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Fusion protein of single-chain variable domain fragments for treatment of myasthenia gravis
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作者 Fangfang Li Fanping Meng +4 位作者 Quanxin Jin Changyuan Sun Yingxin Li Honghua Li Songzhu Jin 《Neural Regeneration Research》 SCIE CAS CSCD 2014年第8期851-856,共6页
Single-chain variable domain fragment (scFv) 637 is an antigen-specific scFv of myasthenia gravis. In this study, scFv and human serum albumin genes were conjugated and the fusion pro-tein was expressed in Pichia pa... Single-chain variable domain fragment (scFv) 637 is an antigen-specific scFv of myasthenia gravis. In this study, scFv and human serum albumin genes were conjugated and the fusion pro-tein was expressed in Pichia pastoris. The afifnity of scFv-human serum albumin fusion protein to bind to acetylcholine receptor at the neuromuscular junction of human intercostal muscles was detected by immunolfuorescence staining. The ability of the fusion protein to block myas-thenia gravis patient sera binding to acetylcholine receptors and its stability in healthy serum were measured by competitive ELISA. The results showed that the inhibition rate was 2.0-77.4%, and the stability of fusion protein in static healthy sera was about 3 days. This approach suggests the scFv-human serum albumin is a potential candidate for speciifc immunosuppressive therapy of myasthenia gravis. 展开更多
关键词 nerve regeneration myasthenia gravis acetylcholine receptor anti-acetylcholine re-ceptor antibody single-chain variable domain fragment human serum albumin fusion protein immunosuppressive therapy autoimmune disease NSFC grant neural regeneration
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传统抗蛇毒血清的改进及新型抗蛇毒抗体的展望
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作者 王磊 杨廷潺 范泉水 《蛇志》 2023年第2期165-171,共7页
毒蛇咬伤病情急、危害大,需及时治疗,抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤的唯一特效药。传统的抗蛇毒血清是从动物超免血浆中提取的单蛇毒特异性或多蛇毒特异性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段,其外源蛋白的本质属性在临床应用时可引起过敏性反应。... 毒蛇咬伤病情急、危害大,需及时治疗,抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤的唯一特效药。传统的抗蛇毒血清是从动物超免血浆中提取的单蛇毒特异性或多蛇毒特异性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段,其外源蛋白的本质属性在临床应用时可引起过敏性反应。新型人源化单克隆抗体技术提供了毒蛇咬伤治疗用人源化和高亲和力抗体的制造手段,是抗蛇毒血清的发展趋势。本文探讨了传统抗蛇毒血清改进优化的方法,以及新型抗蛇毒抗体开发现状及展望,以期为提升抗蛇毒血清质量和升级换代提供参考。 展开更多
