丝氨酸蛋白酶HtrA2/Omi与细胞存亡

The serine protease HtrA2/Omi is released from the mitochondrial intermembrane space following apoptotic stimuli.Once in the cytosol,HtrA2/Omi has been implicated in promoting cell death in caspase-dependent or caspase-independent pathway.On the other hand,HtrA2/Omi can refold and degrade misfolded proteins in the mitochondria during cell stress.

HtrA2/Omi与Survivin在胰腺癌中的表达及临床意义

目的:探讨凋亡相关蛋白丝氨酸蛋白酶HtrA2/Omi和Survivin在胰腺癌中的表达及其临床意义。方法:用免疫组化SP法对40例胰腺癌组织和20例癌旁正常胰腺组织中HtrA2/Omi和Survivin的表达情况进行检测。结果:胰腺癌组与对照组比较,HtrA2/Omi、Survivin表达率均明显升高,组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05),HtrA2/O-mi的阳性表达率与Survivin的阳性表达率无显著相关(r=0.105,P>0.05);HtrA2/Omi在胰腺癌组织中的表达与肿瘤TNM分期、分化程度相关,Survivin表达与肿瘤TNM分期、分化程度、肿瘤转移相关。结论:HtrA2/Omi、Survivin可能通过调节胰腺癌组织细胞的凋亡而参与胰腺癌的发病。

HtrA2/Omi、XIAP和Caspase-3在银屑病皮损中的表达

目的:检测HtrA2/Omi,X染色体连锁凋亡抑制剂(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)和半胱天冬酶-3(Caspase-3)在寻常型银屑病(PV)中的表达。方法:应用免疫组化SABC法检测30例PV皮损与10例正常人皮肤中HtrA2/Omi、XIAP和Caspase-3的表达,并分析HtrA2/Omi、XIAP和Caspase-3表达之间的相关性。结果:PV皮损中XIAP和Caspase-3阳性细胞数明显高于正常皮肤(P<0.01),HtrA2/Omi阳性细胞数与正常皮肤无明显差异(P>0.05)。Caspase-3阳性细胞数和XIAP呈正相关趋势(P<0.05),与HtrA2/Omi表达无明显相关性(P>0.05)。HtrA2/Omi和XIAP的表达无明显相关性(P>0.05)。结论:XIAP和Caspase-3可能在PV的发病中起重要作用。

HtrA2/Omi差异化调控年轻细胞及衰老细胞的应激敏感性

目的探讨HtrA2/Omi对年轻细胞和衰老细胞应激下凋亡发生的作用。方法建立氧化应激诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老模型;构建可诱导过表达野生型(WT)和酶活性失活突变型HtrA2(S306A)/Omi的慢病毒Tet-On系统,用HUVECs建立稳转株;利用不同浓度的H2O2处理上述细胞株;衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老,TUNEL检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹及qRT-PCR检测HtrA2蛋白及mRNA水平。结果利用100μmol/L H2O2处理细胞1 h成功建立氧化应激诱导的衰老模型;衰老细胞中HtrA2/Omi的蛋白及mRNA水平相对于年轻细胞升高;年轻细胞受氧化应激后,过表达野生型HtrA2/Omi的细胞凋亡数量少于对照组和过表达突变型HtrA2/Omi组;而衰老细胞受氧化应激后,过表达野生型HtrA2/Omi的细胞发生凋亡的数量多于对照组和过表达突变型HtrA2/Omi组。结论年轻细胞中过表达HtrA2/Omi能够抑制凋亡,而在衰老细胞中过表达HtrA2/Omi则会诱导凋亡,因此HtrA2/Omi能够增强年轻细胞对氧化应激的抗性,在衰老细胞中则发挥相反的作用。

The mitochondrial serine protease HtrA2/Omi cleaves RIP1 during apoptosis of Ba/F3 cells induced by growth factor withdrawal

