融合蛋白Kininogen D5_(60-148)-TRAIL_(114-281)的表达及其抑制血管新生和诱导细胞凋亡的作用

目的:采用原核表达系统表达人Kininogen D560-148-TRAIL114-281融合蛋白,并对其生物学活性进行研究。方法:PCR技术扩增Kininogen D560-148和TRAIL114-281的编码序列,分别构建原核表达载体pMAL-Kininogen D560-148(pMAL-KD5)、pMAL-TRAIL114-281(pMAL-TRAIL)和pMAL-Kininogen D560-148-TRAIL114-281(pMAL-KT),重组质粒分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达融合蛋白MBP-KD5、MBP-TRAIL和MBP-KT,并经亲和层析纯化。MTT法检测细胞的增殖,管状形成实验检测内皮细胞血管形成,流式细胞仪和电镜检测细胞凋亡。结果:成功构建原核表达载体pMAL-KD5、pMAL-TRAIL和pMAL-KT,并获得纯化的融合蛋白MBP-KD5、MBP-TRAIL和MBP-KT。融合蛋白MBP-KT与MBP-KD5、MBP-TRAIL相比可显著抑制内皮细胞ECV304和胰腺癌细胞SW1990的增殖、明显抑制ECV304细胞体外管腔的形成,同时,MBP-KT剂量依赖性地诱导SW1990细胞凋亡。结论:融合蛋白Kininogen D560-148-TRAIL114-281既能诱导肿瘤细胞凋亡又能抑制血管生成,为进一步开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础。

高分子量激肽原富含组氨酸区域抑制细胞伸展的机制分析

活化型高分子量激肽原 (activehighmolecularweightkininogen ,HKa)是组织培养板上体外连接蛋白 (vitronectin ,VN)促使细胞伸展的潜在抑制物 ,已证实轻链的富含组氨酸区域 (histidine richdomain ,HRD)是HKa抗细胞伸展的活性区域 .HK的重组HRD (r HRD)能够促使成纤维细胞伸展 .通过基于HRD序列的选择肽分析 ,定位了HRD的细胞伸展序列 .5个肽中的 3个能够使TIG 3细胞伸展 .P 1肽引起的细胞伸展能够被可溶性P 5肽或HKa所抑制 .P 2肽不能抑制P 1或P 5肽引起的细胞伸展 .r HRD以及 3种肽介导的细胞伸展能够被RGD合成肽以及抗αvβ3或α5β1整合素抗体所抑制 .结果提示 ,选择肽引起的细胞伸展是由整合素介导的 。

激活的高分子激肽原抗细胞伸展与体外连接蛋白结构变化关系的探讨

目的 :通过观察结构上改变的体外连接蛋白 (aVN)底物上激活的高分子激肽原 (HKa)对细胞伸展的影响 ,比较VN与aVN上HKa对细胞抑制活性。方法 :采用细胞杂交及细胞粘附方法观察在HKa存在与否下VN对细胞伸展的影响。结果 :HKa存在下MG 6 3细胞不能在固定的VN上伸展 ,但能在aVN上伸展 ;天然VN固定于塑料表面后用尿素处理 ,HKa存在或缺乏状态下细胞伸展活性相同。细胞杂交结果显示 ,在包被VN的硝酸纤维素膜上MG 6 3细胞伸展 ,存在HKa状态下细胞不能伸展于天然VN ,而伸展于aVN底物。结论 :在天然VN与aVN底物上HKa对细胞的抑制活性不同 。

HKa轻链D5区及其合成肽对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Hka轻链D5区对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响及其发挥活性作用的功能区。方法通过制备HKaD5区重组蛋白(r-HRD)及其D5区合成肽P-5、P-5n、P-5m、P-5c,采用WST法和AnnexinⅤ/PI双标记法检测HKa轻链D5区及其合成肽对MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的影响。结果合成肽P-5、P-5n、P-5m能抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导MDA-MB-231细胞凋亡;P-5c无抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用。相差显微镜观察细胞形态改变,发现肽P-5、P-5n、P-5m处理组细胞体积缩小、变圆,细胞生长受抑制,活力下降;P-5c处理组与对照组相比无差异。结论合成肽P-5、P-5n、P-5m抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用是通过诱导细胞凋亡实现的,组-甘-赖氨酸序列可能是其发挥活性作用的核心序列。

活化型高分子量激肽原潜在的抗肿瘤作用及其分子机制

高分子量激肽原是血浆中一种多功能的糖蛋白,与血液凝固的启动、补体反应及炎症发生等有密切关系.新近的研究显示,活化型高分子量激肽原具有潜在的抗肿瘤作用.本文综述活化型高分子量激肽原在细胞粘附和血管生成中发挥的抑制作用及其活性区域,抑制细胞迁移、增殖并诱导细胞凋亡的作用,及其在细胞表面的作用位点和分子机制.活化型高分子量激肽原作用机制,包括抑制细胞DNA的从头合成,使细胞周期蛋白D1表达下降,以及通过影响细胞内信号通路发挥其活性效应等.深入研究活化型高分子量激肽原在细胞表面作用的信号转导通路可能是今后抗肿瘤研究途径之一.

