抗菌肽LL-37对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用

目的研究人抗菌肽LL-37对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生物膜的相关作用,为MRSA的预防治疗以及新药物开发应用提供新策略。方法运用微量肉汤稀释法测定LL-37对临床MRSA菌株的最小抑菌浓度;建立96孔板及6孔板生物膜体外模型;通过结晶紫定量法以及激光共聚焦荧光染色法检测LL-37对MRSA生物膜形成的影响。结果微量肉汤稀释法测得LL-37对临床MRSA菌株的MIC为12.5μmol/L。不同浓度LL-37作用后,结晶紫定量法结果表明1/20 MIC亚抑菌浓度的LL-37即可抑制生物膜形成(P<0.01),且抑制率随用药浓度增加也随之提高,在1/4 MIC条件下生物膜形成抑制率可达到63%。与生理盐水对照组相比,激光共聚焦扫描显微镜下可见,用药组生物膜排列稀疏,厚度变薄,组成菌量明显减少。结论低浓度的LL-37能够抑制MRSA生物膜的形成,并且对成熟生物膜结构也具有一定的破坏作用。

人源抗菌肽LL-37对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎小鼠病毒复制及炎症反应的影响

目的探讨人源抗菌肽LL-37对病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)小鼠病毒复制和炎症反应的影响及其可能的分子机制。方法将48只BALB/c小鼠随机分成4组:正常对照组(Blank)、模型组(VMC)、LL-37低剂量组(LL-37-L)和LL-37高剂量组(LL-37-H),每组12只。除Blank组外,其他组均采用腹腔注射柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B3,CVB3)病毒液构建VMC模型小鼠。于抗菌肽LL-37干预第7天后将小鼠处死并取材。采用苏木素伊红染色观察心肌组织病理学变化;全自动生化仪检测血清心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Mb)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)浓度;50%终点法测定心肌组织CVB3病毒滴度;实时定量聚合酶链反应法检测心肌组织中CVB3 RNA表达水平;酶联免疫吸附试验法检测心肌组织炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)浓度;Western blot法检测心肌组织TLR-4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白表达水平。结果与Blank组比较,VMC组小鼠心肌组织出现明显炎性损伤,且心肌病理积分显著增加[(3.18±0.33)分vs(0.00±0.00)分,P<0.05];血清中心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白浓度显著上升;心肌组织中CVB3病毒滴度,CVB3 RNA及IL-1β、IL-6和TNF-α浓度,以及心肌组织中TLR-4、MyD88和p-NF-κB p65等蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。与VMC组比较,LL-37-H组小鼠心肌病理积分显著降低[(1.56±0.27)分vs(3.18±0.33)分,P<0.05],并且以上各检测指标均明显降低(P<0.05),而LL-37-L组小鼠以上各指标均无显著性变化(P>0.05)。结论人源抗菌肽LL-37可抑制VMC小鼠心肌组织中CVB3病毒复制和炎症反应,改善心肌损伤,其机制可能与TLR-4/NF-κB通路的抑制有关。

内含肽介导PHB纯化人源抗菌肽LL-37体系的构建

新颖的内含肽介导PHB纯化蛋白体系,是一种高效表达、自动切割、纯化方便、费用低廉的蛋白表达纯化体系,有利于蛋白规模化纯化。选用对原核细胞具有毒害作用的小肽——人源抗菌肽LL-37作为纯化对象,通过基因工程技术,构建内含肽介导PHB纯化人源抗菌肽LL-37体系,并利用该体系纯化LL-37。结果表明,构建的内含肽介导PHB纯化人源抗菌肽LL-37体系可高效表达LL-37融合蛋白,利用构建的纯化体系能对目的蛋白进行纯化。

