Effect of Qi-protecting powder (Huqi San) on expression of c-jun, c-fos and c-myc in diethylnitrosamine-mediated hepatocarcinogenesis

AIM: To study the inhibitory effect of Huqi San (Qi-protecting powder) on rat prehepatocarcinoma induced by diethylinitrosamine (DEN) by analyzing the mutational activation of c-fos proto-oncogene and over-expression of c-jun and c-myc oncogenes. METHODS: A Solt-Farber two-step test model of prehepatocarcinoma was induced in rats by DEN and 2-acetylamino? uorene (AAF) to investigate the modifying effects of Huqi San on the expression of c-jun, c-fos and c-myc in DEN-mediated hepatocarcinogenesis. Huqi San was made of eight medicinal herbs containing glycoprival granules, in which each milliliter contains 0.38 g crude drugs. γ-glutamy-transpeptidase-isoenzyme (γ-GTase) was determined with histochemical methods. Level of 8-hydroxydeoxyguanosine (OHdG) formed in liver and c-jun, c-fos and c-myc proto-oncogenes were detected by immunohistochemical methods. RESULTS: The level of 8-OHdG, a mark of oxidative DNA damage, was signifi cantly decreased in the liver of rats with prehepatocarcinoma induced by DEN who received 8 g/kg body weight or 4 g/kg body weight Huqi San before (1 wk) and after DEN exposure (4 wk). Huqi San-treated rats showed a signifi cant decrease in number of γ-GT positive foci (P < 0.001, prevention group: 4.96 ± 0.72 vs 29.46 ± 2.17; large dose therapeutic group: 7.53 ± 0.88 vs 29.46 ± 2.17). On the other hand, signifi cant changes in expression of c-jun, c-fos and c-myc were found in Huqi San-treated rats. CONCLUSION: Activation of c-jun, c-fos and c-myc plays a crucial role in the pathogenesis of liver cancer.Huqi San can inhibit the over-expression of c-jun, c-fos and c-myc oncogenes and liver preneolastic lesions induced by DEN.

方剂槲芪散及君药槲寄生提取物对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的：探讨方剂槲芪散(HQS)及其君药槲寄生提取物多糖和总碱对人肝癌细胞SMMC-7721生长的抑制作用及细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)浓度的影响.方法：采用MTT法测定药物槲芪散(0.3125,0.625,1.25g/L),槲寄生多糖(0.625,1.25,2.5,5g/L)及槲寄生总碱(3,6,12g/L)作用48,72及96h对细胞(密度1×10\+8/L)增殖的体外抑制作用；利用流式细胞仪分析细胞周期、凋亡；利用激光共聚焦显微镜测定细胞内活性氧浓度.结果：MTT结果显示HOS及槲寄生提取物有较好的抑制肿瘤细胞增殖的作用,呈现出时间.剂量依赖性,高剂量组除了HOS和槲寄生总碱48h时间点外,A值均较对照组明显降低(HOS72h：1.022±0.13 vs 1.207±0.04,P＜0.01：96h：1.235±0.20 vs 1.602±0.05,P＜0.01；槲寄生多糖48h：0.570±0.03 vs 0.744±0.01,P＜0.01；72h：0.803±0.04 vs 1.207±0.04,P＜0.01：96h：0.860±0.13 vs 1.602±0.05,P＜0.01；槲寄生总碱72h：0.919±0.14 vs 1.233±0.04,P＜0.01；96h：0.701±0.07 vs 1.819±0.04,P＜0.01).流式细胞仪检测发现,与对照组相比,经药物作用72h后,槲寄生多糖及总碱组G1期细胞比例增加(81.0%,86.9% vs 70.0%,P＜0.01),S期(5.9%,7.4% vs 13,5%,P＜0.01)和G2期(13.1%,5.7% vs 16.4%,P＜0.01)比例降低,HOS组G1期细胞比例无明显变化,S期比例降低(1.5% vs 13.5%,P＜0.01),G2期比例增加(28.2% vs 16.4%,P＜0.01)；三者均使细胞凋亡增加(HQS：14.8% vs 6.0%,P＜0.01；槲寄生多糖：11.7% vs 6.0%,P<0.01；总碱：6.7% vs 6.0%,P＜0.05).激光共聚焦显微镜检测发现,当细胞内荧光强度呈现不断升高趋势时,加入3种药物后,荧光强度瞬间下降,然后稳定在一低水平,未见明显波动.当荧光开始稳定在一基线时,加入槲寄生总碱,荧光强度陡然增强后又迅速下降到低水平,并维持一段时间,而加入HQS及槲寄生多糖未见此变化.结论：HQS、槲寄生多糖和总碱均能抑制肝癌细胞增殖并促进凋亡.