关键词 抗蛇毒血清 单克隆抗体 单链可变区片段 人源化抗体
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人源结缔组织生长因子单链可变区抗体片段的筛选 被引量:4
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作者 吴国球 刘乃丰 +3 位作者 赵桂琴 范小波 张臣 王明虹 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期464-468,共5页
目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲... 目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取8个克隆,提取DNA后测序;测序阳性的DNA转化E.coliHB2151,IPTG诱导后用间接ELISA方法检测培养上清单链抗体的活性。MTT法测定单链抗体对CTGF促人近曲肾小管上皮HK-2细胞增殖作用的影响。结果:从8个克隆中获得7个完全一致的DNA序列(W0616);另有1个克隆丢失了重链,且轻链框架区(FR)和互补决定区(CDR)序列与W0616不一致;阳性克隆经诱导后,培养上清用间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.001)。同时,该单链抗体片段能明显抑制CTGF引起的HK-2细胞的增殖。结论:成功获得与CTGF特异结合的人源单链抗体可变区序列,为CTGF抑制剂的研究奠定基础。 展开更多
关键词 结缔组织生长因子 噬菌体展示 人源单链可变区片段
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严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)人源性单链抗体文库的构建 被引量:3
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作者 张文帅 曾晓燕 +2 位作者 迟莹 刘静娴 焦永军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期390-394,共5页
目的构建人源性严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)单链抗体(scFv)文库,并用SFTSV颗粒对文库进行初步筛选。方法提取8例SFTS恢复期患者外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录为cDNA;并以此为模板PCR扩增人源抗体轻链库(Vκ和Vλ)和重链库(V... 目的构建人源性严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)单链抗体(scFv)文库,并用SFTSV颗粒对文库进行初步筛选。方法提取8例SFTS恢复期患者外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录为cDNA;并以此为模板PCR扩增人源抗体轻链库(Vκ和Vλ)和重链库(VH),再经过重叠PCR随机拼接成scFv基因文库,最后克隆入噬菌粒载体pComb3XSS中,将重组噬菌粒电转化感受态XL1-Blue细胞,得到SFTSV抗体文库,检测文库库容及多样性,并用SFTSV颗粒作抗原对抗体文库进行初步筛选。结果构建的人源SFTSV抗体文库的库容为2.8×10~7,测序结果表明文库多样性好,经过初步筛选获得21个克隆的人源化scFv,具有与SFTSV颗粒结合的活性。结论成功构建了人源抗SFTSV的scFv文库。 展开更多
关键词 严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV) 人源抗体文库 单链抗体(scFv)
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抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定 被引量:1
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作者 段朝晖 毛越苹 +4 位作者 罗晓红 李民友 劳伟思 王英 朱振宇 《第四军医大学学报》 北大核心 2008年第9期788-791,共4页
目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β-淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区... 目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β-淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起,克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7超感染后回收全部重组噬菌体,构建噬菌体抗体库,SDS-PAGE鉴定纯度.结果:经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325bp,与预期VH,VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为1.1×108的噬菌体抗体库,经SDS-PAGE鉴定,得到Mr约为30000ku,纯度较好的ScFv抗体.结论:成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库,为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础. 展开更多
