白芨外泌体的分离及对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的凋亡保护研究

探索鲜白芨(Bletilla striata)外泌体对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的生物活性,为其在护肤品上的开发提供数据。聚乙二醇(PEG)沉淀法提取白芨外泌体,透射电镜鉴定,BCA法测蛋白浓度;细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8,CCK8)法检测Hacat细胞存活率,流式双染检测凋亡,蛋白印迹法检测凋亡相关通路蛋白。白芨外泌体呈茶杯状具双层膜,平均粒径69.63 nm,每克鲜白芨含外泌体浓度为5.24E+8 Particles,内含蛋白19.53μg;白芨外泌体(≥5μg/mL)可显著提高体外Hacat细胞存活率(P<0.05);10μg/mL白芨外泌体处理48h,可显著降低H_(2)O_(2)氧化造模引起的Hacat细胞早凋亡、晚凋亡和总凋亡的细胞比例(P<0.01),同时,模型组caspase-9和caspase-3表达显著上升,外泌体处理能显著降低其表达,而Bcl-2表达在组间无差异(P<0.05)。PEG沉淀法分离的白芨外泌体,可促进体外Hacat生长,抑制H_(2)O_(2)引起的细胞凋亡且与蛋白caspase-9和caspase-3相关。

紫铆花素对人黑色素瘤细胞A375与人永生化角质形成细胞HaCaT共培养细胞生物学活性的影响

目的探讨紫铆花素对人黑色素瘤细胞A375与人永生化角质形成细胞HaCaT共培养细胞生物学活性的影响。方法建立A375细胞与HaCaT细胞的共培养细胞体系,实验分为对照组(等体积培养液),紫铆花素低、中、高剂量组(以下简称低、中、高剂量组,0.5,1.0,5.0μg/L)。采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性;采用流式细胞仪检测细胞的周期分布和线粒体膜电位;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法检测干细胞因子(SCF)和其受体c-Kit,以及小眼畸形相关转录因子(MITF)的mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞酪氨酸酶相关蛋白1,2(TRP-1,TRP-2)及SCF,c-Kit,MITF的蛋白表达水平。结果与对照组比较,中、高剂量组细胞的增殖率均显著升高(P<0.01);与对照组比较,各剂量组G0/G1期细胞比例均显著降低,S期和G_(2)/M期细胞比例均显著升高(P<0.01),高线粒体膜电位细胞比例均显著升高(P<0.05或P<0.01),SCF,c-Kit,MITF的mRNA表达水平及SCF,c-Kit,MITF,TRP-1,TRP-2的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论紫铆花素可能通过调节SCF,cKit,MITF的表达而影响A375细胞与HaCaT细胞共培养细胞的增殖、细胞周期和线粒体膜电位等细胞生物学活性。

土大黄提取物对人永生化表皮角质形成细胞(HaCaT)增殖的影响

目的土大黄根醇提物化学组分分析及其对人永生化表皮角质形成细胞(HaCaT细胞)增值的影响。方法利用D101大孔树脂、HPLC对土大黄根70%乙醇提取物(原粗提取物)进行分离纯化、主要化学组分分析,同时观察对HaCaT细胞增殖的作用。结果通过D101大孔树脂处理得到了30%、50%、70%、90%乙醇洗脱部位的出膏率分别为5.4%、14.8%、11%、0.72%。HPLC检测得知,30%洗脱部位占0.151%,成分为大黄素;50%洗脱部位占1.952%,成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚;70%洗脱部位占21.409%,成分为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚;90%洗脱部位占1.927%,成分为大黄酸、大黄素、大黄素甲醚;土大黄根70%乙醇提取物(原粗提取物)占1.591%,成分为芦荟大黄素和大黄酸;对HaCaT细胞增殖的抑制作用由强到弱依次为90%乙醇洗脱部位、70%乙醇洗脱部位、50%乙醇洗脱部位、70%乙醇提取物(原粗提取物)、30%乙醇洗脱部位,抑制率分别为17.55%、16.66%、10.99%、10.25%和7.86%。结论土大黄根醇提物70%乙醇洗脱部位是最佳富集部位(21.409%)、也是最佳洗脱部位。土大黄根70%乙醇提取物(原粗提取物)及其不同洗脱部位均对HaCaT细胞增殖具有一定的抑制作用,其作用可能与土大黄所含的蒽醌类成分有关,提示土大黄具有治疗银屑病的作用。

