用多引物PCR分析γ射线引起人外周血淋巴细胞hprt基因突变

正常人外周血用^（６０）Ｃｏ射线分别进行１～８Ｇｙ照射后，在含６－ＴＧ的培养基上克隆和筛选人淋巴细胞ｈｐｒｔ突变细胞。细胞的突变频率与γ射线的照射剂量呈正相关．获得４２个ｈｐｒｔ突变细胞株，用８对ｈｐｒｔ寡核苷酸引物进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）从细胞粗提物中分别扩增ｈｐｒｔ各个外显子，分析突变细胞的ｈｐｒｔ基因突变，约６０％（２５／４２）的ｈｐｒｔ基因突变为基因缺失，其中１３个突变是ｈｐｒｔ基因全部缺失，而１２个是部分ｈｐｒｔ基因外显子缺失，约有４０％（１７／４２）的突变无明显的ＰＣＲ扩增变化．同时显示ｈｐｒｔ基因外显子的缺失突变与辐射剂量有关，实验结果提示，此方法有可能用于估计辐射剂量和进行辐射远后效果观察，进而揭示辐射致突的分子机理．

3,5,2',4'-四羟基查尔酮对小鼠尿酸及尿酸合成相关酶基因的影响

用氧嗪酸钾诱导高尿酸血症动物模型,对化合物3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)的降尿酸作用及尿酸合成相关酶基因进行研究。用磷钨酸法测定小鼠血清尿酸水平,用RT-PCR测定脑组织中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、肝脏中的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)和磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)mRNA的表达水平。结果表明:灌胃给予高尿酸血症小鼠P40 2、4、8 mg/kg和阳性对照药别嘌醇1 mg/kg,共给药5次,每天2次,均显著降低血清尿酸水平(P<0.05,0.01),具有显著的降尿酸作用;但对HGPRT、PRPS、PRPPAT的mRNA表达水平无明显影响。

HPLC法测定人红细胞中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性

目的:建立一种检测次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)活性的高效液相色谱法,并检测患者红细胞中HGPRT活性。方法:在5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)条件下,HGPRT催化次黄嘌呤生成次黄嘌呤核苷酸(IMP),高氯酸沉淀蛋白后进行高效液相色谱法分析。采用Hypersil ODS C_(18)(150 mm×4.6 mm,5μm)柱;流动相为磷酸氢盐缓冲液-乙腈(99.6:0.4),流速1 ml·min^(-1),在262 nm处检测IMP。应用新建立的高效液相色谱法测定68例服用过硫唑嘌呤的肾移植患者红细胞中HGPRT活性。结果:在该条件下,测得的线性范围是20～600μmol·L^(-1),检测限是20μmol·L^(-1),其日间和日内精密度均小于5%,方法回收率和提取回收率分别在100.81%～101.91%和99.05%～101.40%范围内。65例患者红细胞HGPRT活性范围为44.59～123.86 U,平均(87.83±21.55)U。结论:该法操作简便、灵敏度高、重复性好,适用于临床常规检测。

肾移植患者HGPRT活性及多态性与硫唑嘌呤所致不良反应的相关性研究

目的：本研究旨在探索次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）活性及基因多态性与硫唑嘌呤（AZA）所致不良反应的相关性,为临床合理使用AZA提供理论依据。方法：用本实验室建立的HPLC法测定入选样本的HGPRT活性,直接测序法测定HGPRT IVS6-12C〉A的基因型,结合受试者不良反应发生情况,分析HGPRT活性及多态性与AZA所致不良反应的相关性。结果：86例肾移植受者HGPRT活性范围为（44.59~262.16）U,平均为（100.17±33.50）U,健康受试者HGPRT活性范围为（28.43~153.65）U,平均为（99.30±17.21）U,均呈正态分布。两组HGPRT活性均值差异无统计学意义（P〉0.05）。304例肾移植患者中发现2例HGPRT IVS6-12C〉A突变体,突变频率为2.30%。而健康受试者中未发现突变,分析发现HGPRT活性与基因型之间无明显相关性（P〉0.05）。流行性感冒样症状组患者的平均HGPRT活性明显高于肾移植对照组[（147.47±101.24）Uvs（100.46±29.31）U,P〈0.05）],而血液毒性组、肝脏毒性组、胃肠道反应组与肾移植对照组比较,活性差异无统计学意义。AZA所致不良反应与HGPRT基因多态性之间没有明显相关性（P〉0.05）。结论：在服用AZA之前,测定患者HGPRT活性,筛选出HGPRT高活性者,减少AZA的初始剂量,有利于减少AZA所致流行性感冒样症状不良反应的发生率。