槲芪散及槲寄生提取物对肝癌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的探讨方剂槲芪散及其君药槲寄生提取物多糖、总碱对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用及其对细胞内游离钙离子浓度的影响。方法采用MTT法测定槲芪散对细胞增生的抑制作用;利用流式细胞仪分析细胞周期、凋亡;利用激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度。结果槲芪散及槲寄生提取物有较好的抑制肿瘤细胞增生的作用,高剂量组除了槲芪散和槲寄生总碱48 h时间点外,OA值均较对照组明显降低(P<0.001),呈现出时间-剂量依赖性;经药物作用48 h后,槲寄生多糖及总碱组G1期细胞比例增加,S期细胞和G2期细胞比例降低,槲芪散组G1期细胞比例无明显变化,S期比例降低,G2期比例增加,3者均使细胞凋亡增加;加入不同浓度的槲芪散、槲寄生多糖及总碱,低浓度时荧光增强不明显,而高浓度均导致细胞内荧光强度瞬间增强,升高到一定水平后,基本维持在一高水平,除槲寄生总碱组有略微下降外,其余2组未见明显下降趋势。结论槲芪散、槲寄生多糖及总碱均能抑制肿瘤细胞增生,促进细胞凋亡,且这3种药物引起胞内钙超载可能是诱导HepG2凋亡的机制之一。

槲芪散可通过激活Hedgehog信号通路抑制大鼠肝癌前病变的形成

目的:探讨槲芪散是否通过调控Hedgehog信号通路抑制大鼠肝癌前病变的机制。方法:采用改良的Solt-Farber二步法复制大鼠肝癌前病变模型,于肝大部切除术后3 d开始给予槲芪散(8 g/kg)灌胃治疗,4周后收集血清和肝脏标本。分别采用HE染色、免疫组织化学、免疫荧光染色、Western blot、实时荧光定量PCR等方法,观察肝脏病理变化,检测肝组织谷胱甘肽S-转移酶π(glutathione S-transferase-π,GST-π)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、OV6、白蛋白(albumin,ALB)、Hedgehog信号分子Shh、Smo、Gli2及下游靶分子cyclin D、cyclin E的表达水平;利用比色法检测血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyltransferase,GGT)水平;给予Hedgehog信号通路抑制剂环杷明观察槲芪散在体外对肝卵圆细胞的影响。结果:与模型组比较,槲芪散可降低肝癌前病变大鼠血清ALT、AST和GGT水平,减轻肝癌前病变大鼠肝脏的病理变化,降低肝癌前病变标志物GST-π和AFP的表达;槲芪散可促使肝卵圆细胞标志物OV6和肝细胞标志物ALB的表达;槲芪散可激活肝脏Hedgehog信号通路,增加Shh、Smo、Gli2及其下游靶分子cyclin D、cyclin E的表达。结论:中药复方槲芪散可通过激活Hedgehog信号通路促进肝前体细胞增殖和诱导肝前体细胞向肝细胞分化,抑制肝癌前病变的形成,促进肝脏修复。

槲芪散及其君药槲寄生提取物对人肝癌细胞生长和端粒酶活性的影响

目的:研究槲芪散及其君药槲寄生对人肝癌细胞生长和端粒酶活性的影响。方法:用不同浓度的槲芪散及其君药槲寄生提取物作用于人肝癌细胞(SMMC-7721)后,用四甲基偶氮唑比色法(MTT)检测SMMC-7721细胞增殖。用实时荧光定量PCR法检测SMMC-7721的端粒酶活性。结果:(1)MTT结果显示槲芪散、槲寄生多糖和总碱能抑制SMMC-7721细胞,随药物作用时间的延长作用增强。(2)槲芪散、槲寄生多糖和槲寄生总碱能明显降低SMMC-7721端粒酶的活性。结论:槲芪散及槲寄生多糖和总碱均能抑制SMMC-7721增殖,降低SMMC-7721端粒酶的活性。

骨髓间充质干细胞在肝癌前病变大鼠肝脏内的分化及槲芪散的影响

目的:探讨骨髓源性肝脏干细胞是否参与肝癌前病变的形成,评价槲芪散对肝癌前病变的干预作用。方法:取80g体重的雄性Wistar大鼠的股骨和胫骨,用PBS冲洗骨髓,按密度梯度离心法原代分离培养骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcell,MSCs),用绿色荧光蛋白(GFP)作为追踪标记物将MSCs进行标记。将大鼠分为6组:即常规饲养组、模型组、模型+MSCs移植组、肝大部切除+MSCs移植组、槲芪散治疗组8g/kg、槲寄生总碱治疗组8g/kg。除正常对照组外,各组动物在行肝大部切除术后,选择剩余肝脏不同部位表面注射经GFP标记好的MSCs,用荧光显微镜观察GFP标记MSCs并计算标记率。用免疫荧光化学的方法检测肝脏内GFP标记的细胞。用组织化学染色的方法及Western Blot的方法分别检测大鼠肝脏-GT的表达及大鼠肝脏AFP的表达。结果:模型组及及模型+MSCs移植组的肝脏中-GT灶的数量及面积显著增多,且AFP的表达明显升高,以模型+MSCs移植组的变化更为明显,与槲芪散及槲寄生碱组比较有显著性差异。结论:MSCs参与了肝癌前病变的发生发展过程,而槲芪散及槲寄生总碱能够改善肝脏内环境,影响归巢于肝脏的MSCs的分化方向,诱导MSCs分化为正常肝细胞。