日本医蛭摄食前后不同组织中水蛭素基因(hirudin)的时空表达模式

【目的】探究日本医蛭在不同摄食阶段、各个组织(唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精/卵巢)中水蛭素基因(hirudin)的时空表达模式,为水蛭药材的科学合理利用提供理论依据。【方法】基于水蛭唾液腺转录组数据筛选结果及基因克隆获得的水蛭素基因序列信息,利用实时荧光定量PCR方法,对水蛭关键活性成分的编码基因hirudin在不同摄食阶段、不同组织中的表达量进行检测分析,研究该基因的时空表达模式。【结果】水蛭素基因(hirudin)在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精/卵巢组织中均有表达,且在唾液腺中的表达量显著高于其他组织;Hirudin基因在不同摄食阶段的唾液腺组织中表达结果显示,摄食后第2天表达量显著升高,之后随着摄食时间的推延而呈下降趋势;Hirudin基因在嗉囊、肠中的表达量呈先升高后下降趋势,分别于摄食后第1、第2天达到最高,之后会随着停食时间延长呈下降趋势,尤其是在摄食后第7、第8天的表达量呈显著性降低;Hirudin基因在皮肤组织中也有表达,并随着停食时间的延长呈先升后降趋势,最高峰出现在摄食后第2天;在精/卵巢组织中,摄食期间hirudin基因的表达量最高,与其他摄食阶段的表达呈显著性差异。【结论】水蛭素基因(hirudin)在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤和精/卵巢组织中均有不同程度的表达,在唾液腺中的表达量显著高于其他组织。摄食行为及食物刺激可能影响水蛭素基因(hirudin)的表达,在不同摄食阶段的表达量存在显著差异。研究结果可为水蛭药材的科学采收加工、提取部位的科学选取、合理入药提供理论依据和技术支撑,对未来水蛭药材资源的可持续利用具有重要的参考价值。

四种水蛭抗凝血酶作用的研究

本文研究了水蛭的抗凝血酶作用,并比较了4种提取方法对抗凝作用的影响。冷浸和温浸,抗凝活性强度为菲牛蛭>日本医蛭》两种宽体金线蛭。煎煮后,前两种的活性锐碱,而两种宽体金线蛭的活性几乎不变。

日本医蛭水肿病病原分离鉴定及敏感性试验

为了明确日本医蛭(Hirudo nipponia)发病的病因并筛选有效的治疗药物为新渔药研究提供新思路,采用生理生化特性分析、16S rRNA基因测序和构建系统发育树对细菌进行了鉴定;并通过药敏试验、最小抑菌浓度测定和棋盘式微量稀释试验测定了该病原菌对药物的敏感性和抗菌药物与天然化合物的联合抑菌作用。结果显示:该病原菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),对妥布霉素、氟苯尼考等药物敏感,对头孢拉定、阿莫西林、恩诺沙星等药物耐药。联合药敏试验发现恩诺沙星与异土木香内酯联合使用具有协同抑菌作用(FICI <0. 5)。结果表明,分离株JZ15062301是对日本医蛭具有致病性的多重耐药维氏气单胞菌,异土木香内酯和恩诺沙星联合用药为耐药性维氏气单胞菌的控制提供了新的思路。

饥饿及恢复喂食对日本医蛭肠道菌群多样性的影响

为了研究饥饿及恢复喂食对日本医蛭肠道微生物菌群的影响,采用高通量测序技术分析了正常组、饥饿30d、恢复喂食7d以及恢复喂食14d的日本医蛭肠道微生物菌群特征及多样性的变化。结果显示:日本医蛭核心菌群门水平上,主要集中于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes),属水平核心菌群有气单胞菌属(Aeromonas)、Mucinivorans属、拟杆菌属(Bacteroides)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)等。饥饿及恢复摄食,对气单胞菌属、Mucinivorans属在内的核心菌群多样性及丰度产生了一定的影响。本研究为揭示日本医蛭肠道菌群组成以及研究日本医蛭消化道微生物功能奠定了基础。