老鼠 pro-B 房间行 Ba/F3 的 Interleukin-3 (IL-3 ) 剥夺导致被 B 房间淋巴瘤 2 废除的房间死亡(Bcl-2 ) overexpression，而是由 pan-caspase 禁止者 carbobenzoxy-valyl-analyl-aspartyl- 未受影响的遗体[O 甲基]-fluoromethylketone (zVAD-fmk ) 。IL-3 退却引起交往受体的蛋白质(裂开) 进 30 和 25 kDa 的 C 终端碎片的 1 劈开，和仅仅导致前者的劈开被 zVAD-fmk 阻止。siRNA 实验证明 25-kDa 碎片的产生高由于 mitochondrial 丝氨酸朊酶的一个 Bcl-2-modulated 版本温度要求蛋白质 A2 (HtrA2 )/Omi。因此， recombinant HtrA2/Omi 高效地在 vitro 劈开老鼠 RIP1，产生匹配在 IL-3-deprived Ba/F3 房间观察的那些的碎片。在老鼠 RIP1 的 HtrA2/Omi 劈开地点被印射到中间的领域和相应 N 终端， C 终端碎片处于他们激活原子因素的能力被损害 --魏 B， c6 月 N 终端 kinase 和 p38 激活 mitogen 的蛋白质 kinase。有趣地， HtrA2/Omi 击倒面对 zVAD-fmk 对 IL-3 导致退却的死亡负担得起保护，由劈开 RIP1 在生长因素退却期间在 caspase 独立的细胞死亡为 HtrA2/Omi 表明一个角色。

验证性筛选PDZ结构域结合配体文库快速研究HtrA2/Omi PDZ结构域的结合特性

HtrA2/Omi是一种线粒体丝氨酸蛋白酶,在哺乳动物细胞中具有双重功能,即诱导细胞凋亡和参与维持线粒体活性的动态平衡.PDZ结构域是最重要的蛋白质相互作用结构域之一,参与多种生物学过程,如细胞信号转导、蛋白质降解、细胞骨架组织等.最近研究发现,HtrA2/Omi蛋白的PDZ结构域与配体的相互作用,可以调节HtrA2/Omi蛋白自身的水解酶活性.以HtrA2/Omi PDZ结构域为研究对象,用酵母双杂交系统验证性筛选PDZ结构域结合配体文库,快速研究该结构域的结合特性,并在人类全蛋白质组范围内预测并发现该结构域新的相互作用蛋白,最后分析这些新的相互作用所能够形成的最小相互作用网络来评估其可信度.研究结果揭示了HtrA2/Omi PDZ结构域新的结合特性,即:不仅能够结合已报道的II类PDZ配体而且还可以结合I类和III类PDZ配体,并且配体-3位氨基酸具有一定范围内的可变性.而且,发现了7个新的HtrA2/Omi PDZ结构域相互作用蛋白,为进一步阐明HtrA2/Omi蛋白的生物学功能提供了重要线索.同时证明了验证性筛选目的结构域结合配体文库,这一结构域结合特性研究新策略的实用性和高效性.

Omi/HtrA2对前列腺癌细胞株PED/PEA-15表达及PC-3细胞凋亡的影响

背景与目的:促、抑凋亡因子间的相互作用与肿瘤的发生、发展密切相关。Omi/HtrA2是新近发现的一种凋亡调节因子,PED/PEA-15是一种广泛表达的抗凋亡蛋白。本研究旨在探讨Omi/HtrA2对PED/PEA-15表达和前列腺癌细胞PC-3凋亡的影响。方法:构建Omi/HtrA2的表达载体和siRNA载体,并用脂质体法分别将两载体转染至PC-3细胞中,Westernblot和ELISA法检测Omi/HtrA2对PED/PEA-15表达和细胞凋亡的影响;Caspase-8检测试剂盒检测PED/PEA-15对Caspase-8活性的影响;Westernblot、RT-PCR法检测Omi/HtrA2特异siRNA序列对其转录、翻译的影响,流式细胞仪检测siRNA导致Omi/HtrA2基因沉默后PC-3细胞凋亡的变化。结果:酶切和DNA测序证实Omi/HtrA2的表达载体和siRNA载体构建成功。通过转染Omi/HtrA2表达载体高表达Omi/HtrA2可抑制PED/PEA-15表达,并增加肿瘤细胞的凋亡率;抑制PED/PEA-15的表达可提高Caspase-8活性。siRNA沉默Omi/HtrA2基因后PC-3细胞对顺铂的敏感性降低。结论:Omi/HtrA2可通过抑制抗凋亡蛋白PED/PEA-15表达而在PC-3细胞凋亡中发挥重要作用。

