HOXB4基因表达水平在骨髓增生异常综合征中的临床意义

目的探讨HOXB4基因在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)患者中的表达情况及其在疾病进展中的临床意义。方法利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测骨髓单个核细胞HOXB4基因的mRNA表达水平,对比49例MDS患者(MDS组)和35例非恶性血液系统疾病患者(C组)的HOXB4基因的表达差异,并探讨HOXB4的表达水平与MDS疾病特征及临床预后之间的关系。结果MDS组HOXB4基因的表达水平较C组高(P<0.05)。根据HOXB4的中位表达水平分为高表达组和低表达组,高表达组患者初诊时白细胞水平低于低表达组,而伴原始细胞增多的MDS亚型、不良预后分型及白血病转化的患者比例高于低表达组(P<0.05)。结论HOXB4基因的表达水平与MDS患者向急性白血病转化有一定关联性。

HOXB4、PRDM16及HOXA9在急性髓系白血病中的表达及临床意义

目的:检测HOXB4、PRDM16及HOXA9在急性髓系白血病(AML)患者骨髓中的表达水平,探讨其临床意义。方法:采用实时荧光定量PCR方法,检测40例初治或复发AML患者、9例完全缓解患者和19例对照者(非恶性血液病患者及健康供者)骨髓细胞HOXB4、PRDM16及HOXA9 mRNA表达水平,分析其与疾病特征、临床疗效之间关系。结果:初治或复发AML患者骨髓细胞中HOXB4、PRDM16和HOXA9表达水平均明显高于非恶性血液病患者(P<0.05);初治或复发AML患者HOXB4基因表达水平与骨髓白血病细胞比例成正相关(r=0.39),HOXB4、PRDM16和HOXA9基因的表达水平两两之间具有相关性;AML不同病程阶段(初诊、复发、缓解)HOXB4、PRDM16基因表达水平差异具有统计学意义;按预后危险度分层将初治及复发AML患者分为高、中、低危3组,3组之间HOXB4、PRDM16、HOXA9表达水平的差异无统计学意义;经2个疗程正规化疗,缓解组(CR/PR)患者治疗前的3个基因表达水平均低于未缓解组治疗前水平(P<0.05);上述3个基因低表达组缓解率均高于高表达组(P<0.05)。结论:HOXB4、PRDM16、HOXA9基因表达水平与AML患者肿瘤负荷、疗效和预后存在一定的关系。在初治和复发的AML患者骨髓细胞高表达,缓解后其表达水平下降,表达高者化疗效果差,缓解率低。

定量PCR检测体外扩增脐带血造血干细胞HOXB4基因的表达

目的:通过检测HOXB4基因表达,评价体外扩增的脐带血干细胞(CBSC)自我更新的能力。方法:CBSC在含造血细胞因子(TPO+SCF+FL+G鄄CSF)的无血清培养基体外扩增7天和14天,抽提细胞总RNA,采用定量PCR检测HOXB4基因的表达。结果:CBSC体外培养后,细胞总数可以增加近100倍,但HOXB4的表达较扩增前下降。培养7天HOXB4的水平为扩增前的18%,培养14天,HOXB4表达仅为扩增前的3%左右。结论:CBSC体外扩增细胞数量增加的同时,自我更新能力逐渐下降,甚至消失。

HOXB4基因在造血干细胞自我更新中的调控作用

造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)具有高度自我更新能力和多向分化潜能,HSC的自我更新是由促进生长的正调控信号和导致凋亡的负调控信号之间的平衡来调控的。在正调控信号中,HOXB4通过激活不同的信号通路增强HSC的自我更新,同时又不影响维持正常稳态造血的调控机制。提高HOXB4的表达水平,能够极大地增强HSC的自我更新功能,但基本不影响细胞的分化、系特异性及终末细胞的形态和功能。不仅如此,HOXB4还可增强胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)的造血潜能,促进ESC向造血细胞分化。因此,HOXB4和(或)HOXB4的靶基因的表达上调可能在干细胞移植和基因治疗等方面具有广阔的应用前景。本文就HOXB4基因参与调控造血干细胞的自我更新,HOXB4对HSC的分化特异性及终末分化的"零"效应及HOXB4调控HSC自我更新的分子机制等进行综述。