日本医蛭中一种新抗凝血蛋白质的仿生亲和纯化及鉴定

目的从日本医蛭中快速提取和纯化生物活性蛋白质。方法利用仿生亲和介质库进行配体筛选和1步纯化。结果从日本医蛭中纯化出了1种具有抗凝血活性的新型低丰度蛋白质,命名为NLP-1(New Leech Protein-1)。通过进一步分析,其相对分子质量为13800,蛋白回收率可达到69.2%,其在血浆中含量为0.02 mg/mL时即可产生明显的抗凝血现象。利用MALDI-TOF-TOF分析,在蛋白质数据库中未找到相似蛋白质或多肽。结论从日本医蛭中纯化出的NLP-1蛋白质是1种新型的抗凝血物质,具有很高的开发研究价值。

土鳖虫与日本医蛭提取物抗凝血酶活性的比较研究

目的研究土鳖虫提取物的抗凝血作用,并与日本医蛭抗凝活性做了比较,为土鳖虫的新药开发提供实验依据。方法采用凝血酶直接滴定法。结果鲜(干)土鳖虫提取物的抗凝血活性均很强,与日本医蛭相当。但土鳖虫和日本医蛭抗凝血酶活性成分对热稳定性有差异。结论土鳖虫中含有直接作用于凝血酶的成分,但不同于日本医蛭的抗凝血酶成分。

日本医蛭早期发育阶段的生长性能与生长模型分析

[目的]研究日本医蛭的生长性能及生长发育规律。[方法]对人工繁育的日本医蛭摄食习性及生长性能进行了分析,并利用Logistic、Gompetz、Von Bertallanffy 3种非线性生长模型对日本医蛭体重生长情况进行曲线拟合。[结果]日本医蛭的特定生长率随生长时间的延长而逐渐下降,幼蛭孵化后4 d喂食,生长率达到最高(10.99%/d),日本医蛭的体重随着投喂次数、日龄、摄食量的增加呈现上升趋势。3种生长曲线模型均能较好地拟合日本医蛭的生长曲线,其中以Gompertz曲线的拟合度最好(R2=0.999)。[结论]曲线模型对日本医蛭生长曲线的拟合和分析是可行的。通过生长曲线的拟合分析可及时掌握日本医蛭的生长发育规律,发现饲养管理中存在的问题。

日本医蛭和天目山蛭4种同工酶的比较研究

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳对日本医蛭和天目山蛭的酯酶 (ES)、苹果酸脱氢酶 (MDH)、过氧化物酶 (POX)、乳酸脱氢酶 (L DH) 4种同工酶共计 11个位点的 15个等位基因进行了分析 ,4种同工酶基因在 2种蛭中表达程度以及 LDH同工酶酶谱相似 ,但是日本医蛭比天目山蛭 ES同工酶多 2个位点 ,3个基因 ;MDH少 1个基因 ;POX同工酶多 2个位点 ,2个基因 ;LDH同工酶等位基因表达的亚单位类型和数目不同。同时分析了冬眠与非冬眠期日本医蛭 LDH同工酶活性差异的原因 ,为在分子水平研究蛭类分类、不同环境温度下酶的活性变化等提供和积累新的生物学资料。

不同体质量规格的日本医蛭适宜越冬密度与繁殖性能研究

为了探究不同体质量规格的日本医蛭越冬的适宜密度以及对卵茧、幼苗的影响,选用不同体质量规格(A组为1 g,B组为2 g,C组为3 g,D组为4 g,E组为混合规格体质量组)的日本医蛭于面积为0.5 m^2的自制越冬池中越冬繁殖,记录越冬后日本医蛭存活数、产茧数量及卵茧孵化情况.结果显示,A-D组最佳越冬密度分别为3.174 kg/m^2,3.188 kg/m^2,2.904 kg/m^2和3.168 kg/m^2.A-D组平均产茧率为1.15,1.21,1.20,1.20.卵茧质量、幼苗平均质量随日本医蛭越冬规格增加而增加,出苗数也相应增多.结果表明,生产中为了获得较大规格的幼苗,应选择相对较大的亲本进行越冬繁殖,且单位面积总投放量控制在3.0~3.5 kg时,存活率最高,平均产茧率最大.