磷氧氮丙啶诱发CHO细胞HGPRT基因位点正向突变的分子特征

ＭＡＰＯ诱发的ＣＨＯ细胞ＨＧＰＲＴ基因位点突变克隆ＤＮＡ，经ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ酶切消化后，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交法，与ＨＧＰＲＴ基因探针杂交。从杂交图谱可见，正常ＣＨＯ细胞基因组ＤＮＡ经ＰｓｔＩ酶切后杂交可显出６条杂交带，其中８３ｋｂ，７６ｋｂ，６０ｋｂ，和３２ｋｂ带为Ｘ染色体连锁的ＨＧＰＲＴ基因所有，分别代表外显子２，６８，４和３，其余两条带为假基因。而经ＥｃｏＲＩ酶切后，正常ＣＨＯ细胞基因组ＤＮＡ有１７５ｋｂ和１１３ｋｂ两条ＨＧＰＲＴ基因杂交带，分别代表了外显子６９和２４。而从ＭＡＰＯ所诱发的ＨＧＰＲＴ基因突变细胞杂交图谱可见，其主要改变是ＨＧＰＲＴ基因全部缺失或部分缺失，同时出现了新的杂交带。ＰｓｔＩ酶切的７个突变克隆均显出基因缺失或新的杂交带型，而ＥｃｏＲＩ酶切８个突变克隆中，有３个无ＨＧＰＲＴ基因改变。由此可见，ＭＡＰＯ诱发ＨＧＰＲＴ基因位点突变的分子机理主要是由于基因缺失或重排。

嘌呤核苷酸补偿对海洛因依赖大鼠嘌呤核苷酸代谢相关酶基因表达的影响

目的探讨外源性补偿嘌呤核苷酸对海洛因依赖大鼠嘌呤核苷酸代谢酶的影响。方法将50只雄性Wis-tar大鼠随机分为对照组、海洛因组、海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组。采用real-timePCR的方法检测大鼠脑皮质中腺苷脱氨酶(ADA)、黄嘌呤氧化酶(XO)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)和腺苷激酶(AK)mRNA的表达水平。结果海洛因组ADA、XO的mRNA比对照组明显升高(P<0.05),而海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组与海洛因组相比明显降低(P<0.05)。海洛因组HGPRT、APRT和AK的mRNA比对照组明显降低(P<0.05),而海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组与海洛因组相比有不同程度升高,以HGPRT的升高程度尤为显著(P<0.05)。海洛因+AMP+GMP组、海洛因+AMP组、海洛因+GMP组的各项指标差异无显著性。结论海洛因在大鼠基因水平上促进嘌呤核苷酸的分解代谢,降低合成代谢,而补偿嘌呤核苷酸可以抑制或拮抗海洛因的上述作用。

6-巯基嘌呤减量治疗3例急性白血病患儿基因突变分析及临床表现

目的：分析6-巯基嘌呤（6-MP）减量化疗的急性白血病（AL）患儿维持治疗阶段临床资料及其巯嘌呤甲基转移酶（TPMT）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）基因突变情况，探讨其基因型和临床表型的相关性。方法分别提取3例AL患儿骨髓液及77例对照组儿童外周血总RNA并逆转录成cDNA，PCR特异性扩增TPMT和HGPRT基因蛋白质编码区序列并测序。采用美国国立癌症研究所第3版常规毒性判定标准（NCI CTC 3．0）对维持治疗阶段药物不良反应进行评价和分级，应用国家食品药品监督管理局（SFDA）推荐的药物不良反应关联性评价标准评价6-MP与不良反应发生的相关性。结果1例AL患儿为TPMT＊3C（Try240Cys）纯合突变基因型，减少6-MP剂量至常规剂量1/3～2/3可使骨髓抑制及肝脏毒性等重度不良反应转为轻度。对照组发现2例TPMT＊3 C杂合突变，该位点在人群中的等位基因频率为1.3％。以上两组均未发现HGPRT基因突变。结论 TPMT＊3 C纯合突变患儿可出现与6-MP剂量相关的不耐受现象，中断或减量治疗能够减少维持期间严重药物不良反应的发生。提示TPMT＊3 C基因型的检出可能有利于提高6-MP用药的安全性。