关键词 噬菌体展示技术 单链抗体 阿尔茨海默病 Β-淀粉样肽
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从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更小抗体片段 被引量:3
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作者 胡志伟 段招军 +3 位作者 朱建高 周国华 胡锦跃 孙去病 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第4期148-150,共3页
目的:用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库,并用大肠癌相关抗原CAHb3筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆EL5D、EL6D和Ca12,测定3个克隆的核苷酸序列,并研究其免疫活性。方法:采用抗体克隆扩增、测... 目的:用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库,并用大肠癌相关抗原CAHb3筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆EL5D、EL6D和Ca12,测定3个克隆的核苷酸序列,并研究其免疫活性。方法:采用抗体克隆扩增、测序分析、免疫组化法测定活性。结果:抗体基因插入片段分别为220、500、500bp。测序结果表明,EL6D和Ca12属VH5DJH4,仅为VH结构亚单位,而EL5D属Vκ的Jκ1,仅为FR3CDR3FR4结构。三者均能与人结直肠癌细胞和组织反应,与其亲本鼠源单抗Hb3的结合特性一致。3个抗体克隆已列入国际基因库,序号为AF051165AF051167。结论:短的人源抗体片段具有潜在临床应用价值。 展开更多
关键词 免疫球蛋白基因 单链抗体库 大肠癌靶向
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量子点与人源抗谷胱甘肽单链抗体的连接与表征 被引量:2
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作者 徐俊杰 王诗雯 +7 位作者 赵虹 陈桂秋 霍锐 田莉 段玉晶 李敏杰 杨柏 魏景艳 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2009年第3期506-509,共4页
用已构建的表达载体pPELB-B3,在大肠杆菌Rosetta中可溶性表达人源抗谷胱甘肽(GSH)单链抗体B3(scFv-B3),经N i2+螯合亲和层析纯化后,用点印迹法验证了其与GSH结合的特异性.将水相合成的半导体纳米粒子(半导体量子点,QD s)在N-羟基琥珀酰... 用已构建的表达载体pPELB-B3,在大肠杆菌Rosetta中可溶性表达人源抗谷胱甘肽(GSH)单链抗体B3(scFv-B3),经N i2+螯合亲和层析纯化后,用点印迹法验证了其与GSH结合的特异性.将水相合成的半导体纳米粒子(半导体量子点,QD s)在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下,与scFvs连接.光谱分析和膜印迹结果表明,scFvs成功地共价连接到QD s表面,所得的QD-scFvs复合物能够较好地识别GSH.荧光显微镜观察QD-scFvs与人乳腺癌细胞MCF-7的作用结果,初步判断QD-scFvs能够跨膜进入细胞. 展开更多
关键词 量子点 人源单链抗体 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) 共价结合 印迹
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抗体库优化策略对特异性抗肝癌单链抗体的人源化 被引量:3
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作者 叶刚 杨冬华 +3 位作者 汤绍辉 黄卫 丁世华 罗静兰 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2008年第11期1144-1150,共7页
目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,... 目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,把难以判断回复突变残基的人、鼠源副本同时编入人源化抗体序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化抗体全基因,利用噬菌体展示技术构建人源化组合抗体库;通过肝癌细胞筛选阳性克隆,ELISA方法测定各个克隆抗原结合活性;用硫氰酸盐洗脱法测定并比较亲本抗体和人源化scFv的相对亲和力.结果:成功构建人源化组合抗体库,实际库容4.77×105,包含由25不同重链和22不同轻链组成的128种人源化DM;经过筛淘及ELISA鉴定,获得HDM1、HDM2和HDM33个阳性克隆,相对亲和力指数分别为HDM11.6mol/L、HDM21.2mol/L和HDM32.2mol/L.结论:抗体库优化法是一个高效、简便的人源化方法;获得的3株阳性克隆HDM1、HDM2、HDM3与亲本抗体DM同样具有良好的抗原结合特异性和较高的亲和力. 展开更多
