鸡毒支原体热休克蛋白GrpE粘附特性的鉴定

鸡毒支原体(MG)脂质相关蛋白(LAMPs)的粘附特性在感染宿主细胞中起重要的作用,本实验室前期利用快速蛋白液相色谱和质谱鉴定MG的grp E基因编码的GrpE蛋白为热休克蛋白。为进一步鉴定GrpE蛋白是否具有粘附特性,本研究通过原核表达MG株grp E基因,并利用表达纯化的重组蛋白GrpE(rGrpE)免疫BALB/c小鼠。制备抗GrpE的单克隆抗体(MAb)。通过亚细胞定位,结果显示GrpE定位于细胞表面。通过激光共聚焦显微镜观察到rGrpE对DF-1细胞具有明显的粘附作用,而且利用抗GrpE的MAb能够特异抑制MG膜蛋白对DF-1细胞的粘附。此外,夹心ELISA和流式细胞术试验结果也表明制备的MAb能够显著抑制MG膜蛋白对DF-1细胞的粘附,并呈剂量依赖关系。上述结果表明热休克蛋白GrpE是MG的一种新的具有粘附特性的蛋白。

谷氨酰胺对免疫细胞的影响研究进展

谷氨酰胺作为一种条件性必需氨基酸,在动物处于特殊生长阶段如幼龄期或在应激期间都显示出明显的免疫促进作用。动物免疫力的高低直接取决于各种免疫细胞如淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的生长情况和免疫应答能力,谷氨酰胺的免疫促进作用与影响免疫细胞生长和免疫应答能力的发挥密切相关。本文就谷氨酰胺与免疫细胞增殖、分化、凋亡、分泌和热休克反应的研究进展做一综述。

不同海拔高度大鼠严重烫伤延迟复苏心肌组织ET-1和HSP_(70)的变化

目的:探讨高原地区不同海拔高度(3 840 m,1 517 m)大鼠严重烫伤后延迟复苏心肌组织内皮素-1(ET-1)与热休克蛋白70(HSP70)的变化规律。方法:雄性W istar大鼠240只随机分为延迟复苏组(DFR,n=100)、即时复苏组(IFR,n=120)和对照组(CG,n=20),建立总体表面积30%的Ⅲ度烫伤模型,分别于伤后1、6、12、24、72和168 h取材。应用免疫组化方法检测心肌组织ET-1和HSP70的含量。结果:ET-1在心肌细胞浆及血管内皮组织表达高于对照组,随海拔梯度上升ET-1表达增高,海拔高组高于海拔低组,DFR组高于IFR组(P<0.01);HSP70表达在海拔低者差异早于海拔高者(P<0.01)。结论:高原地区大鼠严重烫伤后随海拔升高,心肌保护物质消耗增多,ET-1/HSP70调节变化更加显著。

维生素E在青年和老年大鼠肾脏缺血/再灌注损伤中的作用

目的:探讨维生素E(VE)在青年和老年大鼠肾缺血/再灌注损伤(RI/RI)中的作用。方法:采用夹闭双侧肾动、静脉45min后恢复血流的方法制作RI/RI模型,测定血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)浓度,免疫组化检测肾皮质热休克蛋白70(HSP70)表达。流式细胞术检测肾皮质细胞凋亡率。结果:缺血/再灌注(I/R)后BUN、Scr含量明显升高,老年I/R组MDA含量高于青年I/R组,SOD含量低于青年IR组,HSP70、NO以及肾皮质细胞凋亡率高于control组;VE可显著降低RI/RI大鼠BUN、Scr、MDA、iNOS水平,升高NO和SOD水平,增加HSP70的表达,降低肾皮质细胞凋亡率。结论:VE可通过促进肾组织HSP70的表达,增加NO和SOD水平,提高大鼠体内清除自由基的能力,从而对青、老年大鼠肾缺血/再灌注损伤(RI/RI)起到一定的保护作用。

贝氏柯克斯体热休克蛋白B基因的克隆与表达

目的克隆贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)热休克蛋白B(HspB)基因并在大肠杆菌细胞内高效表达。方法采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增出HspB的基因片段,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组表达质粒pQE30/hspB,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生HspB重组蛋白。结果(1)PCR扩增获得长约1556bp的hspB基因片段。(2)SDS-PAGE证明,HspB重组蛋白的分子量为53.7kDa。(3)经薄层扫描分析,表达蛋白约占全菌体蛋白的71.2%。结论贝氏柯克斯体hspB基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为Q热疫苗的研制提供了一易于获得的候选蛋白分子。