嘌呤核苷酸对海洛因依赖及戒断大鼠垂体嘌呤核苷酸代谢关键酶基因表达的影响

目的研究嘌呤核苷酸对海洛因依赖及戒断大鼠垂体嘌呤核苷酸分解代谢关键酶腺苷脱氨酶(ADA)、嘌呤核苷酸补救合成关键酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因表达的影响,阐明海洛因对垂体嘌呤核苷酸代谢的损害及嘌呤核苷酸补偿的对抗作用。方法建立海洛因依赖及戒断大鼠模型,80只建模成功的雄性Wistar大鼠随机分成对照组(生理盐水)、核苷酸组(不给海洛因)、海洛因组、海洛因+核苷酸组(同时给药)、海洛因戒断3d组、海洛因戒断9d组、核苷酸3d组(海洛因停药后给核苷酸3d)及核苷酸9d组(海洛因停药后给核苷酸9d)(每组10只)。检测垂体组织内ADA及HGPRT基因表达的情况。结果与对照组比较,海洛因组、戒断3d组大鼠垂体ADA mRNA水平有所增高,但差异均无显著性(P>0.05)。垂体组织核苷酸组HGPRT mRNA水平高于对照组(P<0.05),其他各组与对照组比较,差异均无显著性(P>0.05)。结论海洛因有增强大鼠垂体组织ADA基因表达,减弱HGPRT的基因表达作用,但作用不显著;补偿嘌呤核苷酸保持海洛因依赖大鼠垂体ADA和HGPRT基因表达的相对稳定。

高尿酸血症患者血尿酸与血清HGPRT、VitC水平的相关性

目的:探讨高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)的危险因素,为有效控制血尿酸(serum uric acid,SUA)提供依据。方法:2015年1月至12月每3个月从上海市4家医院的体检人群中筛选一批SUA≥420μmol/L的受试者,共筛选出受试者144例。入组时,对所有受试者复测SUA浓度,将SUA异常者(SUA≥420μmol/L)94例作为HUA组,SUA正常者(SUA<420μmol/L)50例作为SUA正常组。对所有受试者进行问卷调查、人体参数测量及血生化指标检测。结果:男性SUA浓度显著高于女性(P<0.001);饮酒者SUA浓度显著高于不饮酒者(P=0.01);经常运动者SUA浓度明显低于不经常运动者(P=0.004)。收缩压与SUA浓度正相关(r=0.166,P=0.047),谷类摄入量(r=-0.215,P=0.010)、血清维生素C(vitamin C,VitC)浓度(r=-0.294,P<0.001)和血清次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)活性(r=-0.236,P=0.004)与SUA浓度负相关。SUA线性回归方程是,SUA=452.87(μmol/L)+1.598×收缩压(mmHg)-0.409×谷类摄入量(g)-2.231×血清VitC(mmol/L)-0.162×HGPRT(mmol/L)。结论:谷类摄入、血清VitC和HGPRT是HUA的保护因素,收缩压是HUA的危险因素;建议HUA者(尤其是男性)应在均衡营养的基础上保证谷类摄入,增加VitC摄入,戒酒,坚持运动,并积极控制收缩压。

3,5,2',4'-四羟基查尔酮对大鼠尿酸及PC12细胞嘌呤代谢酶的影响

目的研究3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)对高尿酸血症大鼠尿酸的影响及对PC12细胞嘌呤代谢关键酶的影响.方法灌胃给予SD大鼠P40(2.0、4.0和8.0 mg/kg)5次,末次给药前1 h腹腔注射氧嗪酸钾(250mg/kg)诱导成高尿酸血症动物模型,注射后2 h取血,用磷钨酸法测定血尿酸水平及肝尿酸含量.给予PC12细胞系列浓度的P40和阳性对照药别嘌醇后培养48 h,收集细胞提取总RNA,采用逆转录聚合酶链(RT-PCR)的方法,检测嘌呤代谢关键酶HGPRT、PRPS和PRPPAT m RNA的表达水平.结果给予P40 2.0、4.0 mg/kg均能显著降低高尿酸血症大鼠的血尿酸水平,和模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01),但对肝尿酸含量没有影响.给予P40 1×10^(-8),1×10^(-7),1×10^(-6) mol/L处理PC12细胞48 h后,对HGPRT、PRPS和PRPPAT基因的m RNA表达没有明显影响,与对照组相比差异无统计学意义(P<0.01).结论在本实验条件下,P40能降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症大鼠的血尿酸水平,对PC12细胞的HGPRT、PRPS和PRPPAT基因的m RNA表达无影响.