驱虫斑鸠菊中紫铆素对人永生化角质形成细胞株HaCaT增殖及细胞分泌因子的影响

目的:研究驱虫斑鸠菊(VW)中紫铆素对人永生化角质形成细胞株HaCaT的增殖及细胞分泌因子的影响,初步探讨VW中紫铆素治疗白癜风的机制。方法:采用MTT法测定0(空白对照)、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL紫铆素作用于HaCaT细胞48 h后的细胞存活率;采用酶联免疫吸附法测定0.5、1.0、5.0 μg/mL紫铆素作用于HaCaT细胞48 h后培养液中细胞分泌因子内皮素1(ET-1)、ET-3、黑素细胞刺激素(MSH)、干细胞因子(SCF)、碱性纤维细胞生长因子(bFGF)的含量。结果:与空白对照比较,0.1~5.0 μg/mL紫铆素作用48 h后细胞存活率均有不同程度升高,而10.0 μg/mL紫铆素作用后细胞存活率降低;0.5、1.0、5.0 μg/mL紫铆素作用48 h后培养液中ET-1、SCF、bFGF含量均显著增加(P<0.01),1.0、5.0 μg/mL紫铆素作用48 h后培养液中ET-3、MSH含量显著增加(P<0.01)。结论:紫铆素可促进HaCaT细胞的增殖,其作用机制可能与促进细胞分泌因子ET-1、ET-3、MSH、SCF、bFGF的分泌有关。

树莓粗多糖对UVB诱导HaCaT细胞光损伤的防护作用

多糖是树莓功能性成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗疲劳、降血糖、免疫调节等多种药理作用。但树莓多糖对紫外线造成的皮肤细胞光损伤是否具有防护作用尚未见报道。本研究旨在探究树莓粗多糖(raspberry crude polysaccharide,RCP)对中波紫外线(ultraviolet B,UVB)诱导的人永生化角质形成细胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)光损伤的防护作用。通过建立HaCaT细胞的UVB光损伤模型,利用CCK-8法测定细胞活力,酶联免疫吸附法(enzyme linked-immuno-sorbent assay,ELISA)和微板法测定HaCaT细胞中炎症因子、基质金属蛋白酶和抗氧化因子的含量,评估RCP的抗UVB活性。采用体外自由基清除实验检测RCP对DPPH自由基(DPPH·)和ABTS自由基(ABTS·^(+))的清除能力。结果表明,RCP能明显提高被UVB损伤的HaCaT细胞活力,且随浓度升高作用增强(P<0.01或P<0.05)。与未加入RCP处理的HaCaT细胞比较,人基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)、人白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、人白介素-6(interleukin-6,IL-6)、人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)的含量明显降低(P<0.01或P<0.05),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)以及人硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)的含量显著升高(P<0.05)。此外,RCP对DPPH·和ABTS·^(+)的最大清除率分别为91%和94%。以上结果表明,RCP能够通过降低炎症水平和缓解氧化应激来预防UVB对HaCaT细胞造成的光损伤,为天然抗UVB物质的研发提供新思路,也为树莓资源的高值化利用和精深开发提供参考。

人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

目的构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST)。经G418(600μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养。采用免疫细胞化学法、RTPCR和放射免疫法检测转染细胞亮氨酸脑啡肽(LEK)的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功。结果重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和950bb片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE亚克隆成功。Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST中,筛选获得IAST/hPPE和IAST/Neo两个细胞株,LEK免疫染色均阳性,但平均光密度结果显示IAST/hPPE的LEK表达明显强于IAST/Neo和IAST(P<0.01)。IAST/hPPE细胞与IAST/Neo和IAST细胞相比,hPPEmRNA表达水平和培养上清液中LEK的分泌量明显增高(P<0.01),而IAST与IAST/Neo细胞相比无显著性差异(P>0.05)。结论成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE),为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础。

P物质受体在人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的表达调控

目的考察P物质受体(Neurokinin1R,NK1R)在正常人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的表达调控特征。方法培养人表皮角质形成细胞株HaCaT细胞和真皮成纤维细胞,应用免疫组织化学法检测NK1R在两种细胞中的表达;采用RTPCR方法检测NK1R在两种细胞mRNA水平的表达特征,并采用流式细胞术定量检测在不同刺激因素及药物作用下两种细胞中NK1R的表达调控情况。结果NK1R在HaCaT细胞及真皮成纤维细胞中均有表达,阳性部位位于细胞膜及细胞质。NK1RmRNA在HaCaT细胞上的表达水平要高于在真皮成纤维细胞上的表达。P物质和IFNγ可以上调NK1R在两种细胞上的表达,而LPS抑制了NK1R的表达;抗组胺药盐酸西替利嗪和P物质受体特异性拮抗剂SpantideI可以降低两种细胞上NK1R的表达。结论皮肤角质形成细胞和真皮成纤维细胞在细胞、蛋白及mRNA水平均有NK1R的表达,而且这种表达可被过敏炎症因子调控,提示角质形成细胞和真皮成纤维细胞参与了皮肤免疫调控,神经肽P物质可能在皮肤过敏性炎症中起重要作用。