牛分支杆菌广西分离株Hsp 65基因的克隆及序列分析

利用牛分支杆菌Hsp 65基因特异性引物,对2株牛分支杆菌广西分离菌株进行PCR扩增,产物经纯化后与载体pMD-18连接,然后转染大肠埃希菌DH5α。提取转染后大肠埃希菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNA Star MegAlign对Hsp 65基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的牛分支杆菌的Hsp 65基因进行比较。结果显示,广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列,其核苷酸序列同源性在98.7%～100%之间,推导的氨基酸序列同源性在98.4%～100%之间。表明广西分离的菌株与参考的其他牛分支杆菌菌株的Hsp 65基因差异不大,说明牛分支杆菌分泌蛋白Hsp 65基因十分保守,从而为检测跟踪菌株的变异,研制牛分支杆菌亚单位基因疫苗奠定基础。

阿司匹林对脑缺血-再灌注损伤不同时段的细胞保护作用

目的观察阿司匹林(ASA)对大鼠脑缺血-再灌损伤(CIRl)24h和72h的细胞保护作用。方法线栓法制作局部大脑缺血2h、再灌24h或72h模型,观察60mg.kg-1阿司匹林对脑损伤面积、脑皮层正常锥体神经元密度、脑细胞凋亡及热休克蛋白70表达的影响。TTC染色测定脑损伤面积,HE染色观察锥体神经元密度,TUNEL法检测脑细胞凋亡,免疫组化法测定热休克蛋白70表达。结果CIRl24h,脑损伤面积、脑细胞凋亡数目及热休克蛋白70表达均增加,正常锥体神经元密度下降。阿司匹林明显缩小脑损伤面积,提高正常锥体神经元密度,抑制脑细胞凋亡,对热休克蛋白70表达无明显影响。CIRl72h时,与24h相比,脑损伤面积、脑细胞凋亡数目及热休克蛋白70表达均降低,正常锥体神经元密度无明显改变。阿司匹林明显缩小脑损伤面积,提高正常锥体神经元密度,抑制脑细胞凋亡,热休克蛋白70无阳性表达。结论阿司匹林对脑缺血-再灌损伤24h和72h,通过抑制凋亡和应激反应发挥明显的细胞保护作用。

海水浸泡对失血性休克并腹部开放伤实验大鼠肿瘤坏死因子α及肠道热休克蛋白HSP-70的影响

目的探讨海水浸泡失血性休克并腹部开放伤对实验大鼠血浆肿瘤坏死因子α(TNFα-)和肠道热休克蛋白HSP-70水平变化的影响。方法建立失血并腹腔海水浸泡伤动物模型。实验大鼠随机分为对照组(n=6)、失血创伤组(n=14)、失血创伤海水浸泡组(n=14),失血创伤组为单纯失血性休克并腹部开放伤,失血创伤海水浸泡组将动物致伤后置入人工配置的海水中,于伤前和浸泡后30m in及1,1.5,3 h取血测定TNFα的变化,取肠道组织测定HSP-70的表达。结果失血创伤海水浸泡组血中TNFα较失血创伤组伤后明显升高并且高峰出现时间明显提前,肠道损伤病理变化明显重于失血创伤组,肠道组织中HSP-70含量在创伤早期显著升高,后又明显降低。结论TNFα-的过度表达在失血性休克并腹部开放伤后海水浸泡的病理生理变化中起重要作用,肠道组织细胞中HSP-70的异常表达在肠道组织细胞的应激反应机制中,可能有重要的意义。

Hsp90抑制TNFα诱导的细胞凋亡及线粒体细胞色素c的释放

目的应用热休克蛋白90(Hsp90)过表达系统探讨Hsp90是否抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的细胞凋亡及线粒体细胞色素c的释放。方法采用电穿孔技术建立稳定过表达Hsp90的细胞克隆,应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察TNFα和放线菌酮(CHX)诱导的细胞凋亡。应用W estern b lotting方法检测细胞色素c的变化。结果相差显微镜观察Hsp90过表达细胞与对照细胞相比悬浮细胞较少(分别为18%和41%),PBS冲洗后剩余黏附细胞较多。应用共聚焦显微镜进行TUNEL测定结果显示大部分对照细胞发生凋亡,相对较少的Hsp90细胞发生凋亡。W estern b lotting检测Hsp90细胞中细胞色素c的表达与对照组相比明显减少。结论Hsp90过表达抑制TNFα诱导的细胞凋亡及线粒体细胞色素c释放,提示其在凋亡信号传导通路线粒体水平发挥抑制作用。

