两种ACYW135群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合疫苗的制备及质量与免疫原性分析

目的 对比2种结合方式的以白喉毒素无毒突变体197(cross-reacting material 197,CRM197)蛋白为载体制备的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗的质量与免疫原性。方法 方法一以CRM197蛋白羧基为结合位点,用1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate, CDAP)分别将A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基活化为氰基,以己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide, ADH)作为连接剂,最后通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐[4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl morpholinium chloride, DMTMM]与CRM197反应得到单价结合物;方法二用CRM197蛋白氨基为结合位点,用高碘酸钠分别氧化A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基为醛基,加入CRM197蛋白生成席夫碱,最后通过氰基硼氢化纳还原,得到单价结合物。对2种结合方式制备的结合物原液进行理化检测,合格后再分别将2种路线的单价结合物按比例与冻干辅料混合后经冻干制成2种ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗(ACYW135-CRM197),分别免疫NIH小鼠后,用ELISA检测小鼠血清中抗体并进行统计学分析。结果 2种结合方式制备的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗,游离多糖含量均<20.00%,K_D值在0.2以前的洗脱液多糖回收率均>80.00%,但以CRM197蛋白羧基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌单价结合物原液中游离多糖含量(3.20%~11.50%)均低于以氨基为结合位点的相应结合物原液中的游离多糖(8.35%~17.42%);疫苗成品的平均相对分子质量,以CRM197蛋白羧基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗更大。2种结合疫苗免疫小鼠后其体内产生的抗体经检定后统计分析,A群、C群多糖免疫原性差异均无统计学意义(P=0.080,P=0.176),W群、Y群多糖免疫原性差异均有统计学意义(P=0.015,P=0.027)。结论 以CRM197蛋白载体羧基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗在质量和免疫原性方面均不差于传统的以CRM197蛋白载体氨基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗。

b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197)的安全性和免疫原性研究

目的评价b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(Haemophilus Influenzae Typeb Conjugate Vaccine,Hib)[磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197(Polyribosylribitol Phosphate-Cross Reacting Material197,PRP-CRM197)]在中国儿童使用的安全性、免疫原性和加强免疫后的抗体应答。方法研究分三个阶段:第一阶段为I期安全性研究,先入组20名16～20月龄的幼儿,接种1剂Hib PRP-CRM197;15d后入组20名2～4月龄的婴儿,按间隔1个月的程序接种3剂Hib PRP-CRM197。每剂接种后收集30d内的安全性数据。第二个阶段为Ⅲ期基础免疫,入组916名2～4月龄受试者,随机分配到试验组(611人)和对照组(305人),分别接种3剂Hib PRP-CRM197或Hib PRP-T(Tetanus Toxoid,TT;破伤风类毒素)对照疫苗,每剂间隔1个月。第三个阶段为Ⅲ期加强免疫,对基础免疫完成3剂疫苗接种的受试者,于1周岁后加强免疫1剂。在Ⅲ期临床研究中,收集安全性和免疫原性的数据。抗-PRP抗体测定采用酶联免疫吸附试验。结果Ⅰ期安全性研究发现,Hib PRP-CRM197在两个年龄组(婴儿和幼儿)都有良好的耐受性。基础免疫和加强免疫的Ⅲ期临床研究表明,Hib PRP-CRM197的安全性和HibPRP-T相似。在完成基础免疫后1个月,实验组和对照组的所有受试者均达到了短期血清保护性抗-PRP抗体水平[≥0.15微克/毫升(g/ml)],且分别有99%和97%的受试者达到了长期血清保护性抗-PRP抗体水平(≥1.0g/ml)。在完成加强免疫后,所有受试者均达到了短期和长期的血清保护性抗体水平。与HibPRP-T组相比,接种HibPRP-CRM197始终产生更高的抗体几何平均浓度。结论 Hib PRP-CRM197疫苗在基础免疫和加强免疫后,都显示了良好的耐受性和快速的抗-PRP抗体应答。Hib PRP-CRM197的免疫原性不劣于HibPRP-T,且安全性也相似。Hib PRP-CRM197可用于中国儿童抗Hib感染的常规免疫接种。临床试验注册国家食品药品监督管理局《药物临床批件》2008L03160。