窒息新生儿血清对肾小管上皮细胞内Omi／HtrA2表达的影响

目的探讨窒息新生儿血清对人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)内Omi/HtrA2表达的影响。方法以人HK-2为研究对象,将培养在孔板内的细胞随机分为正常对照组、窒息组。从新生儿病房经股静脉收集重度窒息24 h足月新生儿血,经肝素抗凝,3 000 r/min离心20 min,分离血清,56℃恒温水浴30 min灭活补体,微孔滤器过滤除菌,按体积比1∶5配成窒息血清,200 mL/L作为攻击浓度。当细胞生长达到要求后,窒息组加入窒息血清对HK-2细胞进行攻击,正常对照组采用正常培养基进行培养,24 h后终止培养和攻击,固定细胞,采用免疫组织化学法检测二组细胞Omi/HtrA2的表达。采用SPSS 10.0软件进行t检验。结果Omi/HtrA2染色为金黄色或黄褐色分布于细胞质中。与正常对照组阳性细胞率[(9.0±2.5)%]相比,窒息组阳性细胞率[(25.15±3.5)%]明显增加,差异具有显著性意义(t=-15.322 P<0.01)。结论窒息新生儿血清可诱导Omi/HtrA2在HK-2细胞内的表达,Omi/HtrA2可能参与窒息新生儿血清诱导的HK-2凋亡。

XIAP、OMI/HTRA2蛋白对HeLa细胞的影响及两种蛋白间相互作用

目的探讨XIAP、Omi/HtrA2、米非司酮对HeLa细胞凋亡的影响以及XIAP、Omi/HtrA2的相互作用。方法细胞转染、米非司酮诱导HeLa细胞凋亡,利用共聚焦显微镜及流式细胞术观察XIAP、Omi/HtrA2在细胞内的表达和定位,并检测其对HeLa细胞凋亡影响的情况,使用共聚焦显微镜检测XIAP、Omi/HtrA2的相互作用。结果 (1)在转染了重组质粒pDsRed2-XIAP、pDsRed2-Omi/HtrA2的HeLa细胞中,加入米非司酮后其凋亡率分别是:只加米非司酮组为46.16%;米非司酮+转染质粒pDsRed2-XIAP为26.41%;米非司酮+转染质粒pDsRed2-Omi/HtrA2为78.85%。(2)利用共聚焦显微镜检测XIAP、Omi/HtrA2在HeLa细胞中存在能量共振转移现象。结论米非司酮能促进HeLa细胞凋亡;DsRed2-XIAP融合蛋白能够抑制由米非司酮诱导的HeLa细胞凋亡;DsRed2-Omi/HtrA2融合蛋白能够促进HeLa细胞凋亡,米非司酮能增加Omi/HtrA2促凋亡作用。在活HeLa细胞中,利用荧光共振能量转移技术直接证实XIAP与Omi/HtrA2在部分细胞中存在相互作用。

线粒体促凋亡因子Omi/HtrA2在肝癌组织中表达的研究

目的探讨丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2在肝癌组织、癌旁组织与正常肝组织中的表达及意义。方法应用免疫组化SABC法检测43例肝癌、30例癌旁组织及10例正常肝组织中Omi/HtrA2的表达。结果29例(67·44%)肝癌中Omi/HtrA2蛋白表达阳性,30例癌旁组织和10正常肝组织没有或只有少量很弱的表达。肝癌高分化组中Omi/HtrA2蛋白的表达明显高于中、低分化组(P<0·01)。另外,Omi/HtrA2表达与肿瘤大小及临床分期相关,但Omi/HtrA2表达与肝硬化、有无癌栓、HBsAg和AFP无关。结论肝细胞癌可能需要Omi/HtrA2的表达来促进凋亡,Omi/HtrA2的表达对肝癌的发展有重要作用。