人永生化角朊细胞表达干细胞表型的流式细胞术分析

观察人永生化角朊细胞系HaCaT细胞表达的几种干细胞表型,为以该细胞系构建人组织工程皮肤和进行基因操作提供相应的实验依据。方法:采用无血清培养基对HaCaT细胞进行培养,获取处于对数生长期的细胞进行直接荧光双标法、直接荧光单标法和间接荧光单标法以分别CD49fCD71、角蛋白K19、CD29和CD133,依托流式细胞仪检测上述抗原在HaCaT细胞的表达情况。结果:特异性较高的角朊干细胞表型CD49f+D71-和K19+在HacaT细胞的百分率分别为16．6±2．8%和14．94±1．23%。CD29+HaCaT细胞为49．55±6．68%,可能包括了角朊干细胞和短暂扩增细胞。分别反映细胞黏附特性和增殖能力的CD49f+HaCaT细胞和CD71+HaCaT细胞各占98．1±0．8%和82．1±3．9%。HaCaT细胞仅表达3．43±0．77%的干细胞表型CD133。结论:人永生化角朊细胞系HaCaT细胞的表型特征表明它具有较高的角朊干细胞和短暂扩增细胞比例以及很强的黏附基底膜特性和增殖能力,提示它可以作为构建人组织工程皮肤种子细胞和基因修饰角朊干细胞的替代物。

银屑平丸对银屑病急性期患者表皮组织VEGF、KGF和AREG的影响

目的观察银屑平丸对银屑病急性期患者表皮组织双调蛋白(AREG)、角质形成细胞生长因子(KGF)及血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法将316例银屑病急性期患者按入院先后分为对照组和银屑平丸组。对照组口服阿维A、窄谱中波紫外线局部(或全身照射)及外用卤米松软膏,银屑平丸组在此治疗基础上加服银屑平丸。采用皮损面积和严重程度指数(PASI)对病变皮肤评分;ELISA法定量测定治疗前后表皮组织中AREG、KGF和VEGF蛋白量;测定表皮微血管密度(MVD),流式细胞仪检测静脉血清体外培养人永生角质形成细胞株(HaCaT)细胞增殖和细胞周期,并观察临床疗效。结果治疗4周后,银屑平丸组AREG、KGF、VEGF和PASI均显著降低,HaCaT细胞抑制率提高、S期细胞数降低,有效率为83.54%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论银屑平丸通过降低表皮组织AREG、VEGF含量,抑制KGF诱导的HaCaT细胞增殖来减少表皮细胞角化和皮下组织血管新生,降低微血管的异常增生而达到治疗银屑病急性期的目的。

大豆发酵液的抗氧化活性

利用枯草芽孢杆菌制备大豆发酵液(soybean fermentation broth,S-FB)并研究了其抗氧化活性。通过分析抗氧化活性物含量得到S-FB中总酚和总肽的质量浓度比大豆发酵前提取液(soybean extract,SE)分别提高了187%和229%。抗氧化测试结果显示,1%S-FB对2,2′-联氨双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]阳离子自由基的清除效果接近10%SE。因此,发酵提高了S-FB中的活性物含量并增强了其抗氧化活性。试验进一步研究了S-FB在人永生化角质形成细胞(HaCaT)内的抗氧化作用。结果表明,S-FB(5%、10%和20%)对活性氧的诱导作用随其体积分数的提高而增强。H 2O 2+S-FB(5%、10%和20%)提高的活性氧水平均低于H 2O 2或5%S-FB。因此,当活性氧水平提高,S-FB对活性氧的清除效果增强,诱导作用减弱。5%S-FB处理后,核因子E2相关因子2上调,并且超氧化歧化酶活力在36和48 h分别提高了32.5%和32.1%,对应的过氧化氢酶活力分别提高了19.6%和17.5%,同时该细胞被紫外线B损伤后的存活率是常规HaCaT细胞的1.3倍。因此,S-FB能够通过降低氧化应激反应和激活抗氧化通路来保护HaCaT细胞。