川芎嗪预处理对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨川芎嗪预处理与缺血预适应对大鼠视网膜缺血再灌注损伤是否具有相似的保护作用,以及联合应用川芎嗪预处理和缺血预适应能否进一步加强视网膜对缺血的耐受性。方法选取健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠70只,采用前房灌注法建立大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型,随机分入假手术组、缺血再灌注组、川芎嗪预处理组、5min缺血预适应组(缺血预适应组)和川芎嗪预处理+缺血预适应组(联合组),每组14只。川芎嗪预处理组大鼠在视网膜缺血再灌注损伤前24h给予川芎嗪80mg/kg腹腔内注射,每8h1次,共3次;缺血预适应组大鼠在视网膜缺血前24h给予5min缺血预适应(行前房穿刺,抬高0.9%氯化钠注射液瓶,只维持5min);联合组大鼠在视网膜缺血前24h给予5min缺血预适应,其余操作同川芎嗪预处理组;假手术组大鼠右眼行前房穿刺,不做缺血再灌注;缺血再灌注组大鼠仅做缺血再灌注处理,不予其他处理。分别于光学显微镜和透射电子显微镜下观察大鼠视网膜组织结构,检测视网膜超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和热休克蛋白(HSP)70表达水平。结果再灌注24h时,光学显微镜和透射电子显微镜下可见川芎嗪预处理组、缺血预适应组和联合组大鼠的视网膜损伤程度较缺血再灌注组轻,其中联合组大鼠视网膜损伤程度最轻。缺血再灌注组的SOD活性显著低于其他4组(P值均<0.05),假手术组的SOD活性显著高于其他4组(P值均<0.05),缺血预适应组和川芎嗪预处理组均显著低于联合组(P值均<0.05)。缺血再灌注组的MDA含量显著高于其他4组(P值均<0.05),假手术组的MDA含量显著低于其他4组(P值均<0.05),缺血预适应组和川芎嗪预处理组均显著高于联合组(P值均<0.05)。再灌注24h时,假手术组HSP70的光密度(D)值显著低于其他4组(P值均<0.05),缺血再灌注组显著低于缺血预适应组、川芎嗪预处理组和联合组(P值均<0.05),缺血预适应组和川芎嗪预处理组均显著低于联合组(P值均<0.05)。缺血预适应组与川芎嗪预处理组间SOD活性、MDA含量和HSP70的D值的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论川芎嗪预处理与缺血预适应一样,对视网膜缺血再灌注损伤具有保护作用,缺血预适应与川芎嗪预处理联合应用可进一步加强视网膜对缺血损伤的耐受性。

园艺植物高温逆境生理研究进展

概述了园艺植物在高温逆境下细胞膜热稳定性、热激蛋白诱导、水分状况、氮素代谢、内源激素等一系列生理生化变化 ,阐明了高温逆境对光合作用和呼吸作用的影响 ,分析了耐热与感热品种间细胞结构的差异 ,为耐热品种筛选奠定了基础 ,并对今后此领域的研究方向和应用前景进行了讨论。

不同湿度高温环境下急性大强度运动应激前后人体血浆游离HSP72浓度变化

目的:观察不同湿度高温环境下急性大强度运动前后人体血浆游离HSP72浓度变化。方法:随机挑选10名有训练经历的大学生(平均年龄21.8岁),进行4次高温下递增负荷大强度力竭性跑台运动,运动环境相对湿度(RH)分别设定为20%、40%、60%、80%,温度均为33℃,每次运动间隔一周。分别用电子体温计和红外体温计测定运动前后口腔温度和体表温度,计算平均体表温度(mean skintemperature,MST),运动前后抽取静脉血肝素抗凝分离血浆,采用ELISA法测定血浆HSP72浓度。结果:运动后口腔温度和MST显著升高(P<0.01),20%RH条件下运动后口腔温度显著低于60%RH和80%RH(P<0.01),运动后MST变化为20%RH<40%RH<60%RH<80%RH,且不同相对湿度间两两相比有显著性差异(P<0.01),运动后MST与相对湿度存在明显线性关系(r2=0.79,P<0.01)。除40%RH条件外,其他相对湿度条件下大强度运动后血浆HSP72均明显升高(P<0.05)。结论:高温高湿环境中运动,湿度增加加剧了体表温度的升高,运动热应激促使血浆HSP72升高,可能对机体起全身性作用。