线粒体促凋亡因子Omi/HtrA2在乳腺癌中的表达及意义

目的本文旨在通过检测促凋亡分子Omi/HtrA2在乳腺良恶性肿瘤组织中的表达,探讨其与乳腺癌发病的关系及临床意义。方法采用免疫组化En Vinsion system法检测63例乳腺癌及37例乳腺纤维腺瘤组织中Omi/HtrA2的表达情况,同时检测这些组织中Caspase-3蛋白的表达。结果Omi/HtrA2在乳腺纤维腺瘤中表达显著低于乳腺癌中的表达(P<0·05),而Caspase-3则在乳腺纤维腺瘤中表达显著高于乳腺癌中的表达(P<0·05),但二者的表达与乳腺癌的临床分期均无明显相关性(P>0·05)。结论线粒体促凋亡蛋白Omi/HtrA2的在乳腺癌中高表达与其发生发展有关。

槲芪散及其君药槲寄生对大鼠肝癌前病变组织中促凋亡因子Omi/HtrA2表达的影响

目的:探讨槲芪散及其君药槲寄生干预肝癌前病变组织中癌细胞凋亡机制。方法:用电镜观察模型组、正常组以及槲芪散大小剂量组、槲寄生单体组肝细胞线粒体形态学的变化,用免疫组化SP法、Western Blotting法检测各实验组大鼠肝组织丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2的表达。结果:槲芪散治疗组肝细胞线粒体形态较模型组有明显改善;除正常组外,模型组,槲芪散大、小剂量治疗组,槲寄生单体组均有Omi/HtrA2的表达,模型组、正常组、大剂量治疗组、单体组之间丝氨酸蛋白酶的表达量有统计学意义(P<0.05)。结论:槲芪散及其君药槲寄生能够改善肝细胞线粒体的形态和功能,降低Omi/HtrA2总量的表达,并且促使Omi/HtrA2从线粒体释放,诱导肝癌细胞的凋亡。

喉癌中Omi/HtrA2的表达及作用初探

目的:检测Omi/HtrA2在喉癌组织中的表达,初步探讨其在喉癌发生、发展中的意义。方法:采用RT-PCR与免疫组织化学方法,检测20例喉鳞状细胞癌及12例声带息肉手术切除标本中Omi/HtrA2mRNA与蛋白的表达情况。结果:癌旁正常组织中未检测到Omi/HtrA2蛋白表达,而在喉癌组织与声带息肉组织中均有表达。Omi/HtrA2基因在高分化喉鳞癌组织中的表达水平高于低分化型喉鳞癌组织、声带息肉以及癌旁的正常组织(P<0.01)。结论:Omi/HtrA2在喉鳞状细胞癌中有表达,表明Omi/HtrA2的促凋亡作用参与了喉癌的发生发展过程,为癌症治疗提供了新的理论基础。

丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2在肝癌细胞系中的表达及其促凋亡作用

目的:探讨Omi/HtrA2丝氨酸蛋白酶活性对肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法:检测O-mi/HtrA2在正常肝上皮细胞L02细胞系和肝癌细胞系HepG2、Hep3B、PLC中的表达。用脂质体法将Omi/HtrA2小干扰RNA表达载体(psiRNA-Omi/HtrA2)转染至人HepG2细胞中,以RT-PCR和Western Blot法评价psiRNA-Omi/HtrA2对Omi/HtrA2表达的沉默效应。用MTT法和流式细胞仪检测siRNA导致Omi/HtrA2基因沉默后HepG2细胞凋亡的变化。结果:在L02细胞系和3种肝癌细胞系中,所有细胞系在mRNA水平和蛋白质水平均表达Omi/HtrA2,在肝癌细胞系中的Omi/HtrA2 mRNA和蛋白质表达水平均高于正常肝上皮细胞L02。psiRNA-Omi/HtrA2载体可特异性抑制HepG2细胞中Omi/HtrA2的表达。转染psiRNA-Omi/HtrA2载体的HepG2细胞凋亡下调。结论:Omi/HtrA2在肝癌细胞系中表达增高,它可能在促进肝癌细胞凋亡中有重要作用,Omi/HtrA2为肝癌的治疗提供了一个新的选择靶点。