HGPRT基因突变技术在检测化学诱变剂中的应用

本研究用Ｎ－甲基Ｎ＇－硝基亚硝基胍（ＭＮＮＧ）和苯并芘（Ｂ（ａ）Ｐ）诱导了中国仓鼠Ｖ７９细胞毒性和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（ＨＧＰＲＴ）基因突变。结果表明，ＭＮＮＧ（０．７３５ｍｇ，Ｌ－１）和Ｂ（ａ）Ｐ（１ｍｇ·Ｌ－１）引起细胞存活率分别为７４．１％和７７．８％。阴性对照如空白对照、Ｓ９对照和溶剂对照的细胞自发突变频率低于０．４３×１０－５。ＭＮＮＧ和Ｂ（ａ）Ｐ＋Ｓ９诱发Ｖ７９细胞６－巯基鸟嘌呤抗性ＨＧＰＲＴ突变频率分别为１．１７×１０－５和１．３４×１０－５，比溶剂对照高４．９０和３．３５倍（Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．０５）。提示ＭＮＮＧ和Ｂ（ａ）Ｐ对Ｖ７９细胞呈细胞毒性和遗传毒性效应。

茶多酚对^(60)Coγ射线诱发小鼠外周血淋巴细胞Hprt基因突变的影响

目的探讨茶多酚(tea polyphenols,TP)对^(60)Coγ射线诱发小鼠外周血淋巴细胞Hprt基因突变的影响。方法小鼠分为正常对照组、照射组(1、2、4、8 Gy照射),TP保护组(高、中、低剂量组分别于8 Gy照射后TP灌胃725 mg/kg、145 mg/kg、29 mg/kg),每组6只,照射后当日给药,14天后心脏取血,应用多核细胞法检测Hprt基因位点突变频率。结果 0~8 Gy^(60)Coγ射线可诱发小鼠淋巴细胞Hprt基因发生突变,且随照射剂量增加突变频率随之增加,突变频率Y(10-3)与照射剂量D(Gy)间可拟合为Y=1.1795+0.6135D。TP保护组Hprt基因突变率与照射组细胞Hprt基因突变率相比明显下降(P<0.01)。结论茶多酚对^(60)Coγ射线所诱发的小鼠外周血淋巴细胞Hprt基因突变具有保护效应。

日本血吸虫DNA鸡尾酒疫苗免疫研究

目的 研究日本血吸虫DNA鸡尾酒疫苗的免疫保护效果. 方法 制备日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）、硫氧还蛋白（thioredoxins, Trx）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine-guanine phosphoriboribosyl-transferase,HGPRT）DNA疫苗,免疫C57BL/6小鼠.C57BE/6小鼠随机分为感染对照组、空质粒对照组、pVAX1-GST免疫组、pVAX1-Trx免疫组、pVAX1-HGPRT免疫组及DNA鸡尾酒疫苗组,依次注射生理盐水,空质粒pVAX1,pVAX1-GST,pVAX1-Trx,pVAX1-HGPRT和由pVAX1-GST、pVAX1-Trx、pVAX1-HGPRT等3种质粒混合而成的DNA鸡尾酒疫苗.每组小鼠于0、2、4周经股四头肌注射免疫,每次间隔2周.末次免疫后2周,每只小鼠经腹部皮肤感染30±1条日本血吸虫尾蚴.感染后42 d剖杀小鼠,并计数各组小鼠血吸虫成虫数和肝虫卵数. 结果 pVAX1-GST、pVAX1-Trx、pVAX1-HGPRT和DNA鸡尾酒疫苗免疫组小鼠的减虫率依次为0、35.78%、47.89%和48.13%,肝减卵率依次为22.94%、34.14%、43.35%和26.77%. 结论 pVAX1-Trx、pVAX1-HGPRT及DNA鸡尾酒疫苗具有一定的抗日本血吸虫病作用,但3种疫苗联合使用并未发现有显著的协同作用.

体内基因突变试验研究进展

遗传毒性研究是新药非临床安全性评价的重要内容之一。由于遗传毒性体外细胞试验不能完全反映整体动物系统对受试物的吸收、分布、代谢和排泄等情况,而且试验结果的假阳性率过高,因此采用体外细胞试验进行药物安全性评价尚存在一定局限性。为了进一步完善对致突变风险的控制,尚需建立更加灵敏的体内基因突变试验方法。本文主要就体内基因突变试验的基本原理、优缺点及基本应用等研究进展进行综述,并对这些体内试验的发展和完善提出一些展望。