携氧代血浆扩容及携氧功能初步动物实验研究

目的建立大鼠重度失血性休克模型和大鼠失血性休克-肠系膜微循环模型,用以探讨携氧代血浆的扩容和携氧功能。方法将20只SD大鼠失血至全身血容量的60%,造成重度失血性休克大鼠模型后,随机均分为6%羟乙基淀粉(HES)组和携氧代血浆组做相应样品的等容量输注复苏。分别在造模前、休克、输液末以及输液后1 h观测大鼠平均动脉压(MAP)、股动脉取血测定血气,检测组织氧分压(PtO_2)。另取20只大鼠建立失血性休克-肠系膜微循环模型,观察、记录大鼠造模前基础值、休克、输液末以及输液后1 h微血管直径的变化和血流状态。结果 HES组与携氧代血浆组比较,输液末微静脉直径(μm)与微动脉直径(μm)分别为:31.23±4.96 vs 31.86±5.43、19.46±1.47 vs19.40±2.10(P>0.05),输液后血流状态均得到恢复;输液后1 h的MAP(mm Hg)为:90.70±3.83 vs 98.90±9.18(P<0.05);组织氧分压(mm Hg)为:输液末7.03±1.47 vs 15.32±2.34(P<0.05),输液后1 h 5.53±2.39 vs 8.90±2.01(P<0.05);2组大鼠血气指标在各时间点相近(P>0.05)。结论携氧代血浆能够改善大鼠失血性休克所致的微循环障碍,具有与HES相似的血管扩容作用,并且在大鼠休克复苏初期恢复组织氧分压的效果优于HES。

羟乙基淀粉加多聚人胎盘血红蛋白对失血性休克大鼠肠缺血再灌注损伤的影响

目的探讨应用羟乙基淀粉(HES)溶液中添加多聚人胎盘血红蛋白(Poly Hb)对重度失血性休克大鼠模型肠缺血再灌注的影响。方法将32只SD大鼠失血至全身血容量(大鼠体重的6.5%)的60%,分别将大鼠股动静脉插管后,从股动脉端开始放血直至放血量达到大鼠全身血容量的60%,然后随机均分为4组(8只/组),包括3个人工胶体液组,即HES组:6%HES130/0.4氯化钠注射液;红细胞+HES(RBC+HES)组:将大鼠自身血液反复离心洗涤3次,留取红细胞,加入到HES溶液中,使Hb浓度达到20 g/L;Poly Hb+HES组:将Poly PHb加入到HES溶液中,使Hb浓度为20 g/L;1个假手术组:只做常规手术,不放血不复苏。将大鼠行等容量液体复苏,分别在各组大鼠休克前、后,输液末、输液后1 h、2 h观测大鼠平均动脉压(MAP)、乳酸(Lac)、氧分压(Pa O2)、二氧化碳分压(Pa CO2),并在复苏2 h取各组大鼠肠组织制备成10%组织匀浆,测定丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。结果 HES、RBC+HES和Poly Hb+HES 3组大鼠输液后MAP(mm Hg)分别为88.00±9.90 vs 100.57±7.69vs 112.16±17.05(P"0.05);输液后2 h,乳酸(mmol/L)分别为3.71±0.91 vs 2.30±0.97 vs 2.50±0.65(P"0.05),Pa O2(mm Hg)分别为126.5±10.40 vs 111.16±9.64 vs 111.00±13.98(P"0.05),Pa CO2(mm Hg)分别为30.00±3.16 vs 42.66±5.31 vs 34.66±1.50(P"0.05);输液后2 h,RBC+HES、HES组MDA、MPO活性,分别为:0.47±0.34 vs 0.99±0.81,0.23±0.29 vs 0.57±0.32(P"0.05);Poly Hb+HES与HES组MPO活性、TNF-α分别为0.32±0.19 vs 0.57±0.32,89.42±21.03 vs 208.45±62.80(P"0.05)。结论 HES溶液添加多Poly Hb可以改善失血性休克大鼠组织氧供和酸中毒现象,减轻肠组织缺血再灌注损伤。

应用超滤法对聚合血红蛋白分子量分级

目的对聚合人胎盘血红蛋白(PolyPHb)作分子量分级以达到去除后小分子(≤64 kD)≤13%。方法逐个分析影响超滤法超滤效果的超滤膜规格、PolyPHb浓度、超滤倍数等3个主要因素,以高效液相色谱(HPLC)检测超滤效果,选出三者较佳匹配条件后作扩试验制备出血红蛋白氧载体(HBOCs),超滤后HBOCs分别用血氧分析仪测定生物活性携/放氧功能P50和圆二色谱分析仪测定蛋白质二级结构等理化指标。结果以结构、理化性质稳定、截留分子量合适、超滤效果较好为原则,确定超滤膜的规格为100 kD截留分子量膜堆、PolyPHb浓度为0.5%、超滤倍数8～10倍为较适组和扩试验所制得的PolyPHb分子量分布:寡聚体(≥600 kD)超大分子≤3%,小分子(≤64kD)≤13%。结论选用合适的截留分子量膜堆、PolyPHb浓度、超滤倍数的超滤工艺能较好的将PolyPHb实现分子量分级,为大规模制备高纯度合格HBOCs奠定基础。