HCMV感染对HEL细胞HOXB2,HOXB3,HOXB4及HOX8基因表达的影响

目的 :研究人胚肺 (HEL)细胞HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB8基因的表达状态及人类巨细胞病毒(HCMV)感染对HEL细胞HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB8基因表达的影响。方法 :采用半定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术。结果 :HEL细胞表达HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB8;HOXB2基因于HCMV感染后 15h表达增加 ,4 8h达高峰 ,随后回落 ,至 12 0h再达高峰。HEL细胞HOXB3和HOXB4基因的表达在HCMV感染后不同时间无明显变化。HOXB8基因于HCMV感染后 15～ 4 8h表达轻微下调 ,72h回升 ,96h表达增加 ,12 0h达高峰 ;ATRA能轻微上调HCMV感染晚期HEL细胞HOXB8基因的表达 ,但对HCMV感染后HOXB2和HOXB4基因的表达无明显调节作用。结论 :HCMV能诱导HOXB2及HOXB8基因表达异常 ,这可能在先天性HCMV感染导致胚胎发育畸形中起重要作用。

脐血CD34^+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化

同源盒基因家族成员HOXB4反映原始造血干/祖细胞(PHSC/PHPC)的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量RT-PCR的方法在mRNA水平上检测HOXB4基因的表达,以观察体外扩增脐血CD34+细胞自我更新的水平。结果显示:随着体外培养时间的延长,虽然CD34+细胞数增加,但HOXB4表达下降;周后,HOXB4几乎检测不到,与成熟外周血淋巴细胞表达HOXB4的水平相同;CD34+细胞与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养可以减缓CD34+细胞HOXB4表达的下降。结论:脐血CD34+细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34+与BM-MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的丧失。

HOXB4基因及其在造血干细胞增殖分化调控中的作用

OX家族基因编码一类转录因子 ,参与造血干 /祖细胞的发育调控。其家族成员HOXB4基因具有独特作用。通过提高其表达水平 ,可以在体内外大量扩增造血干细胞。与此同时基本不影响细胞的分化、系特异性及终末细胞的形态和功能。不仅如此 ,HOXB4还可增强胚胎干细胞 (ES细胞 )的造血潜能 ,促进ES细胞向造血细胞分化。因此 ,HOXB4无论是用于基因治疗还是干细胞治疗 。

HOXB4转录因子在造血干细胞中表达调控机制的研究进展

作为同源盒基因(homeobox gene,hox)家族成员,HOXB4编码一类同源盒DNA依赖的结构域核蛋白,是一类特异性的转录因子,对造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)自我更新及分化之间的平衡起着重要的调节作用。为此,hoxB4在HSC中的表达调控机制备受关注。相关研究证明,hoxB4的一些上游调控因子,如上游激活因子-1(USF-1)、上游激活因子-2(USF-2)和核因子Y(NF-Y),以及一些造血细胞因子如血小板生成因子(TPO)及Wnt3a信号蛋白等,对hoxB4在HSC中的表达均起着重要调控作用。本文就hoxB4基因的结构、生物学特点及其在HSC中表达的调控机制作一综述。