血清人抗菌肽LL-37对重症肺炎患者临床转归的预测价值

目的探讨血清人抗菌肽LL-37对重症肺炎患者临床转归的预测价值。方法选取2017年5月至2019年10月该院收治的150例重症肺炎患者作为研究对象,根据入院28 d转归情况(生存或死亡)将其分为存活组(87例)、死亡组(63例)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清LL-37表达水平,采用急性生理学及慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ评分)评估重症肺炎患者病情严重程度,另外收集研究对象性别、年龄、体质量指数(BMI)、吸烟史、高血压比例、糖尿病比例等一般资料并进行组间比较。采用Spearman相关分析重症肺炎患者血清LL-37表达水平与APACHEⅡ评分的相关性;采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清LL-37对重症肺炎患者28 d死亡的预测价值;采用多因素Logistic回归分析影响重症肺炎患者28 d生存状况的因素。结果存活组与死亡组在性别、BMI、吸烟史、高血压比例方面比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与存活组相比,死亡组年龄更大,糖尿病比例、APACHEⅡ评分、血清LL-37表达水平均更高(P<0.05);Spearman相关分析结果显示,重症肺炎患者血清LL-37表达水平与APACHEⅡ评分呈正相关(r=0.558,P<0.05);血清LL-37预测重症肺炎患者28 d死亡的曲线下面积(AUC)为0.848,最佳截断值为744.13μg/L,对应的灵敏度、特异度分别为79.40%、81.60%;多因素Logistic回归分析结果显示,年龄≥60岁、APACHEⅡ评分≥20分、LL-37高表达均是重症肺炎患者28 d死亡的独立危险因素(P<0.05)。结论LL-37与重症肺炎患者病情严重程度及预后转归情况密切相关,可用于病情评估及转归情况预测。

氟康唑口服联合克霉唑栓及乳酸杆菌阴道用药治疗外阴阴道假丝酵母菌病对阴道分泌物中抗菌肽LL-37、防御素5水平的影响观察

目的:探究氟康唑口服联合克霉唑栓及乳酸杆菌阴道用药治疗对外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者阴道分泌物中抗菌肽LL-37、防御素5(HD5)的水平影响。方法:选取2019年12月-2020年9月到本院就诊的VVC患者86例。采用随机数字表法将患者分为观察组和对照组,各43例。给予对照组氟康唑片口服及克霉唑栓治疗,观察组在对照组的基础上给予阴道用乳杆菌活菌胶囊联合治疗。比较两组患者停药2、4周的临床疗效;比较两组治疗前及停药2、4周时的症状体征评分、阴道微生态环境(乳杆菌分级)及阴道分泌物中相关因子(抗菌肽LL-37、HD5)水平;比较两组患者治疗期间不良反应发生情况及停药后6个月内的复发情况。结果:观察组的治疗效果优于对照组(P<0.05)。停药2、4周时,两组的临床症状体征评分均明显低于治疗前,且观察组均显著低于对照组(P<0.05)。停药2、4周时,两组乳杆菌分级均较治疗前明显改善,且停药2周时,观察组的乳杆菌分级情况明显优于对照组(P<0.05);停药4周时,两组乳杆菌分级情况比较,差异无统计学意义(P>0.05)。停药2、4周时,两组抗菌肽LL-37及HD5水平均较治疗前明显降低,且观察组停药2周时上述指标水平均显著低于对照组(P<0.05)。两组头晕头痛、恶心呕吐等轻度不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。观察组患者停药后6个月内复发率明显低于对照组(P<0.05)。结论:抗真菌药物与乳酸杆菌阴道用药相结合的治疗模式具有起效快,提高机体免疫力,有效预防短期内复发的优势。

人源抗菌肽LL-37的原核表达及活性鉴定

目的:实现大肠杆菌高效可溶表达人源抗菌肽LL-37。方法:LL-37基因克隆至原核载体pET32a,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。运用相关生物信息学软件分析重组蛋白Trx-LL-37的理化性质、亲/疏水性、蛋白质二级结构及其可溶表达概率。实验还考察了不同诱导温度对重组蛋白可溶表达比例的影响。结果:生物信息学分析显示,Trx-LL-37分子量21.5kD,理论等电点6.3,物理性质稳定,二级结构简单,具有可溶表达倾向。重组蛋白最佳诱导温度为17℃,与37℃相比,可溶表达比例由37.2%提高至50.2%,并且总表达量也提高了5%左右。抑菌结果显示纯化产物对多种常见细菌的生长具有抑制作用。结论:可采用融合方式通过原核系统高效可溶表达LL-37,为LL-37的功能研究打下基础。