Omi/HtrA2对人肝癌细胞系凋亡的调控作用研究

目的探讨丝氨酸蛋白激酶Omi/HtrA2在肝癌细胞中在促凋亡基因p53与抑凋亡基因XIAP之间调控机制的研究,并探讨其今后用于靶向治疗的可能性。方法用Western blotting的方法半定量测定4种不同的肝细胞株(L02、HepG2、Hep3B、Huh7)中p53、XIAP、Omi/HtrA2蛋白的表达量,以及使用Omi/HtrA2特异性抑制剂ucf-101后各自的表达量。结果在p53表达不同的细胞株中XIAP蛋白和Omi/HtrA2蛋白的表达也是不同的,p53可上调Omi/HtrA2蛋白表达,下调XIAP蛋白表达。使用ucf-101后,肝癌细胞中XIAP蛋白表达明显上调。结论Omi/HtrA2是p53与XIAP之间凋亡调控作用的信号因子之一,参与细胞凋亡的调控,有可能作为肿瘤细胞凋亡的治疗靶点。

丝氨酸蛋白酶HtrA2/Omi可参与调节线粒体中的适配蛋白p66Shc

目的:p66Shc在线粒体内积累和HtrA2/Omi的功能缺陷都能导致线粒体损伤,诱导细胞凋亡。探讨在线粒体中HtrA2对p66Shc的调控作用。方法:构建p66Shc和成熟型HtrA2的真核表达质粒,共转染HEK293T细胞,免疫印迹法(Western blot)检测p66Shc蛋白;构建原核表达质粒,大肠杆菌纯化蛋白,体外切割实验,SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色检测;提取HtrA2功能缺陷小鼠(mnd2)大脑组织的线粒体,检测线粒体内p66Shc的蛋白水平。结果:细胞实验和体外实验证明HtrA2可以切割p66Shc,且在mnd2小鼠大脑中,线粒体内p66Shc的蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论:p66Shc是HtrA2的直接底物,且HtrA2参与调节线粒体中p66Shc的蛋白水平,揭示了HtrA2发挥神经保护功能新的可能机制。

Omi/HtrA2在腺样囊性癌的表达及其临床意义

目的探讨Omi/Htr A2在不同分型腺样囊性癌中的表达差异,并评价其对腺样囊性癌的临床意义。方法纳入确诊为腺样囊性癌的患者100例,应用免疫组织化学染色方法,检测Omi/Htr A2在不同分型腺样囊性癌中的表达;并检测腺样囊性癌转移组和非转移组患者中Omi/Htr A2表达情况。结果 Omi/Htr A2表达主要位于细胞胞质中,在腺样囊性癌组织中其阳性率为83%;腺样囊性癌低级组与高级组间表达情况具有统计学差异(P<0.05),但不同分型的腺样囊性癌组织中其表达差异无统计学意义(P>0.05);Omi/Htr A2在转移组腺样囊性癌中阳性率为93.1%,在非转移组中其阳性率为46.2%,两组比较具有统计学差异(P<0.05)。结论 Omi/Htr A2与腺样囊性癌的发病密切相关,可作为临床判断腺样囊性癌的辅助性指标,对临床的诊治及预后的判断具有一定的指导价值。