新型ACYW135群脑膜炎球菌-白喉毒素无毒变异体结合疫苗的制备及其免疫原性评价

目的 制备新型ACYW135群脑膜炎球菌-白喉毒素无毒变异体(cross-reacting material 197,CRM197)结合疫苗,并评价其免疫原性,以期为流行性脑脊髓膜炎的防控奠定基础。方法 用1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)分别将A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基活化为氰基,并以己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)作为连接剂与活化多糖通过氰酸酯连接,生成裸露酰肼基的多糖-ADH衍生物,再通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐[4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl morpholinium chloride,DMTMM]与CRM197生成酰胺键偶联,得到各单价结合物原液,并进行相关检测。将单价结合物原液按一定比例混合后,分别加入3种冻干保护剂(蔗糖溶液、乳糖溶液及蔗糖+甘露醇溶液),经冻干,制备3种ACYW135-CRM197结合疫苗。将制备的疫苗于0、14 d经雄性NIH小鼠背部皮下注射,0.2 mL/只,每组10只,并于初次免疫后21 d,经小鼠颌下静脉采血,分离血清,ELISA法检测特异性抗体水平。结果 A、C、Y、W135-CRM197单价结合物原液的检测结果均符合质量标准。ACYW135-CRM197疫苗成品可与各群多糖抗血清形成明显沉淀线;平均分子量均在1 680 000~5 230 000范围内。3种ACYW135-CRM197结合疫苗的抗A、C、Y、W135群多糖IgG抗体阳转率均为100%;ACYW135-CRM197(蔗糖)、ACYW135-CRM197(乳糖)和ACYW135-CRM197(蔗糖+甘露醇)组比较,差异均无统计学意义(t=0.249~1.157,P均> 0.05)。结论 本研究制备了新型ACYW135-CRM197结合疫苗,且该疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性。

b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197)在13～59月龄儿童中的安全性和免疫原性研究

目的评价b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(Haemophilus Influenzae Typeb Conjugate Vaccine,Hib)[磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197(Polyribosylribitol Phosphate-Cross Reacting Material197,PRP-CRM197)]在13～59月龄儿童中使用的安全性和免疫原性。方法选择728名13～59月龄儿童,按1:1的比例随机分配到试验组(365人)和对照组(363人),分别肌内注射接种1剂PRP-CRM197或Hib[PRP-T(Tetanus Toxoid,TT;破伤风类毒素)],观察接种后7d内的局部和全身反应,收集接种后30d内的不良事件和用药情况。在接种疫苗前和接种疫苗后30d采集静脉血,用酶联免疫吸附试验检测抗-PRP抗体(Antibody to PRP,Anti-PRP)。结果分别有99%和100%接种PRP-CRM197和PRP-T的受试者,达到了短期[≥0.15微克/毫升(g/ml)]和长期(≥1.0g/ml)血清保护性Anti-PRP水平。两种疫苗的安全性相似。结论 Hib(PRP-CRM197)的耐受性良好,免疫原性不劣于Hib(PRP-T),为99%的受试者提供了血清保护性Anti-PRP。Hib(PRP-CRM197)可在13～59月龄儿童中进行免疫。临床试验注册国家食品药品监督管理局《药物临床批件》2008L03160。

两种方法制备的C群脑膜炎球菌多糖CRM_(197)蛋白结合物生物学特性、热稳定性及免疫原性的对比

目的分析两种方法制备C群脑膜炎球菌多糖CRM_(197)蛋白结合物的主要生物学特性,并对比其热稳定性和免疫原性,选择适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法。方法采用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化C群多糖,经己二酸二酰肼(ADH)衍生后,在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDAC)的催化作用下与CRM_(197)共价结合,获得结合物CPS_(_CDAP)AH-CRM_(197);将C群多糖不经活化直接通过ADH衍生后,在EDAC的催化下与CRM_(197)共价结合,获得结合物CPS_(_EDAC)AH-CRM_(197)。对两种方法制备结合物的多糖含量、游离多糖含量、蛋白含量及多糖衍生度等生化指标进行测定,并计算多糖利用率;将结合物分别于37℃放置2周、3周,20～25℃放置4周和8周后取样,测定游离多糖含量;将两种方法制备的结合物免疫小鼠后,检测小鼠血清中C群多糖IgG抗体水平;体外杀菌试验评价结合物的功能性杀菌抗体水平。结果结合物CPS_(_CDAP)AH-CRM_(197)的多糖衍生度较低,游离多糖含量较高,平均多糖利用率为12.2%,于37及22～25℃温度下保存稳定性较差;结合物CPS_(_EDAC)AH-CRM_(197)的多糖利用率比前者高近2倍,游离多糖含量较低,在37和22～25℃温度下保存均表现出良好的热稳定性(游离多糖含量均未超过5%)。CPS_(_EDAC)AH-CRM_(197)组小鼠血清IgG抗体水平显著高于CPS_(_CDAP)AH-CRM_(197)组(P<0.05),但两者诱导的杀菌抗体水平相当(P>0.05)。结论C群多糖不经活化直接与蛋白结合的方法更适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备。