基于高通量测序的日本医蛭转录组及SSR序列分析

【目的】分析日本医蛭在不同温度处理下,其转录组和简单重复序列标记(simple seauence repeats,SSR)信息。【方法】应用高通量测序技术,对不同温度下日本医蛭不同组织分别进行转录组测序,采用MISA软件对unigene进行SSR分析。【结果】共获得125.08 G有效数据,平均错误率为0.03%。经Trinity软件混合拼接后共得到202 570条transcripts和52 206条unigene,平均长度分别为1 826 bp和1 390 bp,最大长度均为30 853 bp。将unigene与公共数据库进行比对,得到注释的unigene为29 352条,占总数的56.22%。对unigene进行SSR检测,共检测到29 926个SSR位点,发生频率是57.32%。SSR的核苷酸基元重复数都在5次以上,主要集中在5~10次(86.27%)之间,以三核苷酸和单核苷酸重复SSR为主,所占比例分别为74.07%和15.10%,核苷酸重复基元中,以A/T (4 255,14.22%)为主,在三核苷酸重复基元中,ATC/ATG (9 496,31.73%)所占比例最高。不同温度下日本医蛭转录组基因表达量差异比较数据显示,样本间表达差异基因共1 603个。【结论】不同温度处理后日本医蛭的SSR发生频率较高,可为日本医蛭筛选分子遗传标记提供大量基础数据。

两种吸血蛭类光感受器的超微结构

运用透射电镜技术对采自浙江的日本医蛭和天目山蛭的光感受器—眼的超微结构进行了比较研究.发现两者的主要差别在于前者眼的色素杯浅,且宽度与深度较为接近,透光体微绒毛可卷曲;后者眼的色素杯深,其深度明显大于宽度,透光体微绒毛未见卷曲.天目山蛭感光细胞中由微绒毛组成的感光膜表面积远大于日本医蛭,因此陆生蛭类的感光能力比水生种类强,这与陆地环境的复杂性有一定关系.

幼虫、青年和成年日本医蛭不同生长阶段差异表达基因比较分析

【目的】筛选出调控日本医蛭生长发育的相关基因,揭示其生长发育、繁殖和抗凝分子机制,为后期开展日本医蛭养殖、生长发育及相关功能基因研究提供科学依据。【方法】以幼虫期(孵化10 d以内,HNL)、青年虫期(孵化后2个月左右,HNY)和成年虫期(孵化后2年左右,HNA)的日本医蛭为研究对象,利用Illumina HiSeq 4000平台对构建的cDNA文库进行转录组测序,按错误发现率(FDR)<0.05和|log2FC|>1的原则筛选差异表达基因(DEGs),并进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析。【结果】使用3个时期的样本构建24个cDNA文库,共产生541124257条原始序列(Raw reads),经Fastp质量控制及RNA-Seq组装,共获得20430个mRNAs转录本,并注释出88个新的mRNAs转录本。通过对日本医蛭不同生长阶段进行两两对比,共获得1348个差异表达基因,其中,在幼虫期—青年虫期(HNL vs HNY)中获得238个差异表达基因,在幼虫期—成虫期(HNL vs HNA)中获得976个差异表达基因,在青年虫期—成虫期(HNY vs HNA)中获得763个差异表达基因。幼虫期—成虫期的差异表达基因主要富集蛋白水解、肌球蛋白复合体、细胞骨架、几丁质代谢过程及对伤害的反应等GO功能条目上,以及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成、丙烯酰胺转移酶等KEGG信号通路上。说明日本医蛭幼虫在生长过程中大量摄食并通过消化、代谢和合成物质为自身发育提供能量,而成年日本医蛭发育成熟后与其生长发育相关的代谢过程下调,且已适应环境,对于环境刺激的敏感度也有所降低。【结论】在幼虫期—成虫期(HNL vs HNA)获得的976个差异表达基因中,上调差异表达基因主要与肌肉发育相关,而与性腺发育或产卵调节及神经发育相关的差异表达基因具有明显周期特异性,其表达变化均与日本医蛭的生长发育有关。水蛭素和抗凝相关基因在青年期高表达,因此开展水蛭抗凝血能力研究时宜选用青年日本医蛭。