高分子量激肽原第5结构域的研究进展

高分子激肽原的第5结构域在抑制细胞粘附和浸润、抑制内皮细胞增生、诱导细胞凋亡、参与炎症反应等方面发挥着重要作用.其反应机制可能与高分子激肽原在激肽释放酶的作用下释放缓激肽后,增加其轻链的第5区的暴露面积、增加第5区与内皮细胞的接触机会有关.研究高分子激肽原第5区的作用,有助于预防恶性肿瘤的增长和转移、炎症效应的调节和控制,并为临床上生物治疗的应用奠定实验基础.

接触系统生物学意义的再认识

目前,凝血学说发生了概念性改变,认为体内凝血过程分为两个阶段,组织因子途径负责凝血过程的启动,以因子Ⅺ(FⅪ)为起点的内在途径负责凝血过程的放大,而接触系统并不参与体内凝血过程。已有资料表明,接触系统是一个重要的血管生物学调制系统。它的主要作用包括调整血管紧张度、抑制血小板活化、促进纤溶、抑制粘附以及促进炎症等。它的改变与败血症、血栓性疾病等病变过程密切相关。

血浆高分子量激肽原在DSS诱导的急性结肠炎中的作用

目的研究高分子量激肽原(HK)在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎中的作用。方法用含2.5%DSS的饮用水饲喂小鼠,构建急性结肠炎模型。通过检测体重百分比,临床评分与结肠长度比较野生型小鼠和HK基因敲除小鼠发病程度。应用ELISA的方法检测结肠组织研磨液中炎症因子的蛋白水平,应用实时定量PCR检测和比较结肠组织炎症因子的mRNA水平。制作末端结肠的石蜡切片,通过HE染色观察结肠组织的病理变化。结果HK基因敲除小鼠体重失去百分比明显低于野生型小鼠,HK基因敲除小鼠的疾病指数评分明显低于野生型小鼠(P<0.05),HK基因敲除小鼠的结肠长度的缩短要明显少于野生型小鼠(P<0.05)。HK基因敲除小鼠结肠组织中炎症因子的蛋白水平与mRNA水平均明显低于野生型发病小鼠(P<0.05)。HK基因敲除发病小鼠结肠组织损伤程度明显低于野生型发病小鼠。结论血浆高分子量激肽原在炎症性肠病中起调控作用。

野生型及突变型高分子激肽原D5_H抑制肿瘤细胞转移的研究

目的探讨编码含有关键模序HGK的高分子激肽原(high molecular weight kininogen,HK)第5结构区域(D5H)的野生型与突变型的蛋白质对抑制肿瘤细胞转移能力的影响。方法利用PCR介导的定点突变技术分别将D5H的模序His485-Gly-Lys487中的每个氨基酸依次被Ala替代获得3个突变体。将这些突变体构建到p GEX-4T-1的表达载体上,并在大肠杆菌中进行融合蛋白的表达,利用亲和色谱纯化这些蛋白。通过细胞黏附、侵袭实验及免疫细胞化学SP法观察野生型与突变型GST-D5H融合蛋白对肿瘤细胞黏附及侵袭能力的影响。结果对抑制肿瘤细胞黏附能力的强弱顺序为:GST-D5H>GST-D5H(G486-A)>GST-D5H(H485-A)>GST-D5H(K487-A)。结论 Lys487是在D5H模序(His485-Gly-Lys487)中发挥生物学活性的关键氨基酸。

激肽系统活性产物

随着研究的不断深入,发现激肽释放酶-激肽系统参与了机体众多的生物学过程,除了对机体心血管系统、凝血系统、纤溶系统和肾功能等正常生理过程的调节作用外,在高血压、炎症、疼痛、血管生成、细胞增殖、凋亡和肿瘤发生等诸多的病理生理过程中也陆续发现有着不可替代的作用。有关激肽释放酶等上游活性物质的生理功能报道较多,本文从人激肽释放酶-激肽系统开始,重点对下游活性产物缓激肽、活性高分子量激肽原等在生理及病理过程中的作用和调节作一综述。