热空气处理对杨梅果实采后活性氧代谢和热激蛋白合成的影响

研究热空气处理对杨梅果实采后活性氧代谢以及热激蛋白合成的影响。以48℃热空气处理杨梅果实3h,随后于(1±1)℃贮藏12d,并每隔3d测定果实腐烂率,膜脂氧化指标脂氧合酶(LOX)活性,活性氧代谢相关酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性以及超氧阴离子自由基(O-2.)和羟自由基(.OH)生成量,并同时检测热激蛋白(HSP)合成水平。结果表明,热处理可显著延缓果实贮藏期间SOD、CAT和APX活性的下降,诱导HSP的合成,从而抑制O-2.和.OH的积累和LOX活性的上升,减轻了过量活性氧自由基对细胞膜的损害。热空气处理延缓杨梅果实采后衰老并减少腐烂的机制与其平衡活性氧代谢和诱导热激蛋白的合成密切相关。

热习服对中长跑运动员湿热环境下运动体液调节激素及Hsp70的影响

目的:探讨热习服对湿热环境下运动机体体液调节激素ALD、AVP、ANP、NE及Hsp70的影响。方法:16名中长跑运动员随机分为热习服组(HA)和对照组(HC),每组各8人;HA组先进行10天的热习服方案,使机体产生热习服,然后进行一次33℃、80%RH湿热环境下的40min、70%VO2max运动强度的热负荷运动;HC组不经过热习服阶段,直接进行一次同于热习服组的热负荷运动。热负荷运动前后测试实验对象的热应激的生理学指标及体液调节激素ALD、AVP、ANP、NE及Hsp70的水平,观察两组实验对象测试指标在热负荷运动前后的变化。结果:热负荷运动后,HA组和HC组核心温度和心率均非常显著性升高(P<0.01),出汗率无显著变化;HA组热负荷运动后的核心温度和心率水平比对照组低、出汗率水平比对照组高,但两组间差异无统计学意义。与运动前相比,HA组和HC组热负荷运动后红细胞压积非常显著性升高(P<0.01)。与运动前相比,HA组和HC组运动后ALD和NE非常显著性升高(P<0.01),AVP显著性升高(P<0.05),ANP显著性降低(P<0.05),Hsp70非常显著性升高(P<0.01),但组间检验均未见显著性差异(P>0.05)。结论:体液调节激素对维护热负荷运动过程中的机体水盐代谢和平衡发挥着重要作用;热习服一定程度上降低了机体对热负荷运动应激的生理生化热调节反应,提高了机体适应运动热环境的能力。

高温高湿环境犬肢体火器伤后HSP70含量变化的实验研究

目的探讨高温高湿环境下肢体火器伤后热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）含量变化的规律。方法将１８只犬随机分为高温 高湿组、常温常湿组、热适应组，分别在致伤前及火器伤后ｌ、３、４、６、８、１０、１４、１８、２４ｈ检测外周血淋巴细胞和伤道骨骼 肌中ＨＳＰ７０含量。结果淋巴细胞中ＨＳＰ７０含量在高温高湿组的两个高峰分别为伤后４ｈ和ｌ４～ｌ８ｈ；热适应组３ｈ达 到高峰，持续至６ｈ；常温常湿组６ｈ达到高峰。常温常湿组伤道骨骼肌ＨＳＰ７０含量在伤后ｌ４～１８ｈ也出现一个增幅不 明显的高峰期。结论 高温高湿环境下肢体火器伤后ＨＳＰ７０含量的变化有其独特的规律。

核桃JrsHSP17.3基因克隆及温度胁迫响应模式分析

通过分析核桃（Juglans regia）转录组,鉴定获得核桃热激蛋白家族sHSP17.3基因的全长cDNA序列,命名为JrsHSP17.3。JrsHSP17.3基因开放读码框474bp,编码产物含157个氨基酸,分子量为17.64kD,理论等电点为5.35。为了研究该基因表达的组织特异性及温度响应模式,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,对高温和低温胁迫下JrsHSP17.3基因在根、茎、叶中的转录水平进行分析。结果显示,JrsHSP17.3基因在不同组织中均有表达;经高温（36℃~52℃）和低温（16℃~6℃）处理后,JrsHSP17.3基因均可被显著诱导,其中12℃胁迫1h表达最高,为对照（非处理情况）的142.02倍。研究表明核桃JrsHSP17.3基因能够响应冷热温度胁迫,为进一步研究JrsHSP17.3基因的抗寒耐高温特性奠定基础。