关键词 人源化 单链抗体 组合抗体库 肝癌 重叠延伸PCR 硫氰酸盐洗脱法 酶联免疫吸附试验 噬菌体展示技术
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甲状腺髓样癌人源噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定 被引量:1
9
作者 刘琼 庞华 +2 位作者 奚级梅 李文波 许璐 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1199-1203,共5页
目的:从大容量甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)人源噬菌体单链抗体(single chain variable fragments,sc Fv)库中筛选出特异的抗MTC单链抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法:分别以甲状腺上皮细胞TEC细胞株和MTC细胞TT... 目的:从大容量甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)人源噬菌体单链抗体(single chain variable fragments,sc Fv)库中筛选出特异的抗MTC单链抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法:分别以甲状腺上皮细胞TEC细胞株和MTC细胞TT细胞株为抗原进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集循环,筛选出抗MTC抗体,将筛选出的阳性克隆感染E.coli HB2151;异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导抗体可溶性表达,HiTrapTM Anti E-tag柱纯化表达抗体;SDS-PAGE和Western blot检测抗体表达和相对分子质量;ELISA检测可溶性sc Fv的特异性和免疫活性,分为TT细胞组、SW480细胞组、TEC细胞组和PBS空白对照组,分别检测各组在酶标仪A450 nm处的吸光度;四甲基偶氮唑盐比色分析法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)分别检测TT细胞组、SW 480细胞组与不同浓度sv Fv反应并读取A490 nm处的吸光度,设置空白对照PBS组,分别计算细胞抑制率。结果:5轮筛选后,抗体得到了明显富集。随机挑取单个细菌克隆,phage ELISA和sc Fv ELISA阳性率分别为65%和50%。SDS-PAGE、Western blot结果显示MTC特异性抗体分子量为28 k D左右。ELISA结果显示,TT细胞组的吸光度(0.41±0.12)较SW 480细胞组(0.20±0.03)、TEC细胞组(0.13±0.01)、PBS空白对照组(0.07±0.01)明显增加(P=0.000)。MTT法结果显示,TT细胞组和SW 480细胞组在sc Fv浓度为0.1、1、10μmol/L时,2细胞株间抑制率有统计学意义,统计量分别是t=2.881,P=0.02;t=5.073,P=0.006;t=7.324,P=0.000,且在sc Fv浓度为10μmol/L时,对TT细胞的抑制率最高(0.59±0.15)%。结论:利用噬菌体抗体库技术成功获得了特异性的抗MTC人源单链抗体。 展开更多
关键词 噬菌体抗体库 人源单链抗体 甲状腺髓样癌 筛选
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人免疫缺陷病毒1型Rev单链抗体细胞内免疫抗病毒基因治疗研究 被引量:1
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作者 朱明华 段凌浔 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第1期17-23,共7页
应用抗HIV 1Rev单链抗体细胞内免疫方法 ,研究在人T细胞和周围血淋巴单核细胞内抗病毒复制的效果 ,探讨细胞内免疫抗HIV 1基因治疗的可行性。克隆抗HIV 1Rev单链抗体 (sFv)基因 ,以逆转录病毒为基因载体 ,将包装后的含靶基因的逆转录病... 应用抗HIV 1Rev单链抗体细胞内免疫方法 ,研究在人T细胞和周围血淋巴单核细胞内抗病毒复制的效果 ,探讨细胞内免疫抗HIV 1基因治疗的可行性。克隆抗HIV 1Rev单链抗体 (sFv)基因 ,以逆转录病毒为基因载体 ,将包装后的含靶基因的逆转录病毒转导至人CD4 阳性T 细胞株CEM和SupT1,以及HIV 1阴性自愿者的周围血淋巴单核细胞 (PBMC) ,再分别用不同剂量 (MOI)的HIV 1病毒株PNL4 3 和HxB2 进行病毒攻击实验。测定HIV 1p2 4抗原。滴度以了解抗病毒复制的效果 ,检测带报道基因CAT以了解靶基因在细胞内的表达状况。分别应用0 2 4、0 0 6和 0 0 2 4MOI的PNL4 3 或HxB2 病毒株攻击 ,测定p2 4抗原。结果显示 ,抗RevsFv细胞内表达能有效地抑制病毒在细胞内的复制 ,与对照组比较 ,病毒复制被抑制效率达 90 %以上。体外培养细胞 2个月 ,仍可观察到效果 ,病毒攻击后合胞体细胞形成显著减少。CAT实验表明 ,逆转录病毒载体可使靶基因在人T细胞和PBMC内有效表达。抗HIV 1RevsFv细胞内表达可有效地抑制病毒复制 ,有望成为抗HIV 展开更多
