HRE1.Egr-1.yCDglyTK融合自杀基因前药系统对鼻咽癌放射增敏作用的体外实验

目的:构建缺氧/辐射双敏感性启动子HRE1.Egr-1,观察其在缺氧或放射诱导下调控yCDglyTK基因在鼻咽癌HNE-1细胞表达及yCDglyTK/5-FC对鼻咽癌HNE-1细胞杀伤效应,为探索新的鼻咽癌基因-放射治疗奠定实验基础。方法:利用基因重组技术构建嵌合启动子HRE1.Egr-1调控yCDg-lyTK基因表达的质粒载体;脂质体介导重组质粒转染鼻咽癌HNE-1细胞,建立稳定表达yCDglyTK基因的鼻咽癌HNE-1转染细胞;免疫印迹法检测在常氧、放射、乏氧、乏氧加放射等不同条件下HNE1细胞中yCDglyTK表达的强度;MTT法检测加入5-FC后对上述不同条件下稳定转染细胞的杀伤效应。结果:各组蛋白表达均有差别(P<0.01),以乏氧/放射处理最为明显;5-FC对各种条件干预下的细胞均有杀伤效应,其中以乏氧/放射处理最为明显(P<0.01)。结论:HRE1.Egr-1嵌合启动子具有放射和乏氧诱导的双重特性,可以显著增强yCDglyTK/5-FC系统在乏氧和放射干预下对鼻咽癌HNE-1细胞的杀伤效应,为鼻咽癌的基因-放射治疗开辟了新思路。

5HRE强化的肝癌靶向性自杀基因载体的构建

目的设计并构建5个拷贝的缺氧反应元件(5HRE)增强子和甲胎蛋白启动子(AFPp)联合调控的自杀基因硝基还原酶(NTR)真核表达载体。方法设计引物作重叠PCR从大肠杆菌中克隆融合有6个组胺酸基因标签(6his-tag)的自杀基因NTR,用合成的HRE寡核苷酸单链退火,多次重组克隆构建5HRE。将NTR基因、5HRE和AFPp与酶切去除了巨细胞病毒即刻早期启动子(Pcmvie)的pIRES2-EGFP载体重组,构建携带5HRE、AFPp和NTR基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-5HRE-AFPp-NTR。结果成功克隆了融合6his-tag的NTR基因,NTR基因与Genbank公布的序列一致。成功合成了5HRE,测序与预期相符。将上述片段和AFPp重组到去除了Pcmvie的pIRES2-EGFP载体上,酶切鉴定和DNA序列分析无误。结论成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-5HRE-AFPp-NTR,为下一步的体外实验奠定了基础。

5HRE和CEAp联合调控的TSST-1激活淋巴细胞特异杀伤CEA阳性肿瘤细胞

目的:研究5拷贝缺氧反应元件(5HRE)增强子和癌胚抗原启动子(CEAp)联合调控的超抗原中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)在缺氧环境下激活淋巴细胞对CEA阳性的结肠癌细胞株LoVo的杀伤作用。方法:用5HRE和CEAp构成基因表达调控元件,构建出以该元件调控跨膜型超抗原TSST-1-linker-CD80TM(TC)基因靶向表达的真核表达载体。用该载体转染CEA阳性的人结肠癌细胞株LoVo及CEA阴性的人宫颈癌细胞株HeLa,利用G418筛选稳定转染的细胞。用RT-PCR检测TC融合基因的表达。分离健康人外周血淋巴细胞(PBL),用稳定转染TC的细胞裂解物进行PBL刺激实验;将PBL与稳定转染的细胞共培养,行淋巴细胞杀伤实验;MTT法检测TSST-1促PBL增殖和PBL对稳定转染细胞的杀伤效应。结果:成功筛选出稳定转染目的基因的单克隆LoVo细胞和HeLa细胞。RT-PCR证实单克隆LoVo细胞中TC在mRNA水平的表达,且缺氧环境中的表达量更高;单克隆HeLa细胞在常氧和缺氧条件下均无TC的表达。MTT法检测发现,缺氧环境下单克隆LoVo细胞表达的TSST-1能有效激活人PBL增殖,PBL剂量依赖性的抑制表达TSST-1的LoVo细胞的生长(P<0.05);但HeLa细胞和野生型LoVo细胞不能刺激PBL增殖,PBL对其也无抑制作用。结论:5HRE和CEAp双重调控的超抗原TSST-1在体外缺氧环境下可激活人PBL特异杀伤CEA阳性肿瘤细胞。