高温高湿环境下颅脑火器伤后兔脑HSP70变化

目的研究高温高湿环境下颅脑火器伤后兔脑热休克蛋白70(HSP70)的变化及其作用.方法采用高温高湿颅脑枪伤模型,24只新西兰大白兔随机分成常温(22.0±0.5℃、相对湿度50%)对照组、常温(22.0±0.5℃、相对温度50%)枪伤组和高温高湿(39.0±0.5℃、相对温度80%～85%)枪伤组,每组8只.采用Western blot法检测脑组织、淋巴细胞中HSP70,应用化学发光和X线片显示,凝胶图像分析仪定量分析.结果颅脑枪伤受高温高湿环境作用后,脑皮质、下丘脑和淋巴细胞的HSP70显著增高;淋巴细胞中的HSP70与大脑皮质、下丘脑的变化趋势相一致.结论脑组织和淋巴细胞中HSP70在高温高湿环境颅脑火器伤时显著增加.

高温高湿环境犬肢体火器伤后TNF-α与HSP70含量变化的实验研究

为探讨高温高湿环境下肢体火器伤后肿瘤坏死因子 α(TNF α)与热休克蛋白 70 (HSP70 )含量变化的规律 ,将犬随机分为常温常湿组、热适应组、高温高湿组 ,分别在致伤前和火器伤后 1、3、4、6、8、10、14、18、2 4h检测TNF α与HSP70含量。结果发现 ,①伤道骨骼肌中TNF α较血浆中升高明显。常温常湿组 4h开始升高 ,14h达高峰 ;高温高湿组 1h升高 ,10h达到高峰 ,其峰值显著高于常温常湿组(P <0 0 5 ) ;热适应组变化基本和高温高湿组一致 ,只是升高幅度较低 (P<0 0 5 )。②淋巴细胞中HSP70含量在高温高湿组有两个高峰 ,分别为伤后 4h和 14～ 18h ;热适应组 3h达到高峰 ,持续高峰至 6h ;常温常湿组 6h达到高峰 ,且其伤道骨骼肌HSP70含量在伤后 14～ 18h也出现一个增幅不明显的高峰期。说明高温高湿环境下肢体火器伤后TNF α与HSP70含量增高 。

催乳素在Jurkat细胞中信号传导分子的蛋白质组分析

目的:利用蛋白质组学分析催乳素(PRL)在人T淋巴白血病细胞株JurkatD1.1细胞中所激活的信号传导分子。方法:应用重组人催乳素(rhPRL)刺激JurkatD1.1细胞。利用磷酸化金属亲和层析法(PMAC)和免疫沉淀法(IP)富集磷酸化蛋白,单向凝胶电泳(1 DE)或者双向凝胶电泳(2 DE)分离磷酸化蛋白。分析不同组的凝胶,获取有差异的蛋白质条带和斑点。质谱分析并与蛋白质数据库进行匹配鉴定。结果:PMAC法获取的磷酸化蛋白用1 DE分离,胶扫描分析发现对照组和rhPRL刺激组之间存在五条明显差别的条带,其中三条条带在rhPRL刺激组,两条在对照组。质谱分析并与数据库匹配,成功鉴定刺激组中一条条带的蛋白质,为热休克蛋白90(Hsp90)。IP法获取的磷酸化蛋白,经过2 DE分离,胶扫描分析后,挖取rhPRL刺激组凝胶的九个蛋白质点。质谱分析并与数据库匹配,成功鉴定三个斑点的蛋白质分别是核内受体辅助抑制因子2变异体、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和锌指蛋白ZIM3。结论:催乳素上调磷酸化热休克蛋白90(Hsp90),Hsp90可能参与催乳素的信号传导。催乳素信号分子调节目的基因的表达可能有核内受体辅助抑制因子2变异体和锌指蛋白ZIM3的参与。

外周血单个核细胞在不同pH条件下HSP70形成的研究

目的探讨不同pH血清对热休克蛋白形成的影响。方法抽取16例健康志愿者外周血,应用密度梯度法分离单个核细胞,分别在不同pH血清中42℃热休克0.5、1h,用免疫组化测定热休克蛋白的形成。结果体外血单个核细胞在不同pH血清中热休克蛋白形成有明显差异。结论热休克蛋白的形成速度与应激源数量密切相关。