关键词 单链抗体 细胞内免疫 人免疫缺陷病毒-1
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抗恶性疟SERA噬菌体抗体库的构建及单链抗体的筛选与鉴定(英文)
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作者 徐伟文 李文全 +2 位作者 李明 毕惠祥 Toshihiro Horii 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期58-62,共5页
目的 研制用于疟疾简便、快速诊断试剂盒的试剂。方法 利用噬菌体抗体库技术,构建抗恶性疟原虫丝氨酸重复抗原(SERA)的噬菌体抗体库。经3轮“吸附-洗脱-扩增”的富集反应后,从中筛选抗SERA的阳性克隆株,并进行可溶性诱... 目的 研制用于疟疾简便、快速诊断试剂盒的试剂。方法 利用噬菌体抗体库技术,构建抗恶性疟原虫丝氨酸重复抗原(SERA)的噬菌体抗体库。经3轮“吸附-洗脱-扩增”的富集反应后,从中筛选抗SERA的阳性克隆株,并进行可溶性诱导表达,最后用ELISA和Western blot等进行鉴定。结果 成功地构建了中等库容的噬菌体抗体库,并从中筛选到9株抗SERA的阳性克隆株,表达的单链抗体的相对分子质量大小约为31kDa,能与 SE47'抗原起特异性结合反应。结论 成功地构建了抗SE47'的噬菌体抗体库,从中筛选制备的单链抗体为研制疟疾快速诊断试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 噬菌体抗体库 单链抗体 丝氨酸重复抗原 SERA 恶性疟
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甲状腺未分化癌人源单链抗体制备及初步鉴定
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作者 刘倩 刘琼 +4 位作者 李文波 许璐 周静 刘影 庞华 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期981-985,共5页
目的从大容量甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)人源单链抗体(single chain variable fragments,sc Fv)库中筛选特异性抗ATC单链抗体并进行生物特性鉴定。方法对该抗体库进行4轮筛选后,挑取抗ATC阳性克隆感染E.coli HB2... 目的从大容量甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)人源单链抗体(single chain variable fragments,sc Fv)库中筛选特异性抗ATC单链抗体并进行生物特性鉴定。方法对该抗体库进行4轮筛选后,挑取抗ATC阳性克隆感染E.coli HB2151;并用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导该sc Fv抗体可溶性表达,ELISA法检测其可溶性表达;经HiTrap^(TM) Anti E-tag亲和柱层析纯化抗体;细胞ELISA鉴定可溶性抗体与细胞结合的特异性,分别设置TT细胞、ARO细胞、人肝癌Hep G2细胞及PBS空白对照组,用酶标仪检测各组在450 nm处的吸光度。SDS-PAGE法及Western blot检测抗体的表达和相对分子质量;流式细胞术观察细胞凋亡情况。结果经4轮筛选后抗体实现了显著富集,并得到了纯化抗体。ELISA结果表明筛选出的抗体与甲状腺未分化癌细胞能够特异性结合。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示ATC抗体的相对分子质量约为2.9×10~4。流式细胞术结果显示ARO细胞经sc Fv特异性作用后细胞明显凋亡。结论成功获得抗ATC特异性人源单链抗体,鉴定结果显示抗体活性较好。 展开更多
关键词 噬菌体 人源单链抗体 甲状腺未分化癌 鉴定
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抗人转铁蛋白单链抗体的研制及部分性能研究
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作者 李兆隆 郭红玲 +4 位作者 常彩琴 涂政 肖卫民 王明鑫 王俭 《中国法医学杂志》 CSCD 2001年第S1期12-16,共5页