人巨细胞病毒感染对脐血红系祖细胞发育过程中Hoxb2,Hoxb4基因表达的影响

背景:人巨细胞病毒感染可损害造血系统,甚至造成骨髓衰竭。人巨细胞病毒感染抑制红系祖细胞增殖和分化,是否与受染红系祖细胞增殖的基因异常表达有关?目的:观察人巨细胞病毒和/或全反式维甲酸对人脐血造血干细胞向红系祖细胞定向增殖分化过程进行干预后Hoxb2、Hoxb4基因表达的变化。方法:取12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血干细胞体外培养技术及实时荧光定量聚合酶链反应方法,以人巨细胞病毒-AD169和(或)6×10-8mol/L的全反式维甲酸持续干预人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化过程,检测空白组、全反式维甲酸组、人巨细胞病毒组、全反式维甲酸+人巨细胞病毒组在培养第3,7,10天红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达情况。结果与结论:各组Hoxb2、Hoxb4基因均在增殖分化的第3天已有表达,第7天表达明显增加,第10天表达最强烈。与空白组相比,人巨细胞病毒组明显下降;与人巨细胞病毒组相比,全反式维甲酸+人巨细胞病毒组的Hoxb2、Hoxb4基因表达量明显增加(P<0.05)。提示人巨细胞病毒可能通过调控Hoxb2、Hoxb4基因异常表达而引起造血功能异常;Hoxb2、Hoxb4均与红系造血有相关性;6×10-8mol/L全反式维甲酸能显著上调正常红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达,也能上调经人巨细胞病毒感染的红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达。

FLASH基因在野生型斑马鱼早期表达以及与HoxB4基因的关系

目的:观测FLASH基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎早期的表达及与Hox B4基因的关系。方法:以Hox B4转基因斑马鱼系为研究对象,分为实验组、实验对照组和空白对照组,实验组为Hox B4转基因斑马鱼系与Cre鱼系交配所得的过表达Hox B4的带有EGFP荧光的胚胎(Tg:Lmo2-Cre,Lmo2-LDEL-Hoxb4-EGFP),实验对照组为EGFP转基因斑马鱼系与Cre鱼系交配所得的表达EGFP荧光的胚胎(Tg:Lmo2-Cre,Lmo2-LDEL-EGFP),空白对照组为Tuebingen野生型斑马鱼的胚胎;采用FLASH反义mRNA探针做原位杂交并观察其表达。结果:观察到Tuebingen组中3. 7、9～24 hpf的神经外侧板、头部和脊索及18～30 hpf的原肾管可见黑色的阳性杂交信号,36 hpf后未见; 18～72 hpf的空白对照组与实验对照组间FLASH表达水平无差异,实验组18～30 hpf神经系统、造血系统FLASH的表达下调。结论:FLASH基因可能是Hox B4基因的下游靶基因。

Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建

目的构建Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为体外扩增造血干细胞并保持其干细胞特性提供实验材料基础。方法应用PCR技术从质粒TAT-HA-HOXB4-Full中扩增编码人HOXB4的cDNA,用限制性内切酶EcoRI分别酶切HOXB4基因片段和带有Tet-on开关的可调控慢病毒载体,经T4DNA连接酶连接获得慢病毒载体Teto-Fuw-hHOXB4。对构建的HOXB4慢病毒载体进行酶切片段凝胶电泳及DNA测序分析。结果酶切片段电泳分析和DNA测序分析证明Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建成功。结论正确构建了Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为后续的体外扩增造血干细胞及相关研究提供材料。

人同源盒基因HoxB4真核表达载体的构建及鉴定

本研究旨在构建人同源盒基因HoxB4真核表达载体并进行鉴定,为进一步研究HoxB4的作用提供物质基础。采用RT-PCR的方法从健康产妇脐血单个核细胞中扩增出该基因,并将HoxB4的PCR产物用EcoRI和BamHI双酶切后连接到用EcoRI和BamHI双酶切的带有EGFP编码序列和内部核糖体转入位点(IRES)的真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒在大肠杆菌DH5α内扩增后,对其进行双酶切及测序鉴定以证实载体构建成功。结果表明,双酶切和质粒测序结果证明HoxB4基因正确的连接到真核表达载体pIRES2-EGFP中,开放阅读框架正确,pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体构建成功。结论 :利用PCR,DNA重组等分子生物学技术,成功构建了pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体,为探讨HoxB4基因在造血干细胞的增殖和分化的调控功能提供了实验基础。