HtrA2/Omi与Livin在乳腺浸润性导管癌中表达及其临床意义

目的探讨HtrA2/Omi与Livin在乳腺浸润性导管癌(IDC)中的表达及临床意义。方法选取北部战区总医院和平分院普外科乳腺病区自2016年2月至2017年7月收治的63例行根治性手术治疗的IDC患者的病理组织与癌旁正常乳腺组织为研究对象。采用免疫组化法检测HtrA2/Omi与Livin在63例IDC组织及癌旁正常乳腺组织中的表达情况,分析二者的表达情况与临床病理特征间的关系。结果 HtrA2/Omi与Livin在IDC组织中的阳性表达率均明显高于癌旁正常乳腺组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。HtrA2/Omi的表达与肿瘤脉管侵犯有相关性(P<0.05),与患者年龄、是否绝经、肿瘤大小、淋巴结转移、原发肿瘤淋巴结转移分期(TNM)、组织学分级、神经侵犯、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(C-erbB-2)、细胞核增殖抗原(Ki-67)、分子分型均无相关性(P>0.05)。Livin蛋白的表达与肿瘤大小、TNM分期具有相关性(P<0.05),与患者年龄、是否绝经、淋巴结转移、组织学分级、神经侵犯、脉管侵犯、ER、PR、C-erbB-2、Ki-67、分子分型均无相关性(P>0.05)。Spearman等级相关分析显示,IDC组织中HtrA2/Omi与Livin表达水平无明显相关性(P>0.05)。结论在IDC患者中,HtrA2/Omi及Livin的高表达与肿瘤的发生、发展相关,Livin可能与IDC细胞增殖相关,高表达提示预后不良。

大鼠大脑皮质中Omi/HtrA2的年龄分布差异性及其可能的意义

目的探讨年龄因素影响下大鼠大脑皮质细胞中Omi/HtrA2的表达差异及其与神经细胞凋亡的关系。方法采用正常成年及正常老年大鼠大脑皮质组织,经过Caspase-3、8、9、12活性检测和TUNEL法检测凋亡细胞;Western blot法检测Omi/HtrA2蛋白含量变化;Real-timePCR法检测Omi/HtrA2 mRNA含量变化。结果衰老大鼠大脑皮质细胞凋亡明显高于成年大鼠,具体表现为:前者Caspase-3的比活性显著升高,阳性细胞凋亡数显著增高,与后者相比均有统计学差异(P<0.05)。与成年大鼠相比,衰老大鼠大脑皮质Caspase-9的比活性显著升高,二者相比差异有统计学意义(P<0.05);与成年大鼠相比,衰老大鼠大脑皮质Omi/HtrA2蛋白表达水平显著升高,二者相比差异有统计学意义(P<0.01);与成年大鼠相比,衰老大鼠大脑皮质Omi/HtrA2的mRNA水平也显著升高,二者相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论衰老大鼠大脑皮质凋亡水平增高,可能与Caspase-9途径活性增高以及Omi/HtrA2的基因和蛋白质表达水平增加有关。

Omi/HtrA2 shRNA重组真核表达质粒的构建及其在大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧模型中的作用

目的构建在哺乳动物细胞中表达的Omi/HtrA2短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,观察其对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧模型中Omi/HtrA2表达的影响。方法根据Genbank中Omi/HtrA2 mRNA分别设计2对多聚核苷酸序列,退火形成互补双链DNA,分别克隆至经双酶切后的载体Pgenesil-1上,构建Omi/HtrA2特异性的shRNA表达载体PGP1和PGP2,进行酶切和测序鉴定。制作NRK-52E缺氧/复氧模型,将表达质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,Western blot检测Omi/HtrA2蛋白质表达。结果将合成的DNA片段退火后克隆至Pgenesil-1载体上,构建Omi/HtrA2特异shRNA表达载体PGP1和PGP2;经酶切和测序证实构建成功,无碱基突变发生。将表达质粒介导转染NRK-52E缺氧/复氧模型后,细胞Omi/HtrA2蛋白质表达显著降低。结论成功构建针对大鼠Omi/HtrA2基因的shRNA表达载体PGP1和PGP2,它们能有效抑制NRK-52E缺氧/复氧模型中Omi/HtrA2表达。