组氨酸标签位置对重组鹰嘴豆孢克鲁维酵母外切菊粉酶活性的影响

为了研究His_6-tag标签位置对鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857外切菊粉酶(Kluyveromyces cicerisporus CBS4857 exo-inulinase,KcINU1)酶活性的影响,实验首先根据Swiss-Model构建的KcINU1三维模型预测了组氨酸标签在KcINU1的位置,然后将编码His_6-tag的基因通过PCR方法分别引入到kcINU1的N端和C端,并将重组的kcINU1基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA,重组质粒进一步经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X-33中,最后用甲醇诱导进行分泌表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,DNS去进行外切菊粉酶的活性测定。结果显示,实验中成功表达了具有活性的、His_6-tag标签位置不同的重组蛋白,并且N-His_6-KcINU1糖基化程度比KcINU1-His-C高,后者的比活是前者的82.2%,表明N端携带His_6-tag标签不影响蛋白的糖基化修饰,可以保持较高的酶活。该研究为获得高活性且便于分离纯化的重组KcINU1奠定了基础,对糖苷水解酶32家族标签位置的选择具有指导意义。

瑞替普酶在大肠杆菌中的表达与活性测定

目的构建带组氨酸标签(His_6·Tag)的瑞替普酶(Reteplase,r-PA)的表达载体,并在大肠杆菌中表达和活性检测。方法通过引物设计在r-PA基因5’端加上组氨酸标签(His_6·Tag)。克隆到pET23a原核表达载体中,转化E．coli BL21 (DE3),进行IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,用FAPA法测定其纤溶活性。结果构建的原核表达载体经PCR、酶切鉴定、测序后正确。表达产物分子质量39kDa,为r-PA特异性条带,纯化产物具有纤溶活性。结论成功地在大肠杆菌表达了带有标签的r-PA,简化了下游分离纯化和复性步骤。

含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达

以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因hemB。将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28 a中构建成表达载体。表达蛋白的N端含有6个组氨酸标签。构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,重组蛋白获得高效表达。SDS-PAGE检测到41 kD的特异带,表达菌株的上清检测到ALAD的比活为337 mU.mg-1,表明组氨酸标签不显著影响酶活。