研制人转铁蛋白的单链抗体。以纯化人转铁蛋白免疫小鼠,制备小鼠脾脏 mRNA,RT-PCR 扩增重轻链可变区基因;Linker 连接及引入 Sfi Ⅰ和 NotⅠ酶切位点构建单链抗体基因;同载体 pCANTAB 5E 连接,转化 E.coliTG1细胞,以 M13K07挽救制备噬... 研制人转铁蛋白的单链抗体。以纯化人转铁蛋白免疫小鼠,制备小鼠脾脏 mRNA,RT-PCR 扩增重轻链可变区基因;Linker 连接及引入 Sfi Ⅰ和 NotⅠ酶切位点构建单链抗体基因;同载体 pCANTAB 5E 连接,转化 E.coliTG1细胞,以 M13K07挽救制备噬菌体抗体呈现文库,筛选抗原阳性重组噬菌体粒子(Panning);感染 E.coliHB2151菌株,制备可溶抗体并检测其性质;测定抗体基因序列并分析同源性及结构特征。制备出4株分泌抗人转铁蛋白可溶抗体的 E.coli HB2151菌株。抗体基因只由小鼠抗体的轻重链可变区基因构成,开放读码,无终止子,并紧接一末尾为一琥珀终止密码的 E 末端序列,其对应氨基酸序列 V_H 和 V_L 部分均遵从抗体可变区特征。实验证明,可把基因工程抗体技术应用于法医血清学,以制备新型抗体试剂。 展开更多
关键词 抗人转铁蛋白 单链抗体(ScFv) 噬菌体呈现抗体库 固相抗原选择
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抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选与在原核系统中的表达 被引量:4
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作者 陈新华 温浩 +4 位作者 张耀新 钟彦伟 成军 李克 王琳 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2002年第4期224-227,共4页
目的 筛选并表达抗细粒棘球蚴人工重组 B抗原 (r- Ag B)的人源单链可变区抗体 (Sc Fv) ,为细粒棘球蚴 B抗原蛋白质功能的研究及包虫病的基因治疗开辟新途径。 方法 采用噬菌体表面展示技术 ,以重组纯化的细粒棘球蚴 B抗原为固相抗原 ... 目的 筛选并表达抗细粒棘球蚴人工重组 B抗原 (r- Ag B)的人源单链可变区抗体 (Sc Fv) ,为细粒棘球蚴 B抗原蛋白质功能的研究及包虫病的基因治疗开辟新途径。 方法 采用噬菌体表面展示技术 ,以重组纯化的细粒棘球蚴 B抗原为固相抗原 ,经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”的筛选过程 ,从半合成的噬菌体抗体库中获得了抗原结合活性和特异性较强的含抗 r- Ag B的 Sc Fv基因片段的阳性克隆 ,提取质粒 ,经 Sfi /Not 酶切鉴定后 ,亚克隆到 p CANTAB5 E载体上 ,转化大肠杆菌 XL1 - Blue,经 IPTG诱导 ,表达可溶性 Sc Fv。 结果 筛选得到的 Sc Fv片段基因为 76 8bp,经 SDS- PAGE鉴定 ,在大肠杆菌 XL1 - Blue中表达的 Sc Fv分子质量约 2 8ku,经过 EL ISA和 Western- Blot检测 ,该单链抗体具有较强的抗原结合特性和特异性。 结论 细粒棘球蚴重组 B抗原人源单链可变区抗体筛选和表达成功 。 展开更多
关键词 噬菌体展示 人源单链可变区抗体 细粒棘球蚴重组B抗原 包虫病 原核系统
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GⅡ.17型诺如病毒人源中和性单链抗体制备及生物特性鉴定 被引量:2
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作者 王璐 侯玉珍 +4 位作者 曾志云 谢东杰 邱梦丝 张绪富(指导) 戴迎春(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第15期1860-1866,1871,共8页
目的:基于一起暴发疫情,构建人源噬菌体单链抗体库,筛选特异性GⅡ.17型诺如病毒(NoV)单链抗体(scFv),并进行表达纯化及鉴定。方法:采集患者粪便或肛拭子样本,RT-PCR检测肠道病毒核酸,PCR扩增NoV衣壳蛋白N/S区和P区序列,Mega 4.0构建系... 目的:基于一起暴发疫情,构建人源噬菌体单链抗体库,筛选特异性GⅡ.17型诺如病毒(NoV)单链抗体(scFv),并进行表达纯化及鉴定。方法:采集患者粪便或肛拭子样本,RT-PCR检测肠道病毒核酸,PCR扩增NoV衣壳蛋白N/S区和P区序列,Mega 4.0构建系统进化树。采集并分离患者恢复期外周血PBMC,Trizol提取总RNA;RT-PCR扩增抗体重轻链可变区基因,重叠扩增PCR将两者拼接为scFv基因,将其克隆至噬菌粒载体pCANTAB-5E构建人源噬菌体单链抗体库。以GⅡ.17 P颗粒为固相抗原,对抗体库进行筛选及鉴定,将阳性克隆进行原核表达及纯化,ELISA鉴定其生物特性。结果:此次疫情中,83.3%(15/18)粪便或肛拭子样本呈GⅡ型NoV核酸阳性,经序列比对分析确定由GⅡ.17型感染导致;成功构建人源噬菌体单链抗体库,以GⅡ.17 P颗粒为抗原筛选得到11株序列不同且正确的阳性克隆;经原核表达获得9株与GⅡ.17 P颗粒具有良好亲和力的高纯度scFv,且与GⅡ.4和GI.3 P颗粒均有较好的特异性交叉反应,其中7株具有较强阻断GⅡ.17 P颗粒与HBGA受体结合的能力。结论:此次疫情为一次GⅡ.17型NoV引发的急性胃肠炎暴发,构建了人源噬菌体抗体库,经淘筛及表达纯化,最终获得9株GⅡ.17型NoV单链抗体,其中7株具有较强的中和能力。 展开更多
关键词 GⅡ.17型诺如病毒 噬菌体展示技术 人源单链抗体