人抗菌肽LL-37对小鼠皮肤烫伤MRSA感染活性作用研究

目的评价人抗菌肽LL-37对小鼠皮肤烫伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染模型的治疗作用。方法建立小鼠皮肤烫伤MRSA感染模型。随机分为三组:LL-37组、生理盐水组、庆大霉素组,观察不同组小鼠的大体状况;选取3、5、9、14 d测定小鼠烫伤感染处的皮肤菌负荷,观察创面愈合情况以及组织学变化,评价人抗菌肽LL-37的抗菌活性作用。结果给予LL-37治疗后,LL-37组第3天和第5天创面皮肤菌负荷数[(6.89±0.17)和(5.57±0.32)Lg(CFU/g tissue)]均明显低于生理盐水组[(8.27±0.31)和(7.86±0.39)Lg(CFU/g tissue)],差异有统计学意义(P<0.05)。第9天,LL-37组菌负荷大幅度降低[(3.66±0.14)Lg(CFU/g tissue)],比生理盐水组[(6.91±0.26)Lg(CFU/g tissue)]低3.3 Lg(CFU/g tissue),差异有统计学意义(P<0.05)。相比生理盐水组,LL-37组创面面积缩小显著,愈合率统计结果与庆大霉素组差异无统计学意义(P>0.05)。组织病理学结果显示LL-37组创面愈合良好。结论抗菌肽LL-37能够抑制烫伤创面MRSA的定植与增长,控制感染的发展,对小鼠皮肤烫伤MRSA感染具有良好的治疗作用。

人抗菌肽LL-37对老年脓毒症患者预后的评估价值

目的探讨人抗菌肽LL-37对老年脓毒症患者预后的评估价值。方法选择2016年1月至2017年12月同济大学附属东方医院急危重症科收治的符合2016年脓毒症及脓毒性休克诊断标准且年龄≥65岁的老年脓毒症患者作为研究对象(老年脓毒症组);以同期住院的老年社区获得性肺炎(CAP)患者作为老年肺炎组,以同期老年健康体检者作为健康对照组。记录所有患者入院1、3、7d外周血LL-37水平,健康对照组和老年肺炎组以体检或入院当天的检测结果为准;同时监测C-反应蛋白(CRP)、动脉血乳酸(Lac)、降钙素原(PCT),并根据24h内指标最差值计算急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)和序贯器官衰竭评分(SOFA)。用Spearman法分析LL-37与各项指标的相关性。根据28d临床转归将老年脓毒症患者分为存活组和死亡组,比较两组各项指标的差异,筛选出差异有统计学意义的指标,绘制受试者工作特征曲线(ROC),分析各指标对预后的预测价值。结果①共113例老年脓毒症患者纳入最终分析,其中脓毒症组67例,脓毒性休克组46例;另纳入32例体检者作为健康对照组,31例老年CAP患者作为老年肺炎组。3组患者PCT、CRP、Lac、APACHEⅡ和SOFA评分均不同程度高于健康对照组,且随感染程度加重呈逐渐升高趋势;各组研究对象的性别、年龄比较差异无统计学意义。3组患者入院后LL-37水平均高于健康对照组;脓毒症组和脓毒性休克组老年患者LL-37水平随入院时间延长呈降低趋势,入院7d低于老年肺炎组[LL-37(μg/L):1403.9±501.9、1517.1±676.4比1608.4±816.2,均P>0.05]。相关分析结果显示,老年脓毒症患者7d外周血LL-37水平与APACHEⅡ评分(r=-0.329,P=0.007)和SOFA评分(r=-0.344,P=0.005)均呈显著负相关;而与Lac之间无明显相关性(r=-0.128,P=0.311)。②28d存活率分析显示,113例老年脓毒症患者中存活54例(占47.8%),死亡59例(占52.2%);两组患者性别、年龄及入院1d PCT、CRP水平差异无统计学意义。死亡组患者入院1d Lac、APACHEⅡ和SOFA评分即较存活组明显升高,且随入院时间延长呈逐渐升高趋势,入院7d时均明显高于存活组[Lac(mmol/L):2.4(1.4,4.4)比1.0(0.8,1.7),APACHEⅡ(分):21.77±5.85比13.74±4.99,SOFA评分(分):9.62±4.78比3.18±2.71,均P<0.01]。随入院时间延长,存活组外周血LL-37水平无明显变化;而死亡组LL-37水平呈下降趋势,且入院7d LL-37水平明显低于存活组(μg/L:1277.8±642.6比1620.6±461.6,P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,老年脓毒症患者入院7d外周血LL-37、Lac、APACHEⅡ、SOFA评分对预后均有预测价值,但以LL-37预测28d死亡的效果最好,其ROC曲线下面积(AUC)为0.670,95%可信区间(95%CI)=0.513~0.757,当最佳截断值为1283.0μg,L时,敏感度为75.7%,特异度为61.5%。结论老年脓毒症患者病程早期即出现LL-37水平升高,但随着病程进展和恶化呈现下降趋势,并与患者死亡相关;动态监测LL-37并结合APACHEⅡ和SOFA评分,对预测老年脓毒症患者的预后具有临床指导价值。