日本三角涡虫hsp60基因的分子克隆和功能研究

以日本三角涡虫Dugesia japonica为研究对象,通过cDNA末端快速扩增技术首次获得涡虫hsp60基因,cDNA全长1851 bp,编码575个氨基酸的蛋白质,命名为DjHSP60。生物信息学分析表明,DjHSP60含有HSP60家族的标签序列和末端重复序列GGM,亚细胞定位分析显示该蛋白定位于线粒体,属于线粒体HSP60家族。整体原位杂交和双荧光原位杂交显示,Djhsp60阳性细胞主要分布在实质组织中,具有干细胞的特征。涡虫切割后再生1 d,Djhsp60在伤口处的组织中表达显著增强,但随着再生进行,表达量逐渐降低。采用RNAi技术敲除Djhsp60导致涡虫头部逐渐退化,失去再生能力。原位杂交和qPCR研究结果证明,RNAi-Djhsp60下调干细胞相关基因的表达。上述结果揭示Djhsp60在涡虫再生中可能发挥重要作用,为进一步研究Djhsp60调控涡虫干细胞增殖的分子机制奠定了良好基础。

麦红吸浆虫热激蛋白基因SmHsp60的分子特征及功能研究

【目的】麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana是重要的农业害虫,滞育使其度过夏季和冬季的极端环境。本研究旨在探析麦红吸浆虫滞育进程中热激蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60)基因表达与滞育发育及温度耐受性之间的关系。【方法】采用RACE和RT-PCR技术克隆麦红吸浆虫SmHsp60 cDNA全长序列并进行生物信息学分析;采用qPCR技术检测SmHs p60在麦红吸浆虫滞育前至滞育后发育不同阶段(滞育前、滞育、滞育后静息和滞育后发育)幼虫及越夏幼虫在极端高温[35,40,45和50℃水浴中处理1 h以及35℃水浴中0(对照),15,30,60和120 min]和越冬幼虫在极端低温[0,-5,-10和-15℃处理1 h以及-5℃处理0(对照),15,30,60和120 min]胁迫下的表达量;通过原核表达和亲和柱层析技术获得SmHsp60重组蛋白,采用比色法和SDS-PAGE法测定重组蛋白SmHsp60抑制苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)43℃下热聚集的能力。【结果】获得麦红吸浆虫SmHsp60(GenBank登录号:KR733065)cDNA全长序列,长2270 bp,开放阅读框长1722 bp,编码573个氨基酸,编码蛋白的相对分子量为60.7 kD。氨基酸序列分析表明,SmHsp60具有线粒体Hsp60典型的标签序列,与同为瘿蚊科(Cecidomyidae)的甘蓝瘿蚊Contarinia nasturtii Hsp60序列一致性最高、亲缘关系最近。qPCR检测结果表明,麦红吸浆虫SmHsp60在滞育阶段表达量没有显著变化,但在滞育后静息阶段逐渐升高,在滞育后静息阶段早中期即12月和翌年1月达到最高,显著高于在其他发育阶段的。与未处理的对照相比,35和40℃下1 h以及35℃下30~60 min时可显著诱导越夏幼虫SmHsp60上调表达;-5℃下1 h可显著诱导越冬幼虫SmHsp60上调表达,但高于45℃和低于-10℃的表达量没有显著变化。获得了高纯度的SmHsp60重组蛋白,可有效保护MDH免遭热聚沉,具有显著的分子伴侣功能。【结论】SmHsp60参与麦红吸浆虫滞育调控,可能与滞育终止及滞育期间的耐热和耐寒性相关。