HKD5对人脐静脉内皮细胞游走及血管形成的抑制作用

目的:体外实验研究活化型高分子量激肽原(HKa)轻链富含组氨酸区域5(HKD5)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的粘附、游走及血管形成的影响。方法:体外重组融合蛋白-活化型高分子量激肽原轻链富含组氨酸区域5(GST-D5H)。W ST-1法观察HUVECs细胞粘附能力;用改良Boyden Chamber膜侵袭系统观察HUVECs细胞游走(趋化);用血管形成实验观察HUVECs细胞形成新生血管能力。结果:GST-D5H作用后,HU-VECs细胞粘贴率降低(P<0.05),游走穿膜细胞数明显低于对照组(P<0.01),诱导内皮细胞形成管腔数及长度均低于对照组(P<0.05)。结论:GST-D5H能有效抑制HUVECs细胞粘附、游走,使该细胞粘附力降低,迁移性下降及血管形成数目减少或变细。

血浆高分子量激肽原在内毒素血症中的作用

目的研究高分子量激肽原(HK)在内毒素血症中的作用。方法将内毒素(LPS)经腹腔内注射于小鼠,观察和比较野生型小鼠和血浆HK缺陷小鼠生存率的表型,应用ELISA检测和比较二者血浆中缓激肽(BK)和炎症因子浓度,应用实时PCR检测和比较二者白细胞炎症因子mRNA水平,制作肺组织石蜡病理切片,通过HE染色观察肺组织的病理变化。结果野生型小鼠在注射LPS后3 h,血浆缓激肽含量明显增高,说明LPS在体内可导致高分子量激肽原的裂解。在LPS注射4 h后,HK缺陷小鼠血浆炎症因子水平较野生型小鼠显著降低,HK缺陷小鼠白细胞炎症因子mRNA水平明显降低。野生型小鼠的肺组织间质增生明显,纤维细胞增多,炎性细胞浸润明显,血管扩张,提示炎性较强,而HK缺陷小鼠无明显病理变化。结论血浆高分子量激肽原在内毒素介导的炎症反应中具有重要的调控作用。

中性粒细胞细胞外网络与接触系统在尿毒症急性冠状动脉综合征中的作用

目的探讨中性粒细胞细胞外网络(NETs)与接触系统在尿毒症急性冠状动脉综合征(ACS)中的作用。方法选择尿毒症患者44例,分为尿毒症ACS组[包括尿毒症ACS感染组(A1组)和尿毒症ACS非感染组(A2组)两个亚组]、尿毒症非ACS组[包括尿毒症非ACS感染组(B1组)和尿毒症非ACS非感染组(B2组)两个亚组],正常健康查体人群作为健康对照组。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒,分别检测血清中瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)和高分子量激肽原(HK)的水平。结果1尿毒症ACS组、尿毒症非ACS组的血清CitH3(229.35±131.51)μg/L、(175.40±91.72)μg/L水平高于健康对照组(120.61±56.18)μg/L;HK(354.55±208.16)ng/L、(429.13±131.62)ng/L低于健康对照组(562.81±138.80)ng/L,差异有统计学意义(均P<0.05)。2与B2组比较,A1组血清CitH3水平增高(269.31±131.66)μg/L vs(142.65±56.69)μg/L;血清HK水平降低(272.84±158.44)ng/L vs(486.44±133.12)ng/L,差异有统计学意义(均P<0.01)。3A1组中血清CitH3水平与血小板呈负相关(r=-0.731,P<0.05)。结论 NETs与接触系统激活在尿毒症患者ACS的发病过程中发挥重要作用。

接触系统和中性粒细胞细胞外网络在狼疮性肾炎致病中的作用

目的探讨接触系统与中性粒细胞细胞外网络(NETs)在狼疮性肾炎(LN)中的作用机制。方法 LN患者70例分为LN发作期组和LN缓解期组,另选择原发病为慢性肾小球肾炎的慢性肾脏病(CKD)患者8例作为CKD组,正常健康查体人群22例作为健康对照组。分别检测血清中瓜氨酸化的组蛋白H3(CitH3)和高分子量激肽原(HK)的浓度。结果 1LN发作期组血清HK水平明显低于其余3组;血清CitH3水平明显高于其余3组(P<0.01)。2发作期血清HK水平明显低于缓解期,而血清CitH3水平明显高于缓解期(P<0.05)。3LN患者血清HK水平与CitH3水平呈负相关(r=-0.22,P<0.05)。结论接触系统和NETs共同参与了LN的进展。

