YAP通过调控EEF1A2的表达促进肝癌细胞的迁移和侵袭

目的:研究Yes相关蛋白(yes-associated protein,YAP)通过调控真核细胞翻译延伸因子1A2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,EEF1A2)的表达促进肝癌细胞迁移和侵袭的机制。方法:通过建立YAP和EEF1A2干扰表达或过表达的SMMC-7721和SK-HEP1肝癌细胞模型,采用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的改变;应用反转录和实时定量PCR(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western blot法检测相关基因的mRNA和蛋白表达水平;利用染色质靶向酶切检测(cleavage under targets and release using nuclease,CUT&RUN)-qPCR实验检测YAP能否与EEF1A2基因的启动子序列结合。结果:EEF1A2在肝癌组织中高表达,并与肝癌细胞的迁移能力呈正相关;EEF1A2可以促进低迁移能力的SMMC-7721细胞和高迁移能力的SK-HEP1细胞迁移和侵袭,调控细胞中上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志物Snail和E-cadherin的表达;YAP可以上调EEF1A2的表达而促进肝癌细胞的迁移和侵袭;CUT&RUN-qPCR实验结果显示YAP可以与EEF1A2基因的启动子序列结合。结论:YAP可以通过与EEF1A2基因的启动子序列结合,促进EEF1A2的表达,进一步促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

EEF1A2基因慢病毒表达载体的构建及慢病毒表达系统的建立

利用PCR方法合成EEF1A2的基因全长,经NotⅠ和NsiⅠ酶切后克隆到慢病毒载体pGLV5-EF1a-EGFP/Puro上。构建的重组质粒pGLV5/EEF1A2经PCR、酶切及测序鉴定正确后,利用慢病毒表达系统(pGLV5 Lentiviral Expression Systems),将重组质粒与包装系统质粒(pVSV-G,pGag/Pol,pRev)4质粒共转染293T细胞,收集培养上清并感染人胰腺癌SW1990细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株EEF1A2/SW1990。Real-time PCR和West-ern blot检测结果显示EEF1A2在EEF1A2/SW1990细胞中表达较原代细胞明显增高(P<0.05),MTT结果显示EEF1A2/SW1990细胞的增殖能力亦较原代细胞显著增强(P<0.05)。成功构建了EEF1A2基因的慢病毒载体质粒pGLV5-EEF1A2及其慢病毒表达系统,并筛选出稳定过表达EEF1A2的人胰腺癌细胞株EEF1A2/SW1990。

靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2可抑制胰腺癌细胞BxPC-3体外迁移和侵袭

目的:探讨靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2(homo sapiens eukaryotic translation elongation factor 1alpha 2,EEF1A2)对胰腺癌BxPC-3细胞体外迁移和侵袭的影响及其可能的分子机制。方法:应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测4种胰腺癌细胞株中EEF1A2的mRNA和蛋白表达水平。将EEF1A2-小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和阴性对照siRNA转染到BxPC-3细胞中,随后采用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测EEF1A2的mRNA及蛋白表达,应用体外划痕和Transwell侵袭实验分别检测BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中p-Akt和总Akt蛋白的表达变化。结果:4种胰腺癌细胞株中除SW1990细胞呈EEF1A2低表达外,BxPC-3、Patu8988和Panc-1细胞均呈EEF1A2高表达。EEF1A2-siRNA转染BxPC-3细胞48 h后,EEF1A2 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照siRNA转染的细胞和空白对照细胞明显降低(P<0.01)。EEF1A2-siRNA转染组BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于阴性转染对照组和空白对照组(P<0.05)。EEF1A2-siRNA转染组细胞中Akt的磷酸化水平明显低于对照组细胞(P<0.05),而总Akt蛋白表达水平未显著改变(P>0.05)。结论:siRNA干扰下调EEF 1A 2基因表达可明显抑制胰腺癌BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭,其机制可能与EEF1A2调控Akt信号通路有关。

靶向封闭EEF1A2对胰腺癌细胞凋亡的作用及其机制研究

目的 观察靶向封闭EEF1A2基因对胰腺癌细胞株凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 体外转录制备2对EEF1A2 siRNA,应用脂质体技术转染胰腺癌细胞株BxPC-3,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后EEF1A2基因表达的变化.运用膜联蛋白V/碘化丙啶法检测细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测细胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9、聚二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP）细胞色素C和Bid等凋亡相关蛋白表达变化.结果 2对EEF1A2 siRNA均能有效降低BxPC-3细胞中EEF1A2的表达,其中第2对siRNA静默效果更佳,EEF1A2在mRNA和蛋白质水平的表达抑制率均达75%左右.抑制BxPC-3细胞中EEF1A2的表达后,细胞的早期凋亡率为15.28%±3.65%,显著高于阴性对照组的10.11%±3.05%和空白组的9.41%±4.14%,同时伴随出现caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP和Bid的蛋白活化增强和细胞色素C表达增加.结论 抑制EEF1A2表达能明显诱导胰腺癌细胞BxPC-3的凋亡,而死亡受体途径和线粒体途径的激活可能均参与凋亡的发生.

人类真核翻译延长因子1A2过表达对胰腺癌SW1990细胞体外侵袭及体内转移的影响

目的探讨人类真核翻译延长因子1A2（EEFlA2）过表达对人胰腺癌SW1990细胞体外侵袭和肺转移潜能的影响。方法通过携带EEFlA2的慢病毒感染人胰腺癌SW1990细胞建立EEFlA2稳定过表达的SW1990／EEFlA2细胞株及空质粒对照的SW1990／GFP细胞株，并以亲本SW1990细胞作为空白对照。采用实时PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞EEFlA2mRAN和蛋白的表达。应用Transwell小室检测细胞的体外侵袭能力。通过裸鼠尾静脉注射癌细胞方法构建肺转移模型，8周后观察并计数肺表面的转移结节。结果SW1990／EEFlA2细胞EEFlA2mRNA相对表达量为3．252±0．344，显著高于SW1990／GFP细胞的1．000±0．060及亲本细胞的0．944±0．041（t值分别为2．255、2．305，P值均〈0．01）；EEFlA2蛋白表达量为0．833±0．050，显著高于SW1990／GFP细胞的0．247±0．035及亲本细胞的0．273±0．041（t值分别为0．572、0．559，P值均〈0．01）；穿膜细胞数为（60±4）个，显著多于SW1990／GFP细胞的（33±4）个和亲本细胞的（26±3）个（t值分别为31．33、34．78，P值均〈0．01）；裸鼠肺转移结节显著多于SW1990／GFP细胞及亲本细胞组（5／5比1／5、1／5，P值均〈0．05）。结论EEFlA2过表达可以明显增强胰腺癌SW1990细胞的体外侵袭和肺转移能力。