马氏珠母贝热休克蛋白HSP60基因的克隆与表达分析

运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)热休克蛋白HSP60基因cDNA全序列。序列全长2495 bp,开放阅读框(ORF)1734 bp,编码577个氨基酸,预测的分子量约为61.79 ku,理论等电点为5.49。5'非翻译区(5'UTR)长150 bp,3'非翻译区(3'UTR)长611 bp。同源性比对分析结果,马氏珠母贝HSP60基因与与太平洋长牡蛎(Crassostrea gigas)和光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)的同源性较高,达到75%。氨基酸序列分析显示,马氏珠母贝HSP60氨基酸序列具有典型的mt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重复基序和一个ATP结合结构域。荧光定量数据分析发现,该基因在闭壳肌、外套膜、血淋巴、肝胰腺、性腺、鳃等6个组织中具有表达,在肝胰腺中表达量最高,鳃中次之,而在血液和闭壳肌中仅有少量表达;在脂多糖刺激后,该基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调,均高于对照组,差异具统计学意义(P<0.05)。

基于16S rRNA和HSP60基因序列分析粘细菌孢囊杆菌亚目形态分类的种属之间的亲缘关系

【目的】利用16SrRNA和HSP60基因分子标记分析鉴定形态分类特征不稳定的粘细菌种属。【方法】利用粘细菌的传统分离纯化方法从土壤中分离粘细菌,根据菌株的形态特征进行分类,PCR方法扩增菌株的16SrRNA和HSP60基因序列并进行系统发育关系分析。【结果】根据形态特征,分离得到的15株粘细菌菌株归入孢囊杆菌亚目(Cystobacterineae)的2个科3个属。其中11株粘细菌具有典型的所在种属的子实体结构,而菌株0085-4、0121-3、NM03和Myx9736的子实体结构发生了不同程度退化。15株粘细菌的16SrRNA基因序列的相似性在95.4%到99.5%之间。而HSP60基因序列差异较大。【结论】在属水平上,粘细菌形态分类特征和16SrRNA基因系统进化关系具有很好的一致性;在揭示粘细菌种间系统发育关系中,HSP60基因序列更为适用。

天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究

热休克蛋白60(HSP60)不仅在细胞保护方面发挥作用,也参与雄性动物生殖生理的调控。为研究HSP60基因序列特性及其在天祝白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT-axis)上的表达情况,探寻其在白牦牛睾丸发育、精子发生过程中的作用机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得白牦牛HSP60基因全长cDNA序列,采用生物信息学方法分析HSP60蛋白的理化性质、结构及不同物种之间的同源性等,并利用qPCR、Western blotting、免疫组化法分析HSP60在白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴中的表达及定位。结果表明,白牦牛HSP60基因cDNA全长为2 300 bp,开放阅读框为1 722 bp,编码572个氨基酸;其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,编码的蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60氨基酸序列与牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性高、进化水平相近。HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量显著高于睾丸,下丘脑和垂体之间差异不显著。免疫组化结果显示,HSP60蛋白定位表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞、室旁核小细胞和神经角演网、垂体组织的腺细胞、睾丸组织的精原细胞、精母细胞、支持细胞和间质细胞,而精子细胞中表达较弱。通过对健康成年白牦牛HSP60在下丘脑-垂体-睾丸轴的表达与定位检测,推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。本研究结果为进一步研究HSP60对雄性生殖调控奠定了基础。

粉尘螨Hsp60基因的测序、克隆和原核表达

目的探索和发现粉尘螨新的变应原组分。方法以粉尘螨热休克蛋白60(Heat shock protein 60,Hsp60)为研究对象,用简并引物PCR方法扩增出其cDNA片段,并对该片段进行了序列测定和分析。同时,对该基因片段进行了克隆、原核表达。结果与结论成功确定粉尘螨Hsp60基因片段cDNA序列;构建了pET-28a(+)-Hsp60重组质粒,并在E.coli BL21中得到高效表达。