不同养殖地区日本医蛭的生长及抗凝血活性研究

[目的]探究不同养殖地区日本医蛭的生长和抗凝血活性。[方法]以野外捕获(江苏)的日本医蛭为对照组,以重庆、广西、广东养殖的日本医蛭为试验组,进行人工养殖试验。[结果]日本医蛭能在不同地区进行人工驯养;人工养殖的日本医蛭最低存活率为(73.50±0.51)%,120日龄最低体重为(2.9843±0.0221)g,与野外捕获的日本医蛭体重存在显著差异。日本医蛭在出苗30 d内体重增长率最大,死亡率最高,均随着养殖时间的延长而降低。人工养殖日本医蛭的抗血凝活性为168 U/g,与野生日本医蛭(275 U/g)存在显著差异。[结论]日本医蛭能在不同地方引种养殖,且其抗凝血活性能达到《中国药典》规定标准。

温度和密度对日本医蛭繁殖的影响

在实验室网箱中,研究温度(24±1)℃和(20±1℃)与密度(200尾/箱和100尾/箱)对平均体质量1g左右的日本医蛭Hirudo nipponia亲蛭交配率、减重率、产茧数量和体质量的影响,比较卵茧质量(<0.05g、0.05~0.1g和>0.1g)对孵出仔蛭数量的影响。结果表明:温度(24±1)℃、密度100尾/箱时亲蛭交配率(86±0.06)%和平均产茧量(0.87±0.14)枚/尾最高;亲蛭产茧后平均体质量下降(32.1±0.059)%;繁殖期间共收集卵茧870枚,孵化率87.47%;平均卵茧质量为(0.11±0.009)g(变化范围0.03g^0.25g);密度和温度对产茧量的影响极显著(P<0.01),对卵茧平均质量和长短径的影响不显著(P>0.05);(24±1)℃组亲蛭的产茧时间比(20±1)℃组缩短10~15d,单日卵茧最高收集量为43枚,(20±1)℃时单日最高收集量24枚;卵茧共孵出仔蛭5 648尾,随着卵茧质量增加产出的仔蛭数量和质量也增加。

饥饿与重摄食对野生日本医蛭肠道菌群结构的影响

采用高通量测序技术,对饥饿和重摄食状态下的日本医蛭肠道菌群结构和丰度进行研究。结果显示:9个样品共获得有效序列562384条,可聚类到769个分类操作单元(OTUs)。饥饿组、重摄食7 d组和重摄食21 d组样品中分类操作单元(OTU)数目分别为444个、664个和440个,其中共有OTU个数为289个。在重摄食7 d后肠道微生物多样性指数呈上升趋势,而在重摄食21 d后多样性指数呈下降趋势。在门水平上,日本医蛭肠道有3个优势菌门,分别为拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门;在重摄食后,拟杆菌门的相对丰度呈现先下降后升高的趋势,变形菌门和厚壁菌门的相对丰度则相反。在重摄食7 d后,共有8个相对丰度显著增加的菌群,均属于变形菌门。其中,气单胞菌属和预研菌属具有较大的丰度。结果表明,摄食血液与日本医蛭肠道菌群多样性和结构组成之间存在着密切的联系。本研究旨在为下一步研究日本医蛭肠道消化血液的机制以及开发配合饲料奠定基础。