内源性凝血系统蛋白高分子量激肽原在细菌感染中的作用

目的研究血浆高分子量激肽原(high molecular weight kininogen,HK)在大肠杆菌导致的脓毒症中的作用。方法生长到对数期的大肠杆菌用PBS清洗后重悬,对高分子量激肽原的基因敲除小鼠Kng1^(-/-)小鼠和野生型Kng1^(+/+)小鼠分别腹腔注射大肠杆菌,构建细菌感染模型,并观察小鼠的生存率;应用血平板对血液中细菌计数;H&E染色观察肺脏的病理变化;应用ELISA检测血浆中炎症因子蛋白水平的表达;应用实时定量PCR检测白细胞中炎症因子mRNA水平的表达。结果在大肠杆菌感染导致的脓毒症模型中,Kng1基因的敲除促进了小鼠死亡;Kng1^(-/-)小鼠血液中细菌数目明显高于Kng1^(+/+)小鼠;Kng1^(-/-)小鼠肺部病理切片与Kng1^(+/+)小鼠相比损伤严重;Kng1^(-/-)小鼠血浆中炎症因子蛋白水平的表达与白细胞中炎症因子mRNA水平的表达均高于Kng1^(+/+)小鼠。结论血浆高分子量激肽原在大肠杆菌导致的感染中起保护作用。

近亲婚配分别导致遗传性激肽释放酶原和高分子量激肽原缺陷症2个家系的遗传学分析

目的探讨2个近亲婚配分别导致遗传性激肽释放酶原(PK)和高分子量激肽原(HMWK)缺陷症家系的分子致病机制。方法选取分别于2021年12月3日和2022年6月16日就诊于温州医科大学附属第一医院的1个PK缺陷症家系(共4代10人)和1个HMWK缺陷症家系(共3代6人)作为研究对象。收集相关临床资料,检测先证者及其家系成员的相关凝血指标。提取受试者外周血基因组DNA后,对KLKB1和KNG1基因进行测序,并对候选变异进行生物信息学分析。本研究通过温州医科大学附属第一医院医学伦理委员会的审查(伦理号:KY2022-R193)。结果先证者A为29岁女性,与其弟弟血浆PK活性均极度降低(<1.0%)。先证者B为66岁男性,血浆HMWK活性极度降低(<1.0%)。测序结果发现,先证者A及其弟弟KLKB1基因第5外显子均存在c.417_418insCATTCTTA(p.Arg140Hisfs*3)纯合插入变异,其祖母、外祖母、父亲、母亲、妹妹和儿子均携带杂合插入变异,其外祖父和丈夫均为野生型;先证者B的KNG1基因第4外显子存在c.460C>A(p.Pro154Thr)纯合错义变异,其儿子携带杂合错义变异,家系其他成员均为野生型。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)相关指南,上述2个变异分别被评定为致病性(PVS1+PM2_Supporting+PM4)与可能致病性(PS4+PM2_Supporting+PP3+PP4)。结论KLKB1基因c.417_418insCATTCTTA(p.Arg140Hisfs*3)与KNG1基因c.460C>A(p.Pro154Thr)变异可能分别为2个家系PK活性与HMWK活性降低的遗传学病因。

PKSI-527对三氯乙烯致敏小鼠体内血浆激肽释放酶-激肽系统表达的影响

目的研究三氯乙烯致敏小鼠体内激肽释放酶-激肽系统（KKS）表达水平，探讨职业性三氯乙烯药疹样皮炎（ODMLT）的发病机制。方法将130只雌性6—8周BALB／c小鼠随机分成空白对照组、溶剂对照组、TCE处理组和TCE＋PKSI-527处理组：TCE＋PKSI．527处理组在17d和19d两次激发前24h腹腔内注射抑制剂PKSI-527；分别于末次激发后24h、48h、72h和7d处死动物，造模期间实时记录小鼠体重，计算脏器系数，ELISA法检测血浆前激肽释放酶（PK）、高分子量激肽原（HMWK）和缓激肽（BK）水平。结果TCE处理组的致敏率为40％，以PKSI-527干预后的致敏率为21．67％，TCE致敏组及TCE＋PKSI-527组体重与空白对照组相比均明显减少；TCE处理组小鼠48h、72h的肝脏系数明显高于空白对照组，而使用PKSI-527干预后小鼠肾脏系数和脾脏系数均有好转。TCE处理组48h、72h时致敏小鼠血浆中PK浓度明显高于溶剂对照组及相应的未致敏组，且在72h时点达到峰值，使用PKSI-527能够显著降低PK浓度。TCE处理组24h、48h致敏小鼠血浆中HMWK浓度明显高于溶剂对照组及相应的未致敏组；TCE＋PKSI-527处理组48h时HMWK浓度明显低于相应时段TCE致敏组。血浆BK的变化特点基本与PK和HMWK表达一致。结论KKS活化可能参与TCE小鼠致敏及脏器免疫损伤过程。