布鲁菌Hfq蛋白研究进展

布鲁菌病(布病)是一种严重的人兽共患病。作为布病的病原,布鲁菌能够耐受宿主体内的各种杀菌机制并持续的生存。当布鲁菌侵入宿主体内后,必须适应抗体免疫的环境,而这依赖于布鲁菌对自身基因表达的巧妙调控。Hfq蛋白是一个RNA伴侣分子,对于介导sRNA的转录后调控发挥着重要的作用。在多种细菌中,对Hfq蛋白的功能都进行了深入的研究,目前已经发现该蛋白与细菌基因的表达调控、细菌对多种应激环境的适应能力以及致病菌的毒力均有着密切的关系。论文对Hfq蛋白的结构,对sRNA的调控功能,特别是布鲁菌Hfq蛋白调控功能的研究现状及在布病疫苗研发中的应用进行系统的介绍,为布鲁菌基因的表达调控和布病防控技术的研究提供参考。

建立基于RNA免疫共沉淀技术的鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关sRNA的体内验证方法

目的:建立RNA免疫共沉淀方法,为鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关非编码小RNA(sRNA)提供体内验证方法。方法:首先在RNA结合蛋白Hfq下游加入Flag标签,用Flag标签抗体进行免疫共沉淀,获得蛋白-RNA复合物,然后从沉淀的蛋白-RNA复合物中分离得到纯化的RNA;通过Western印迹检测各步骤Hfq蛋白的表达,再利用Northern印迹检测目的sRNA——RyhB1和RyhB2。结果:构建了带有Flag标签的RNA结合蛋白Hfq的载体,此载体转导入hfq缺失株后与鼠疫菌野生株的生长曲线无明显差异;通过RNA-蛋白免疫共沉淀技术鉴定出已知与鼠疫菌Hfq蛋白结合的2个sRNA——RyhB1和RyhB2。结论:建立了利用RNA-蛋白免疫共沉淀鉴定与鼠疫菌Hfq蛋白结合的sRNA的技术,为细菌sRNA的验证、功能研究和体内蛋白质与RNA相互作用研究提供了有利工具。

沙门菌伴侣蛋白Hfq及RybB对外膜蛋白相关基因fadL、ompN、ybfM的作用

为了解RybB sRNA、RNA伴侣蛋白Hfq对沙门菌外膜蛋白fadL、ybfM、ompN的作用,利用λ-red同源重组系统构建fadL、ybfM、ompN基因lac融合菌株,通过P22噬菌体转导完成颜色指示菌株中RybB、hfq基因的单缺失与双缺失,进行β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR,对其相应表达量进行分析.结果表明,Hfq抑制ybfM、ompN的表达,但fadL的表达上调;RybB sRNA抑制ompN、fadL的表达,但ybfM的表达上调.当Hfq与RybB共同对ybfM、fadL、ompN进行调控时,对ompN、ybfM的表达具有抑制作用,但fadL的表达上调,且Hfq的调控作用总体大于RybB.

伴侣蛋白Hfq对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究小RNA(sRNA)伴侣蛋白Hfq在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染致病过程中的作用,本研究采用Red同源重组法构建了禽致病性大肠杆菌FY26的hfq缺失株FY26Δhfq,通过测定缺失株生长曲线、生物被膜形成、体内定殖、胞内存活等能力来判定sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC致病力的影响。在体外,生物被膜形成能力直接决定着细菌对外界环境的抵抗能力,而在细菌进入体内后,其生长速率、黏附、定殖、吞噬细胞内的存活等能力均会直接影响其致病力。在进行了缺失株FY26Δhfq与野生株FY26的生长曲线测定试验、生物被膜形成能力测定试验、感染雏鸡试验、雏鸡体内定殖与侵袭试验、DF-1细胞黏附及HD11吞噬细胞内存活试验后,结果表明:hfq缺失株相较野生株其生长速率下降,生物背膜形成能力降低了18.6%,感染雏鸡时毒力降低,感染7 d后存活率为80%,在雏鸡体内定殖侵袭减弱,体内竞争能力下降至33.2%,对DF-1细胞的黏附能力降低,HD11吞噬细胞内的存活能力下降,单个细胞内存活的细菌数大多少于6个。研究表明,sRNA伴侣蛋白Hfq对APEC的致病力起着关键的正向调控作用。

鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq调控基因的筛选

为筛选鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq所调控的基因,本实验基于本研究室前期对指数生长期和稳定期的鼠伤寒沙门菌hfq基因缺失株转录组测序结果,从中随机挑选6个在转录水平差异表达的基因,并通过荧光定量PCR技术验证转录组数据的可靠性,然后在转录组数据可靠的前提下将两个转录组中所有显著差异表达(log2FoldChang>1)的基因GO富集细菌致病机制生物学过程,Pathway富集细菌ABC转运通路和群体感应通路,在富集得到的基因中筛选指数生长期和稳定期均表现为转录水平差异表达且趋势相同的基因。荧光定量PCR检测结果显示,6个基因转录水平差异上调或下调的趋势与转录组分析结果中一致,表明转录组数据可靠,可进行后续的研究。GO与Pathway富集结果显示,在鼠伤寒沙门氏菌hfq基因缺失株指数期和稳定期中均表现为转录水平差异上调或下调且差异倍数均大于2的基因共26个。其中,与细菌致病机制生物学过程相关的13个基因均上调;与细菌ABC转运通路相关的基因11个,其中9个基因转录水平均上调2个基因转录水平均下调;与细菌群体感应相关的2个基因转录水平均上调。26个基因中仅rpoE经验证受Hfq直接调控。以上结果表明,Hfq主要参与细菌致病机制生物学过程以及细菌ABC转运通路的负调控。本研究为后续Hfq靶基因的鉴定及其作用机理的研究提供了理论基础,同时丰富了Hfq调控基因的数目。

鼠伤寒沙门氏菌LT2 Hfq与fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR结合位点的预测与验证分析

通过5′RACE技术分析fadL、ompN、ybfM mRNA的5′UTR,并筛查fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR中Hfq结合偏好型基序(ARN)n.利用λ-Red同源重组酶和FLP重组酶系统构建fadL、ompN、ybfM基因(ARN)n基序缺失基础上的lacZ基因融合菌株,运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株,通过β-半乳糖苷酶试验检测重组菌株的蛋白水平.结果显示,fadL中筛选出ARN-1(AAAAAA)、ARN-2(AAAAATAAT),其缺失降低了fadL的蛋白表达量,分别降低72%、56%;ompN中筛选出ARN-1(GTTTTT)、ARN-2(TCTTTT)、ARN-4(TTTGCT),其缺失提高了ompN的蛋白表达量,分别提高了1.29、1.30、1.07倍,ARN-3(ATTATT)缺失使ompN的蛋白表达量降低了10%;ybfM中筛选出ARN-1(AAGAGG)、ARN-2(AGCAAT)、ARN-3(AGTAAA)、ARN-4(AAAAATAGT)、ARN-5(AACAGAAAG),其缺失均增加了ybfM蛋白水平变化,分别为4.20、3.99、10.90、227.00、46.00倍.结果表明,ybfM、ompN、fadL中(ARN)n位点不同缺失能导致ybfM、ompN、fadL表达水平出现上调或下调,部分(ARN)n序列缺失可影响Hfq对相应靶基因蛋白水平调控作用.

枯草芽孢杆菌菌株A抗菌蛋白的分离纯化及抗真菌机理

【目的】揭示生防菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株A产生的抗真菌蛋白的性质及作用机理。【方法】采用硫酸铵沉淀菌株A发酵液获粗蛋白;采用DE52离子交换层析技术对粗蛋白进行分离纯化;对具抗真菌活性的纯化组分采用MALDI-TOF-MS进行结构分析;以玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)为材料,对纯化活性蛋白的抗真菌机理进行研究。【结果】从粗蛋白中分离到一种抗真菌活性蛋白(FV),与RNA结合蛋白Hfq Bacillus subtilis subsp.subtilis gi|16078797的匹配率为86.484%,相对分子质量为8 508.5 Da,等电点为8.04。FV对玉米小斑病菌孢子萌发的半数抑制浓度(IC50)为138.32μg.mL-1,附着胞形成的IC50为22.23μg.mL-1。经FV处理后,玉米小斑病菌菌丝顶端、中部出现膨大泡囊,呈"念珠状";扫描电镜观察发现泡囊状菌丝表面凹凸不平,并残留有碎片;透射电镜观察发现在部分菌丝细胞原生质出现"空泡"的菌丝里有"子菌丝"。【结论】枯草芽孢杆菌菌株A产生的抗真菌蛋白与RNA结合蛋白Hfq高度同源,可抑制致病真菌孢子萌发、附着胞形成,并影响菌丝细胞的形态和结构。

肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为探究肠炎沙门菌伴侣蛋白Hfq对nmpC的调控机理及其基因编码产物OmpD在致病过程中参与的生物学功能,采用PCR方法扩增肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD基因nmpC,并将其克隆至原核表达载体pColdTM TF,构建重组表达载体pColdTM TF-nmpC。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导和Ni-NTA亲和层析获得高纯度的融合蛋白OmpD。用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,获得鼠源抗OmpD抗体。结果显示,经酶切、测序和Western blot鉴定分析,本研究成功构建并表达肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD,经纯化后免疫BALB/c小鼠,获得特异性的鼠源OmpD多克隆抗体,为进一步探究肠炎沙门菌外膜蛋白OmpD在致病过程中参与的生物学功能奠定基础。

沙门菌外膜蛋白相关基因缺失株的致病性

为探究沙门菌外膜蛋白基因fadL、ompN、ybfM以及sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq缺失对该菌致病性的影响,构建了鼠伤寒沙门菌基因缺失菌株,并测定了基因缺失菌株的生长曲线,同时通过小鼠腹腔注射测定了基因缺失菌株的毒力及其在小鼠脾脏和肝脏上的定殖能力.结果显示,与鼠伤寒沙门菌亲本野生型菌株LT2相比,基因缺失菌株的生长能力变化不大.LT2对小鼠的LD_(50)为3.97×10^(7)CFU;外膜蛋白基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL和ΔybfM的LD_(50)分别为1.58×10^(5)、6.29×10^(5)、9.97×10^(5)CFU,毒性明显增强;sRNA敲除菌株(ΔrybB)的LD_(50)为9.97×10^(7)CFU,毒性有所下降;伴侣蛋白Hfq敲除组(Δhfq)及rybB&hfq双敲除组的小鼠死亡数未超过50%,毒性明显下降.感染48 h后,与对照组(LT2)相比,所有基因缺失菌株处理组的脾脏指数均极显著性升高;ΔrybB&Δhfq、Δhfq处理组的脾脏载菌量显著降低,其余菌株处理组的载菌量与LT2差异不显著;ΔrybB、ΔrybB&Δhfq、ΔfadL、ΔybfM处理组的肝脏指数均显著下降,而Δhfq、ΔompN处理组的肝脏指数变化不显著;ΔrybB、ΔfadL处理组肝脏载菌量变化不显著,Δhfq、ΔrybB&Δhfq处理组的肝脏载菌量显著下降,而ΔompN、ΔybfM处理组的载菌量显著上升.总的来说,hfq、rybB缺失降低了鼠伤寒沙门菌的致病力,而fadL、ompN、ybfM的缺失提高了鼠伤寒沙门菌的致病力.

产单核细胞李氏杆菌hfq基因的原核表达及表达产物的聚合体分析

为了研究产单核细胞李氏杆菌Hfq蛋白的结构,将菌株yzuLM4的hfq基因在大肠杆菌中进行了表达。结果显示,在IPTG诱导下hfq基因获得可溶性表达,融合蛋白的大小约为16ku,诱导温度对表达的影响不显著。Western-blot分析结果表明,原核表达的Hfq蛋白具有反应原性。同时,通过非变性凝胶电泳,发现Hfq蛋白能以单体、二聚体、四聚体以及六聚体的形式存在,且各多聚体的比例不同。具有天然蛋白结构特征和免疫原性的Hfq蛋白的原核表达,为其在李氏杆菌中的功能研究奠定了基础。

大肠杆菌中的小RNA调节子

小RNA(smallRNAs或sRNAs)是一类长度在40至400个核苷酸、广泛存在于从细菌到哺乳动物多种不同的生物体内、执行多种生物学功能的非编码的RNA分子。对于sRNA分子的研究过去主要集中在哺乳动物。近年来,随着生物信息学和分子生物学技术的不断发展,在原核生物体内也陆续发现了一些sRNA分子,这些sRNA分子具有多样的生物学功能。大肠杆菌作为原核生物的代表在其体内已发现了近70种的sRNA分子。同真核细胞中的sRNA一样,细菌中的sRNA绝大多数也是通过与靶mRNA配对来影响mRNA的稳定性或翻译,从而对基因的表达进行调节。Hfq蛋白作为RNA的分子伴侣对于这些RNA分子的正确折叠和行使功能具有重要的作用。

牛种布鲁菌sRNA的预测与鉴定

为了对牛种布鲁菌2308株基因组中的sRNA进行预测和鉴定,提取牛种布鲁菌2308株的总RNA,进行RNA-Seq高通量测序,基于测序结果采用sRNA-Detect算法进行sRNA的预测,并采用反转录PCR对sRNA进行验证。结果显示,共预测筛选出3523条候选的sRNA,采用反转录PCR验证出14个sRNA可以表达,其中13个sRNA的正常表达与Hfq伴侣蛋白密切相关。本研究在牛种布鲁菌中预测出3523条sRNA,Hfq蛋白可以调控部分sRNA的正常表达。