蚂蟥和水蛭种间遗传变异和系统关系的ITS序列分析

目的:为了阐明蚂蟥Whitmania pigra,水蛭Hirudo nipponia种间遗传分化系统关系。方法:运用ITS测序分析我国不同地区蚂蟥W.pigra、水蛭H.nipponia核糖体ITS碱基序列差异,用MEGA4.0软件中的MP法构建的分子进化树。结果:蚂蟥和水蛭平均总ITS序列长度在857.2～861.2 bp,其碱基A,T,G,C的平均分别为25.12%,28.28%,17.34%,29.29%。GC含量明显高于AT含量。通过对蚂蟥、水蛭ITS基因片段遗传特征的研究发现其种内变异很小,在14个群体中有45个位点发生转换。MP系统树将14个种群蚂蟥和水蛭分为两大类群。结论:蚂蟥和水蛭的变异类型可能为种内变异为主。同时发现,基于DNA序列的蚂蟥及水蛭的系统分类结果与分类学的分类结果不完全一致,可能是由ITS序列在进化过程中发生了少量位点的变异,如碱基之间的转换、颠换和缺失等造成的。

微芯片电泳结合多重PCR法在中药材水蛭品种特异性鉴定中的应用

目的:通过特异性引物的聚合酶链式反应(PCR)法结合微芯片电泳检测的方法,特异性鉴别宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3种水蛭品种。方法:针对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3个品种的线粒体同源序列,设计区分正伪品水蛭以及分别鉴定3个品种水蛭样品的特异性引物;通过PCR和微芯片电泳检测的方法验证所设计引物的特异性;将验证得到的特异性引物进行整合,建立3个品种的特异性引物用于三重PCR的方法。结果:确定了用于区分宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭3个品种中正伪品的特异性引物KA;确定了宽体金线蛭特异性引物KT,日本医蛭特异性引物RI,菲牛蛭特异性引物FN;建立了3种特异性引物进行三重PCR鉴别3个品种水蛭药材的方法。结论:通过特异性引物结合三重PCR的方法,可以同步鉴定宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭的人为预混样品,鉴定结果准确,且用于三重PCR的特异性引物不存在引物之间相互结合或非特异性扩增的现象。

生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性测定的研究

目的将生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性的测定,探讨反映水蛭生物活性的质量控制方法。方法采用肝素钠作为对照品,选择活化部分凝血酶时间值作为抗凝活性评价依据,对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭的抗凝活性进行测定,测定结果分别用标准曲线法和生物检定统计法计算。结果 4种水蛭活性部分凝血酶时间法的量效关系曲线与肝素的量效关系曲线类似,突跃范围呈平行关系,上述特点符合生物检定的要求,以肝素钠作为标准品,采用生物检定技术活性部分凝血酶时间法测定水蛭等的抗凝活性是可行的。结论活化部分凝血酶时间值可以全面反映水蛭的抗凝血作用,测定结果对临床使用更具指导意义。生物检定技术应用于中药质量评价,是对现有中药质量标准控制方法良好的补充。

温度骤变对日本医蛭肠道菌群的影响

目的研究急性温度应激条件下日本医蛭肠道微生物菌群多样性的组成及变化。方法选取健康日本医蛭200尾,设置对照组与试验组(各100尾),对照组25℃水体温度饲养、试验1组养殖水体温度急剧降温(30℃→4℃)、试验2组养殖水体温度急剧升温(4℃→25℃)。采用高通量测序技术分别研究对照组和试验组的日本医蛭肠道菌群特征及多样性变化。结果门分类水平上,日本医蛭肠道核心主导菌群为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes);属分类水平上,温度急剧变化后,气单胞菌属(Aeromonas)丰度显著增加,Mucinivorans丰度显著减少,脱硫弧菌属(Desulfovibrio)丰度减少。结论温度骤变对日本医蛭肠道主导菌多样性组成及丰度产生了一定的影响,有害致病菌增加,有益菌减少,从而最终导致水蛭出现病态及死亡现象。本研究对于指导人工养殖实践、日本医蛭药材资源可持续利用以及深入开展肠道微生物分子调控机制研究都具有重要的理论和实践意义。