小麦热激蛋白60(HSP60)基因的克隆与原核表达

[目的]构建小麦热激蛋白60基因的原核表达载体,并在E.coli中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的小麦热激蛋白60基因序列设计合成1对引物P1/P2,利用RT-PCR方法从小麦RNA中扩增小麦HSP60基因,应用基因重组技术构建pGEX-4T-1-HSP60表达载体,将构建好的小麦HSP60基因原核表达载体pGEX-4T-1-HSP60转化至大肠杆菌表达菌株E.coli-BL21感受态细胞。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定鉴定正确后,与GenBank中收录的小麦HSP60基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下获得了目的蛋白,所表达的GST-HSP60融合蛋白分子量约为90 KD。蛋白质电泳(SDS-PAGE)结果表明,表达的蛋白条带与预期的大小一致。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-HSP60的原核表达载体,在E.coli-BL21中高效表达了HSP60蛋白,为进一步研究该蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。

PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究

目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合,克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况,为进一步研究其免疫性能作必要的准备。方法采用重组聚合酶链反应,设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因(lvgA)和热休克蛋白60基因(Hsp60),经琼脂糖电泳纯化回收,再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸,实现二基因的PCR水平融合,随后采用外引物进行新一轮扩增,扩得足量lvgA/Hsp60融合基因的PCR产物,继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转化宿主菌BL21,经PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定。结果扩增出了约2292bp的lvgA/Hsp60融合基因,构建了原核表达重组质粒pGlvgA/Hsp60,并检测到Mr约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带。结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合,构建了其原核表达重组质粒,并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达,为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础.

三种致病耶尔森氏菌Hsp60基因序列的比较研究

目的 研究 3种致病耶尔森氏菌Hsp6 0基因序列的差异。方法 根据文献和基因库中的Hsp6 0基因序列设计了两对PCR引物 ,获得Hsp6 0基因的部分序列。将扩增产物纯化回收 ,克隆至 pGEM -T载体后进行测序。 结果 用CLUSTALX软件进行序列分析 ,发现 3种耶尔森氏致病菌的Hsp6 0基因序列较为保守 ,其中鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的该基因序列在所研究范围内仅相差一个碱基。结论 3种菌的Hsp6 0基因保守 ,不足以在此区间设计种特异性探针。小肠结肠炎耶尔森氏菌与鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的Hsp6 0基因序列差异较大 。

热休克蛋白HSP60基因在耐药白血病中的表达研究

目的探讨HSP60基因在白血病患者中的表达水平,并分析其与临床特征的关系。方法应用实时荧光定量R-PCR方法检测HSP60基因在白血病耐药组、敏感组及正常组中的表达水平并加以比较。结果 HSP60mRNA在白血病组的表达明显高于正常组,在耐药组明显高于敏感组,在ALL和AML患者中的表达没有明显差异。结论 HSP60基因有可能为新的白血病耐药相关基因。

Hsp60基因在小鼠腭和肢正常与异常发生过程中的表达

背景与目的：研究热休克蛋白60基因（heat shock protein 60 gene,Hsp60）在小鼠胚胎腭、前肢正常和异常发育过程中的表达情况。材料与方法：将受孕后ICR小鼠随机分为实验组和对照组2组,每组各64只,于孕10d（gestational day 10,GD10）,分别经口一次给予实验组孕鼠80mg/kg的全反式视黄酸,对照组孕鼠给予等体积的大豆油,并分别于GD11-GD18取2组胎鼠的前肢,于GD15-GD17取2组胎鼠的腭,利用实时荧光定量PCR检测Hsp60的表达丰度。结果：Hsp60在正常、异常肢和腭中均有表达。对照肢的表达丰度在GD14和出生前呈高表达,而实验肢的表达在各胚龄无明显差异（P〉0.05）;实验肢Hsp60在GD11-GD18的表达水平高于同一胚龄的对照肢（P〈0.05）。在正常腭中,Hsp60恒定表达,在异常腭中,Hsp60的表达随胚龄增大而降低;在GD15-GD17的表达丰度为实验腭低于同胚龄的对照腭（P〈0.05）。结论：全反式视黄酸所致的短肢中,Hsp60的表达呈应激性升高;而在异常腭中,Hsp60的表达受到抑制。