HOXB4基因功能及其与造血干细胞扩增的关系

同源盒基因（homeobox gene，HOX）编码一类转录因子，不仅在胚胎发育中起作用，对造血干细胞（HSC）的自我更新和增殖分化也起重要作用。HOX家族中的HoxB4是造血细胞分化早期的重要调控因子，对调节HSC自我更新与分化间的平衡起到重要作用。HoxB4基因编码一类具有同源盒DNA依赖的结构域核蛋白，是一种特异性的转录因子，它能被动透过细胞膜进入细胞内，与细胞因子共同作用下对HSC的扩增起促进作用。HoxB4蛋白目前被认为是最有潜力的干细胞扩增工具之一，它不仅能促进HSC的扩增及其功能的活化与表达，而且体内实验表明它不会导致白血病的发生。

造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因的表达

背景:HOXB4基因不仅能促进造血干细胞的扩增及其功能的活化与表达,而且体内试验表明它不会诱发白血病。因此更好地研究HOXB4在造血细胞增殖分化中的变化及作用对进一步研究造血干细胞的扩增可以提供更多的理论基础。目的:观察人类脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因表达的情况及全反式维甲酸对HOXB4基因表达的影响。方法:将培养的淋巴系造血祖细胞按干预方式不同分为2组,全反式维甲酸组:在培养体系中加入全反式维甲酸,终浓度6×10-8mol/L。正常组:不加全反式维甲酸,代之以等量的1640培养液。观察人类脐血造血干细胞经植物血凝素诱导后,在培养第3,7,12天的淋巴细胞集落形成单位生成情况。采用实时荧光定量PCR技术检测脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中HOXB4基因的表达水平。结果与结论:人脐血造血干细胞向淋巴系祖细胞增殖分化过程中,HOXB4基因呈规律的表达。随培养时间推移,正常组和全反式维甲酸组HOXB4基因的表达均逐渐降低。与正常组比较,全反式维甲酸可上调HOXB4基因的表达。

TAT-HOXB4蛋白扩增造血干/祖细胞及其临床应用前景

同源盒基因(HOX)家族中的HOXB4是造血细胞分化早期的重要调控因子,对调节造血干/祖细胞(HSPC)自我更新与分化间的平衡发挥重要作用。利用基因工程技术生产的TAT-HOXB4蛋白同样能有效扩增HSPC数量,并保留其在体内的分化潜能和长期再生潜能。本文对TAT-HOXB4蛋白是否会诱发白血病及其临床应用前景作一综述,讨论的问题包括HOX基因及HOXB4基因的结构特征,HOXB4在HSPC增殖分化中的作用,HOX基因与白血病、TAT-HOXB4蛋白等。

人同源盒基因HOXB4慢病毒载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达(英文)

本研究构建人同源盒基因(homeobox gene)HOXB4的慢病毒载体,探讨慢病毒介导的HOXB4感染人脐带间充质干细胞后的变化。利用PCR扩增获得HOXB4,并克隆入慢病毒穿梭载体lenti-shuttle;运用4质粒慢病毒包装系统转染HEK293T细胞,48 h收获慢病毒lenti-HOXB4,并测定慢病毒滴度;将lenti-HOXB4感染人脐带间充质干细胞,在倒置荧光显微镜下观察细胞感染效果,确定最佳的病毒感染复数(MOI);同时,利用RT-PCR、免疫荧光染色、CCK-8、流式细胞术检测HOXB4的表达情况及对细胞生长的影响。结果表明:利用四质粒共转染293T细胞,成功获得lenti-HOXB4,测定的病毒滴度为3×108TU/ml;当MOI为20时,lenti-HOXB4对人脐带间充质干细胞具有较高的转染效率,达80%以上;感染lenti-HOXB4的人脐带间充质干细胞,在mRNA和蛋白水平上均检测到了目的基因的表达,其能促进脐带间充质干细胞的增殖;流式细胞术检测结果显示,HOXB4基因并未明显影响间充质干细胞的表面标志。结论:成功获得带有HOXB4基因的慢病毒并实现在脐带间充质干细胞中表达,HOXB4基因能促进脐带间充质干细胞的大量增殖,并未明显影响脐带间充质干细胞表面标志的表达。

hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系。方法选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼)。通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18 h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义m RNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位。结果 q RT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P<0.05);制备了rap1b基因的反义m RNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18~48hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达。结论在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程。