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荧光染料偶联抗HER-2单链抗体对乳腺癌的体内外检测研究 被引量:3
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作者 魏杰 王志国 +1 位作者 朱诚 潘振华 《标记免疫分析与临床》 CAS 2017年第6期647-650,654,共5页
目的探讨使用单链抗体偶联荧光染料的手段构建一种探针,用它进行人类表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌的体内外检测。方法通过Overlap PCR(polymerase chain reaction)的方法和柔性肽G4S将赫赛汀(曲妥珠单抗)的轻链与重链连接,构建... 目的探讨使用单链抗体偶联荧光染料的手段构建一种探针,用它进行人类表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌的体内外检测。方法通过Overlap PCR(polymerase chain reaction)的方法和柔性肽G4S将赫赛汀(曲妥珠单抗)的轻链与重链连接,构建工程载体,并通过毕赤酵母进行表达纯化,获得靶向HER-2的单链抗体;流式细胞术检测单链抗体对HER-2阳性乳腺癌细胞MDA-MB-453的结合能力;将单链抗体与碱性荧光染料罗丹明B偶联,使用激光共聚焦检测单链抗体在体外对MDA-MB-453细胞的靶向能力;将单链抗体与近红外荧光染料NIRB-NHS偶联,通过CCD照相机实时收集荧光信号,检测偶联探针在荷瘤裸鼠体内的靶向能力,并判断其开发为检测试剂的潜力。结果通过基因工程手段和毕赤酵母表达,成功获得抗HER-2单链抗体,经Western blot鉴定表明单链抗体anti-HER-2 scFv表达及装配正确。流式细胞术检测anti-HER-2 scFv与乳腺癌细胞MDA-MB-453的结合率为47.4%。体外靶向性实验验证单链抗体anti-HER-2scFv可在体外很好地靶向乳腺癌细胞MDA-MB-453,单链抗体组的细胞平均荧光强度为101.68±5.76,明显优于阻断对照组25.95±7.32。体内近红外成像实验中,通过对荷MDA-MB-453细胞移植瘤裸鼠给药后的荧光信号分析,结果显示单链抗体探针可以很好靶向至肿瘤部位,分析热点区域的最大肿瘤/正常组织荧光信号比可知,单链抗体组的信号比为4.96±0.38,明显强于阻断对照组1.12±0.41。结论采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了单链抗体anti-HER-2scFv。单链抗体保留了母本抗体的结合能力,并体现了很好的体外和体内的靶向能力,其具有应用于HER-2阳性乳腺癌检测的潜在价值。 展开更多
关键词 人类表皮生长因子受体2(HER-2) 乳腺癌 单链抗体 激光共聚焦 近红外成像
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抗表皮生长因子受体3(HER3)单链抗体的制备及鉴定
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作者 刘梦苗 何佩彦 +3 位作者 温碧燕 邱创楠 李黄金 赵林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期938-943,共6页
目的表达、纯化并鉴定抗人表皮生长因子受体3(HER3)的单链抗体(scFv).方法从NCBI查找抗HER3单克隆抗体UM716的轻链和重链序列,构建抗HER3-scFv基因;利用毕赤酵母组成性表达载体pGAPZαA构建重组表达载体,电转化毕赤酵母,筛选高表达工程... 目的表达、纯化并鉴定抗人表皮生长因子受体3(HER3)的单链抗体(scFv).方法从NCBI查找抗HER3单克隆抗体UM716的轻链和重链序列,构建抗HER3-scFv基因;利用毕赤酵母组成性表达载体pGAPZαA构建重组表达载体,电转化毕赤酵母,筛选高表达工程菌;工程菌发酵上清经疏水层析和金属离子亲和层析纯化,Weslem blot法和ELISA鉴定纯化产物.结果成功构建了抗HER3-scFv基因,获得了高表达工程菌;发酵上清经两步层析纯化,获得了纯度达95%以上的抗HER3-scFv,产率为192mg/L;Western blot结果显示抗HER3-scFv得到正确表达,ELISA结果表明抗HER3-scFv可特异识别HER3.结论成功制备了特异的抗HER3-scFv. 展开更多
关键词 人表皮生长因子受体3(HER3) 单链抗体(scFv) 表达 纯化 鉴定
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抗棘球蚴人源单链可变区抗体抑制人体包虫原头节的初步实验
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作者 陈新华 温浩 +6 位作者 刘辉 张琰 阿孜古丽·吐尔逊 林仁勇 张金辉 马旭东 郑树森 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第9期699-702,共4页