pGL3-EPO-HRE报告基因质粒的构建及功能鉴定

目的构建串联低氧反应元件(HRE)报告质粒pGL3-EPO-HRE并进行功能验证。方法按照人促红细胞生成素(EPO)基因3′末端HRE增强子序列,人工设计合成首尾2段3′末端部分互补的单链DNA,然后通过退火及延伸合成两端带有M luⅠ和BglⅡ酶切位点的包含3个串联排布的HRE的双链DNA,克隆到T载体测序正确后,将其插入到pGL3-promoter报告载体。构建好的pGL3-EPO-HRE分别与pcDNA3-H IF-1α和pcDNA3共转染MCF-7细胞,经氯化钴(CoC l2)作用24h后测定报告基因的活性。结果质粒测序及酶切结果正确,瞬时转染实验显示,在常氧条件下,CoC l2及pcDNA3-H IF-1α可以使pGL3-EPO-HRE报告基因的活性增高约10倍(P<0.01),而且两者共同作用可以使报告基因的活性进一步增高约30倍(P<0.01)。结论pGL3-EPO-HRE可以与低氧诱导因子-1(H IF-1)结合并被激活,可以用来鉴定和检测细胞中H IF-1的表达及蛋白活性。

杂合启动子HREAF的构建及其肝癌特异性分析

本研究将在几乎所有肝癌细胞中均有高特异性的杂合启动子HREAF用于构建肝癌特异性溶瘤腺病毒。根据文献报道的缺氧应答元件(HRE)和人甲胎蛋白(AFP)核心启动子(AF0.3)基因序列,设计并合成2对引物,采用PCR方法从肝癌细胞基因组DNA中扩增获得大小分别约为.560 bp的HRE DNA片段和310 bp的AF0.3 DNA片段,连接到pGEM-T Easy载体进行测序,证明获得了HRE和AF0.3的基因片段。将HRE和AF0.3的PCR产物分别进行PstI和SspI酶切并末端补平后直接连接,将此约700 bp的连接产物克隆到pGEM-T Easy载体进行测序,证明杂合启动子HREAF构建成功。将HREAF亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle并在其后克隆入受其调控的腺病毒早期基因E1,构建成肝癌特异性溶瘤腺病毒穿梭载体pShuttle-HREAF-E1,经PCR及酶切鉴定。将pShuttle-HREAF-E1转染肺癌细胞株及AFP产量不等的不同人肝癌细胞株,经Ela的RT-PCR检测证实杂合启动子HREAF可调控目的基因在AFP产量不等的不同人肝癌细胞系中特异性高表达。杂合启动子HREAF及腺病毒穿梭载体pShuttle-HREAF-E1的构建为进一步研制肝癌特异性重组溶瘤腺病毒及其体内外肝癌特异杀伤作用的研究打下了基础。

HRE对A549细胞中Egr-1启动子辐射诱导表达的影响

目的构建乏氧/辐射双敏感启动子介导的增强型绿色荧光蛋白表达载体,探讨HRE对A549细胞中Egr-1启动子在乏氧和常氧条件下辐射诱导表达的影响。方法利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;利用基因重组技术构建HRE/Egr-1双敏感启动子介导增强型绿色荧光蛋白的表达载体pcDNA3.1-HRE/Egr-1-EGFP,经酶切、PCR和测序鉴定正确后,质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,不同剂量照射和不同浓度乏氧后,流式细胞术检测EGFP的表达,以此反映Egr-1的表达特性。结果酶切、PCR和测序鉴定pcDNA3.1-HRE/Egr-1-EGFP质粒构建正确。流式细胞术结果显示常氧条件下,不同剂量X射线照射后,A549细胞中EGFP表达在随着时间延长而逐渐增加,2Gy和4 Gy照射后12 h时达到最大,而6 Gy、8 Gy和10 Gy照射后在8 h时达到最大,而后逐渐降低,与0 h表达比较具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。0.1%-2.5%的氧浓度条件下,EGFP表达随着氧浓度和剂量的增加而逐渐增加,在1%氧浓度时表达量最大,与常氧条件下不同剂量照射后8 h表达比较具有显著性差异(P<0.05,P<0.01);在5%-10%氧浓度条件下,EGFP表达与常氧条件下基本一致。结论 HRE具有增强A549细胞中Egr-1启动子诱导表达的特性,对肿瘤基因-放射治疗具有参考意义。