钼蓝分光比色法测定聚合人脐带血红蛋白溶液中还原性维生素C的含量

目的建立1种适用于聚合人脐带血红蛋白(HBOCs)体系的还原性维生素C(Vc)的检测方法。方法采用钼蓝分光比色法对HBOCs样品中的还原性Vc含量进行检测,研究盐酸对HBOCs的沉淀效果.在测定过程中摸索最大吸收波长、盐酸加量和反应时间的优化条件,并在此基础上对钼蓝分光比色法的精密度、重复性和回收率作了考察。结果当酸沉液中盐酸浓度>1mol/L时对HBOCs样品有着良好的沉淀效果;显色反应条件确定为1-2mL盐酸加量,反应时间>60min,最大吸收波长值710nm。在此条件下,Vc加量在0-200μg的标准曲线线性度达0.9985;精密度和重复性试验结果良好,RSD值均<5%;HBOCs中Vc回收率为97%-102%。结论钼蓝分光比色法可以有效测定HBOCs溶液中的Vc含量,具有操作简单、成本低等特点。

人胎盘血红蛋白聚合工艺的优化研究

从影响血红蛋白与戊二醛聚合的相关因素戊二醛加样方式、血红蛋白浓度、戊二醛与血红蛋白摩尔比、反应时间和温度出发，以固定变量的方法逐个研究各因素对聚合产物分子量分布的影响，以达到降低制品平均分子量、提高有效转化率的目的。结果表明：原工艺平均分子量为（350．20±35．45）kD，有效转化率（分子量90～600kD）为53．27％±4．95％；而改进后工艺平均分子量为（158．60±8．70）kD，有效转化率为69．50％±3．70％。此外，改进后工艺应用于中试（扩大30倍）规模的验证性试验，有效转化率和平均分子量均可达到上述小试结果。

血红蛋白最佳聚合工艺匹配条件的研究

目的 探讨以戊二醛为交联剂的血红蛋白类氧载体（HBOCs）的聚合工艺匹配条件的优化研究,进一步降低终产品的平均分子质量和超大分子含量,提高聚合血红蛋白的有效转化率.方法 在前期对人胎盘血红蛋白与戊二醛交联的单因素影响水平的研究基础上,选取戊二醛的加样速度、血红蛋白的质量浓度和戊二醛与血红蛋白的摩尔比3个因素做正交试验以优化血红蛋白聚合工艺的匹配条件.结果 戊二醛与血红蛋白的摩尔比对聚合血红蛋白分子质量分布的影响最大,其次是血红蛋白的质量浓度,最后为戊二醛的加样速度.对平均分子质量的影响分析,不同的戊二醛与血红蛋白摩尔比条件下的平均分子质量间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）,而不同的血红蛋白质量浓度和戊二醛的加样速度条件下的平均分子质量间的差异均无统计学意义（P＞0.05）;对有效转化率的影响分析,不同的戊二醛与血红蛋白摩尔比和不同的血红蛋白质量浓度条件下的有效转化率间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）,不同的戊二醛加样速度条件下的有效转化率间的差异均无统计学意义（P＞0.05）;对超大分子含量的影响分析,不同的戊二醛与血红蛋白摩尔比条件下的超大分子含量间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）,不同血红蛋白的质量浓度和戊二醛的加样速度条件下超大分子含量间的差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 通过以上实验分析,优化确定了血红蛋白聚合工艺的最佳匹配条件.

冻干工艺对聚合人胎盘血红蛋白质量影响的研究

探讨冻干处理对聚合人胎盘血红蛋白质量的影响。设计适宜的实验条件对聚合人胎盘血红蛋白(PolyPHb)溶液进行冻干处理后,检测冻干前后的血红蛋白浓度、高铁血红蛋白(MetHb)含量、氧结合量、游离三价铁离子(Fe3+)含量、pH值、紫外线(UV)光谱扫描、平均分子量及其分布、圆二色谱扫描、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、氧饱和曲线等指标的变化以及冻干品的外观、残余含水量、复溶时间等是否符合要求。结果表明:5批冻干处理样品的各项检测指标在冻干前后均无显著变化。这说明冻干处理对PolyPHb溶液理化性质及生物活性无显著影响,因此可以将PolyPHb溶液按本工艺进行冻干保存。

DBBF交联修饰人脐带血血红蛋白的工艺研究

目的研究治疗脑血管缺氧疾病的创新载氧药物，其最主要功能是能够向缺氧组织有效地供氧。恢复无基质血红蛋白的供氧能力是开发载氧药物的关键步骤。双（3，5-二溴水杨基）延胡索酸脂（bis（3，5．dibromosalicyl）fumarate，DBBF）交联修饰血红蛋白α链的工艺研究，是为开发具有合适亲氧性的载氧药物奠定基础。方法电泳和HPLC检测聚合程度，在生理条件下检测其生物活性和P50（血红蛋白到达氧半饱和态所对应的氧分压）。结果DBBF有效地交联血红蛋白（hemoglobin，Hb），既恢复了无基质血红蛋白（stroma-free hemoglobin，SFHb）的P50，又增加了血红蛋白四聚体的稳定性，很好地保持了血红蛋白的生物活性。结论DBBF-αHb作为开发具有合适亲氧性的载氧药物的第一步，为后续工作奠定了基础。