K4me2和Notch信号通路相关蛋白的表达情况。结果:5种食管鳞癌细胞中均存在LSD1及Notch信号通路相关蛋白的表达,且表达水平不同;TCP处理后,与未处理组相比,KYSE450、KYSE790和Eca109细胞中LSD1的表达水平均降低,组蛋白H3K4me2表达升高,Notch信号通路相关蛋白的表达均降低(P<0.05);LSD1 siRNA同样使Eca109细胞中LSD1与Notch信号通路相关蛋白表达受到抑制(P<0.05)。结论:食管鳞癌细胞中LSD1对Notch信号通路有调节作用,且LSD1可能是通过与Notch靶基因Hes1的启动子区域结合实现的。