P21对HoxB4的调控机制及其影响造血干细胞增殖初步研究

目的:利用转基因斑马鱼模型探讨P21是否作为Hox B4的下游基因参与调控造血干细胞(HSC)的增殖发育。方法:转基因斑马鱼系Tg(z Lmo2:LDe L-Hox B4-EGFP)与Tg(z Lmo2:Cre)交配后的胚胎作为Hox B4实验组、Tg(z Lmo2:LDe L-EGFP)与Tg(z Lmo2:Cre)交配后的胚胎作为EGFP对照组、野生型斑马鱼胚胎作为空白对照组,利用P21反义mRNA探针对斑马鱼全胚胎进行原位杂交,观察P21的表达情况。结果:Hox B4实验组胚胎、EGFP实验对照组胚胎及空白对照组胚胎在时相为18 hpf、24 hpf、72 hpf时原位杂交结果未见明显区别,30 hpf及36 hpf的Hox B4实验组斑马鱼胚胎脊椎部位P21的表达发生少量下调,48 hpf的Hox B4实验组、EGFP对照组两组胚胎胸腺部位P21较空白对照组发生少量下调。结论:转基因过表达Hoxb4的斑马鱼在造血细胞增殖异常旺盛的情况下,P21表达量出现下降,提示在胚胎期造血发育过程中P21可能作为Hox B4的下游基因,并通过Hox B4负调控作用来参与调节HSC的增殖发育。

全反式维甲酸对脐血红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因表达的影响

本研究探讨全反式维甲酸(ATRA)对人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化过程进行干预后hoxb2、hoxb4基因表达的影响。取12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血干细胞体外培养技术及FQ-RT-PCR方法,以6×10-8mol/L的ATRA干预人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化的过程,进而检测空白对照组、ATRA组在培养的第3天、第7天和第10天红系祖细胞hoxb2、hoxb4基因表达情况。结果表明:本实验各组的hoxb2、hoxb4基因在第3天时开始少量表达,在第7天表达明显升高,而在第10天表达最强烈。在空白对照组中,第3天、第7天、第10天hoxb4基因相对表达量较hoxb2高。与空白对照组相比较,ATRA组Hoxb2、Hoxb4基因表达量明显增加。结论:hoxb2、hoxb4基因在脐血HSC向红系定向增殖分化过程中(体外)均有表达,说明hoxb2、hoxb4均与红系造血有相关性,且与hoxb2相比,可能hoxb4与红系造血相关性较大;6×10-8mol/L的ATRA能显著上调正常红系祖细胞hoxb2、hoxb4基因的表达。

基于CRISPR/Cas9系统对斑马鱼hoxb4基因的编辑及其突变体基因型的初筛

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9构建hoxb4基因敲除斑马鱼模型,进行hoxb4基因功能的研究。根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长20 bp的sg RNA,分别靶向ExonⅠ的192#位点,244#位点及313#位点。化学合成sg RNA的寡核苷酸序列,经过酶切克隆进p T7-g RNA质粒中,构建g RNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的g RNA。将质粒p SP6-2s NLS-sp Cas9线性化然后在体外转录得到Cas9的m RNA并进行加A尾,将以上靶位点的g RNA与Cas9的m RNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,提取基因组DNA,PCR扩增出目的基因片段并使用T7EI酶切测效,最后将PCR产物连入p MD19-T simple载体中,挑取阳性克隆进行菌落PC R鉴定,然后经Sanger测序检测突变类型。结果显示,靶位点的sg RN A寡核苷酸双链成功连入p T7-g RNA质粒中且序列正确;其中靶向ExonⅠ的313#位点的sg RNA可成功编辑斑马鱼hoxb4基因,T7 EⅠ检测其敲除效率高达26.5%,并测序得到4种阳性突变型。通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼hoxb4基因并测序鉴定其突变类型,为HOXb4基因功能的研究提供了可靠的基因敲除方法。