目的 建立人体包虫原头节的体外培养模型 ,评价抗棘球蚴人源单链可变区抗体(ScFv)抑制人体包虫原头节的效果。方法 无菌抽取人体包虫囊肿原头节 ,与ScFv高 (1mg/L)、中(0 .1mg/L)、低 (0 .0 1mg/L)剂量组和对照组 (等量的培养液 )共... 目的 建立人体包虫原头节的体外培养模型 ,评价抗棘球蚴人源单链可变区抗体(ScFv)抑制人体包虫原头节的效果。方法 无菌抽取人体包虫囊肿原头节 ,与ScFv高 (1mg/L)、中(0 .1mg/L)、低 (0 .0 1mg/L)剂量组和对照组 (等量的培养液 )共同培养 ,比较各组原头节死亡率和残余ScFv浓度 ,观察原头节形态学改变。结果 高剂量ScFv组原头节死亡率与对照组的差异均有统计学意义 (P <0 .0 1) ,但中、低剂量组与对照组死亡率的差异无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ,随作用天数增加 ,高剂量ScFv组原头节结构逐渐被破坏、皱缩、崩解。结论 该ScFv具备体外抑制人体原头节的作用 ,其抑制作用与剂量和时间有关。 展开更多
关键词 原头节 人体 对照组 人源单链可变区抗体 死亡率 高剂量 棘球蚴 培养液 体外培养 低剂量
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抗人免疫缺陷病毒1型gp120人源单链抗体的表达
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作者 何红霞 貌盼勇 +3 位作者 朱雷 侯俊 洪世雯 阎锡蕴 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 1998年第3期233-236,共4页
目的研究人源抗人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gp120单链抗体(ScFv)。方法以人工合成的HIV-lgp120V3环多肽为抗原,利用噬菌体抗体库技术,筛选含有抗-gp120ScFv基因的噬菌体,提取质粒,转化大肠... 目的研究人源抗人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gp120单链抗体(ScFv)。方法以人工合成的HIV-lgp120V3环多肽为抗原,利用噬菌体抗体库技术,筛选含有抗-gp120ScFv基因的噬菌体,提取质粒,转化大肠杆菌HB2151,表达可溶性ScFv。结果经SDS-PAGE和Westernblot分析,表达产物分子量为28kD左右,且具有c-myc活性;ELISA和Dotblot结果表明,可溶性ScFv具有较好的抗原结合活性和较强的特异性;竞争性ELISA实验结果进一步证明表达产物的特异抗-gp120活性。结论该技术便捷有效,可大量获得人源抗HIV抗体片段。 展开更多
关键词 HIV-1 外膜糖蛋白 GP120 人源单链抗体 表达
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特异结合人禽流感病毒H5N1的scFv分子性能鉴定
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作者 武婕 张宏斌 +6 位作者 柯昌文 陈秋霞 李晖 周杰 黄吉城 张欣 邹丽容 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2011年第4期299-303,共5页
目的从人源化噬菌体抗体库(human single fold scFv libraries I+J)中筛选到能高亲和性、特异结合人禽流感病毒H5N1的单链抗体,为建立H5N1快速筛查试剂和人源化治疗单抗奠定基础。方法以H5N1病毒的血凝素(hemagglutitin,HA)蛋白... 目的从人源化噬菌体抗体库(human single fold scFv libraries I+J)中筛选到能高亲和性、特异结合人禽流感病毒H5N1的单链抗体,为建立H5N1快速筛查试剂和人源化治疗单抗奠定基础。方法以H5N1病毒的血凝素(hemagglutitin,HA)蛋白和核蛋白(nucleoprotein,NP)为目的蛋白,对上述单抗噬菌体文库以亲和性为原理进行筛选,经过3轮筛选富集后,随机挑选了96个噬菌体克隆扩增培养,ELISA法挑选能特异性、高亲和性结合目的蛋白的噬菌体克隆,并换用HB2151宿主菌对阳性单链抗体克隆进行可溶性表达,ELISA法鉴定可溶性单链抗体的结合活性,PCR扩增阳性克隆的轻、重链基因片段,并对阳性单链抗体分子测序和序列分析。结果经过3轮筛选,分别从96个噬菌体克隆中挑选到了两株能特异结合NP蛋白、3株能特异结合HA蛋白的单链抗体,PCR扩增都得到了长为300、302和935bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段,测序结果分析发现上述5条单链抗体片段在轻链的47、49、50、51、53、54、56、96、97、98和99位的氨基酸组成不同,而特异结合NP蛋白的单链在重链区域氨基酸组成完全相同,而特异结合HA蛋白的单链在重链的44、47、85、86、87、88和89位氨基酸组成不同。结论从噬菌体抗体库中筛选到的特异结合HA和NP蛋白的单链抗体片段,可为进一步研发H5N1快速筛选试剂和人源性治疗抗体奠定基础,也可为鉴定HA和NP蛋白中的抗原决定簇提供结构信息。 展开更多
关键词 人禽流感病毒H5N1 人源化单链抗体 噬菌体文库 构建 筛选
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