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-HSP60的克隆、序列分析及温度胁迫下的表达

【目的】马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种世界性检疫害虫,对温度胁迫具有极强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子机制,研究了热激蛋白HSP60在马铃薯甲虫温度胁迫应答过程中的作用。【方法】采用RT-PCR及RACE技术克隆马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因的cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR技术分析该基因在温度胁迫下的表达模式。【结果】克隆得到马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因,命名为Ld-HSP60(Gen Bank登录号:KC556801),其cDNA全长2 234 bp,开放阅读框(ORF)长1 731 bp,编码576个氨基酸,相对分子量约为61.27 kD,理论等电点为5.51,5'端非翻译区(UTR)长101 bp,3'UTR长402 bp。氨基酸序列中含有HSP60家族典型的特征序列。实时荧光定量PCR结果表明,低温胁迫(-10和0℃)下未检测到马铃薯甲虫雌雄成虫中Ld-HSP60的诱导表达;高温胁迫(38和44℃)诱导马铃薯甲虫雄成虫Ld-HSP60上调表达,随着胁迫温度的升高LdHSP60表达量呈现先升高后降低的趋势,38℃高温胁迫下表达量最高,胁迫时间越长Ld-HSP60表达量也越高。【结论】相比其他热激蛋白,HSP60对温度敏感性较低,推测HSP60可能在马铃薯甲虫雄成虫抵御高温胁迫中发挥作用。

基于HSP60基因哈氏弧菌PCR检测方法的建立

研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法。结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA。表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断。

两种粉虱Hsp60基因的克隆与表达

以近缘昆虫Hsp60基因保守区域设计兼并引物,PCR扩增烟粉虱(Bemisia tabaci)地中海(MED)隐种与温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)Hsp60基因cDNA,并检测了Hsp60基因受温度影响的表达情况。结果表明,烟粉虱MED隐种Hsp60基因cDNA的开放性阅读框长1 821 bp,编码607个氨基酸;温室白粉虱Hsp60基因cDNA的开放性阅读框长1 788 bp,编码596个氨基酸,Hsp60基因在昆虫纲低级阶元水平和高级阶元水平系统进化上能得到一个较理想结果。温室白粉虱Hsp60基因表达量受温度影响显著(P<0.05),而烟粉虱MED隐种则不显著(P>0.05)。

养殖刺参溃疡病病原菌RH2的鉴定及其生物学特性分析

从患溃疡病养殖刺参（Apostichopus japonicus）病灶处分离出3株优势菌（RH1、RH2、RH3）,以浸浴、体腔注射、体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株RH2为养殖刺参溃疡病的病原菌,其对刺参的LD50（半数致死量）每尾为5.68×10^6CFU,并证实浸浴、体腔注射的方式无法感染刺参,该菌可能通过体表创伤侵入的方式感染刺参。经形态学观察、生理生化特性分析、16SrRNA和HSP60基因测序确定菌株RH2为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）。基于16S rRNA基因构建的系统发育树显示,菌株RH2与溶藻弧菌（AF513447）亲缘关系最近,置信度为50%;HSP60基因序列分析表明RH2与溶藻弧菌（AY332570、AF230931）聚为一个分支,且置信度高达99%。菌株RH2的最适生长盐度为25～35,最适生长pH为7.2～8.0,最适生长温度为14～22℃。对18种药物的敏感实验证实菌株RH2对诺氟沙星、复方新诺明、壮观霉素等较为敏感。

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB,常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种,弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98%,相互间不能区分;HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98%以上,而与所有其它弧菌的相似性不到92%。结合表型和分子特征的鉴定结果,菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。

养殖大菱鲆腹水症病原菌SR1的分离及鉴定

从患腹水症的养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水分离到1株优势细菌SR1,人工感染实验证实其具有致病性。经API ID32E系统鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),并测定了其16S rRNA基因序列和热激蛋白HSP60(Heatshock protein,HSP)基因序列。基于16S rRNA基因序列构建的系统树结果表明,菌株SR1与溶藻弧菌(AY967727)亲缘关系最近,然而置信度较低,仅有27%,不能有效地鉴定到种。HSP60基因序列分析表明,该菌株与溶藻弧菌(AF230931)同源性最高,为99.2%。系统发育树表明SR1确与溶藻弧菌(AF230931)聚为一个分支,且置信度较高,为84%。综合上述结果,菌株SR1可鉴定为溶藻弧菌。[中国水产科学,2006,13(4):603-609]