EPO通过上皮间充质转化促进皮肤角质细胞增殖和迁移的体外研究

目的:初步探讨促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)通过上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)对人永生皮肤角质细胞H aCat增殖和迁移的影响。方法:体外培养H aCat细胞,使用不同浓度的EPO(0,1,10,50,100IU/mL)处理细胞,CCK-8检测其增殖变化,流式细胞术探究其凋亡变化;采用划痕和transwell实验观察细胞迁移能力的改变;使用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和Western blot检测EMT及趋化相关基因的改变情况。结果:当EPO≥50IU/mL时,可以显著促进H aCat细胞的增殖(P<0.05),且细胞的凋亡率没有明显增加;当EPO≥50IU/mL时,细胞的水平移动和垂直移动能力均显著增加(P<0.05);qPCR显示,随着EPO浓度增加,上皮标志物E-cadherin的mRNA表达逐渐下降,间质标志物N-cadherin和Fibronectin表达逐渐升高,且趋化因子CCL2、CCL8和CCL21的mRNA均逐渐上调。Western blot结果显示,E-cadh erin的蛋白表达逐渐下降,N-cadh erin和Vimentin表达逐渐升高。结论:EPO能够诱导皮肤细胞H aCat上皮间充质转化的发生并能促进其增殖和迁移。

UVB辐射对人角质形成细胞HaCaT的DNA损伤及其机制

目的研究不同剂量UVB辐射对人角质形成细胞HaCaT DNA损伤的影响及机制。方法采用紫外辐照装置照射人角质形成细胞Ha Ca T建立急性紫外辐射细胞模型;MTT法检测不同剂量紫外辐射对细胞存活的影响;免疫荧光和流式细胞术分别检测细胞核内磷酸化γH2AX焦点形成及蛋白表达水平;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测不同剂量不同时间照射后早期细胞凋亡百分数;免疫印迹法分别检测Caspase-3活化水平。结果 UVB辐射可抑制HaCaT细胞的存活,有一定的量效关系;相对较大剂量的UVB辐射可观察到明显的焦点形成;UVB照射后各剂量点磷酸化γH2AX的表达均明显高于未照射的对照组;UVB辐射可通过Caspase-3活化诱导细胞发生早期凋亡,照射后20 h,早期凋亡细胞百分数明显增加,特别是在UVB相对较大剂量范围内更明显,并有随照射剂量增高而增加的趋势。结论 UVB辐射可通过诱导DNA双链断裂抑制人HaCaT细胞存活,并通过激活Caspase-3而诱导细胞凋亡,细胞凋亡延迟,可能导致细胞更易于发生突变进而形成皮肤肿瘤。

人乳头瘤病毒6/11型体外感染HaCaT细胞的研究

目的 研究人乳头瘤病毒（HPV）6／11型病毒颗粒体外感染HacaT细胞后的感染标志表达及检测方法。方法 从临床尖锐湿疣标本中提取HPV6／11病毒颗粒，用于感染单层培养的HaCaT细胞，以FQ—PCR监测病毒悬液与感染后HaCaT细胞的病毒DNA载量；用引物原位延伸标记方法原位检测感染后HaCaT细胞中HPVDNA的存在及分布；以免疫组化法检测HPV的衣壳抗原表达。结果 在病毒悬液中HPVDNA达到10^5拷贝／ml以上时，病毒处理后的HacaT细胞FQ—PCR检测结果呈稳定阳性；PRINS方法可检测到呈灶状分布的胞核阳性染色的细胞；免疫组化法未能检测到HPV衣壳蛋白的表达。结论 一定浓度的HPV6／11可以在体外培养系统中感染HaCaT细胞，在其细胞核内出现HPVDNA，但无衣壳蛋白表达。

hnRNP A2/B1在人永生化表皮HaCaT细胞凋亡过程中的表达及其调控作用研究

该文以姜黄素诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡为基础,对hnRNP A2/B1在核基质中的存在、分布及其与细胞凋亡相关基因产物的共定位及相互作用关系进行了研究。蛋白质印迹结果显示,hnRNP A2/B1存在于HaCaT细胞核基质蛋白组分中,在经过姜黄素处理后,表达下调;激光共聚焦显微镜观察显示,hnRNP A2/B1在HaCaT细胞中分别与Fas、p53和Bax等基因产物具有共定位关系,姜黄素处理后其共定位区域出现由核膜或核仁向胞质转移的趋势。GST pull-down实验证实,hnRNPA2/B1分别与Fas、p53和Bax有直接相互作用关系。结果表明,hnRNPA2/B1作为一种核基质蛋白,通过与细胞凋亡相关基因产物的相互作用参与HaCaT细胞的凋亡诱导调控过程,这对深入认识核基质蛋白在细胞凋亡过程中的调控机制具有重要意义。