诸氏鲻虾虎鱼致病性创伤弧菌的分离与鉴定

从患病的诸氏鲻虾虎鱼分离病原,研究其致病性。通过形态学观察、生理生化特性、HSP60序列扩增及系统发育树分析等方法系统鉴定,并进行了人工感染和毒力基因检测。结果表明,从患病的诸氏鲻虾虎鱼肝脏组织分离到1株革兰阴性杆菌,编号PYMc14-2,回归感染试验证实该菌株为诸氏鲻虾虎鱼的病原菌,毒力基因hemo检测结果阳性。生化特性结果与创伤弧菌类似,PCR扩增获得的486bp的HSP60基因序列与创伤弧菌(登录号AF230955.1)同源性达94%;系统进化树分析表明,PYMc14-2与创伤弧菌(登录号AF230955.1)聚为一簇,初步鉴定该菌为创伤弧菌。

热休克蛋白60基因多态性与噪声性听力损失易感性的关系

目的探讨热休克蛋白60(HSP60)基因多态性与噪声性听力损失的关系。方法采用横断面流行病学研究方法,对194名噪声暴露作业工人进行调查和听力测试,按听力学评价的结果将其分为听力损失组和听力正常组;用等位基因特异扩增法(ASA)和多聚酶链反应-限制性片断长度多态性法(PCR-RFLP)检测其HSP60基因上rs11551350和rs2340690两个单核苷酸位点的多态性。结果rs11551350位点在93名噪声性听力损失的工人中GG、AA和AG基因型的频率分别为1.1%、9.7%和89.2%,等位基因G和A的频率为45.7%和54.3%;在101名听力正常的工人中,基因型频率分别为5.9%(GG)、5.9%(AA)和88.1%(AG),等位基因频率为50.0%(G)和50.0%(A)。rs2340690位点在噪声性听力损失组CC、TT和CT基因型的频率分别为51.6%、7.5%和40.9%,等位基因C和T的频率为72.0%和28.0%;在听力正常组的基因型频率分别为45.5%(CC)、4.0%(TT)和50.5%(CT);等位基因频率为70.8%(C)和29.2%(T)。两位点的基因型分布及其等位基因频率在噪声性听力损失组与听力正常组之间差异均无显著性(P>0.05)。采用多元Logistic回归对两组间年龄、性别、吸烟状况、爆震史和累积噪声暴露量等因素进行校正后,未发现两位点中任一基因型的噪声性听力损失的危险度有显著性升高(P>0.05)。结论HSP60基因的rs11551350和rs2340690两个单核苷酸位点的多态性可能不是噪声性听力损失的遗传易感性因素。

四川牦牛奶和曲拉中九株乳酸菌的分子鉴定

为准确鉴定分离自我国四川鲜牦牛奶和曲拉中9株乳酸菌到种水平,作者运用16S rDNA序列分析、recA基因特异扩增和hsp60-RFLP等多种分子技术对分离自我国四川地区鲜牦牛奶和曲拉中的9株乳酸菌进行分类鉴定。结果证实,16S rDNA序列分析法可将9株乳酸菌初步归类为植物乳杆菌群(4株),肠膜明串珠菌(4株),瑞士乳杆菌(1株)。由于16S rDNA序列分析法不能区分植物乳杆菌和戊糖乳杆菌,为了进一步鉴定植物乳杆菌群中的4株菌,继续采用recA基因特异扩增和hsp60-RFLP技术对其细分,结果表明recA基因特异扩增和hsp60-RFLP的方法均能很好地把植物乳杆菌群中的4株菌鉴定到种水平,且均为植物乳杆菌。