HRE和hTERT修饰条件复制型腺病毒携带Egr-1介导的Smac对人食管癌细胞Eca109周期和凋亡的影响

目的探讨以HRE和hTERT修饰条件复制型腺病毒携带Egr-1介导的Smac(CARd.pE-Smac)对人食管癌细胞Eca109周期和凋亡的影响。方法利用氯化钴进行化学乏氧,病毒感染滴度为5MOI[Multiplicity of infection(virus/cell)]感染人食管癌Eca109细胞24h,并进行2Gy照射,12h后分别利用Western blotting检测Smac蛋白的表达,PI染色和AnnexinⅤ-FITC双染,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化。实验分为control、CARd.pESmac、hypoxia、2Gy、H+CARd.pE-Smac、CARd.pE-Smac+2Gy和H+CARd.pE-Smac+2Gy组。结果 CARd.pE-Smac感染常氧和乏氧的Eca109细胞后均未见Smac蛋白表达增加,而2Gy照射后,常氧、感染CARd.pE-Smac和乏氧再感染CARd.pE-Smac均能使Smac蛋白表达增加,尤其以三者联用后Smac表达增加最大;感染CARd.pESmac未对细胞周期有明显改变,而乏氧、2Gy和感染CARd.pE-Smac任二者(乏氧与2Gy除外)或者三者联用均能显著增加S期和G2/M期细胞百分比增加(P<0.05,P<0.01),尤其以三者联用作用更强;而且,对于细胞凋亡的诱导作用与周期进程变化的规律相类似。结论 HRE和hTERT修饰条件复制型腺病毒携带Egr-1介导的Smac在人食管癌细胞Eca109中显著过表达,且能够导致细胞发生S期延迟和G2/M期阻滞,并诱导细胞发生凋亡。

桑白皮多糖介导Nrf2/ARE通路减轻慢性低氧环境大鼠心肌损伤的作用

目的 探讨桑白皮多糖对慢性低氧环境所致的大鼠心肌损伤的影响,并观察其介导转录因子NF-E2相关因子(Nrf)2/抗氧化反应元件(ARE)通路的机制。方法 60只7~9周龄SD大鼠采用随机数字表分为对照组、模型组、阿托伐他汀组、桑白皮多糖低、中、高剂量组。除对照组外,其余各组均置于常压低氧舱内构建心肌损伤大鼠模型,对照组呼吸室内空气。自低氧第1天起,阿托伐他汀组给予20 mg/kg阿托伐他汀腹腔注射给药,桑白皮多糖低、中、高剂量组分别给予0.1、0.2、0.4μg/ml桑白皮多糖腹腔注射给药;对照组和模型组仅腹腔注射生理盐水。给药后24 h,苏木素-伊红(HE)染色观察各组心肌组织病变情况;原位末端标记法(TUNEL)检测各组心肌细胞凋亡率;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组血清血浆肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平;检测心肌组织Nrf2、血红素加氧酶(HO)-1、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA及蛋白、p-Nrf2表达。结果 模型组心肌严重损伤,阿托伐他汀组和桑白皮多糖各剂量组均减轻;与对照组比较,模型组细胞凋亡率、CK、LDH活性和MDA水平、Bax mRNA和蛋白表达和p-Nrf2均明显上升,SOD活性、Nrf2、HO-1、Bcl-2 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05);与模型组比较,阿托伐他汀组和桑白皮多糖各剂量组细胞凋亡率、CK、LDH活性和MDA水平、Bax mRNA和蛋白表达明显下降,SOD活性、Nrf2、HO-1、Bcl-2 mRNA和蛋白、p-Nrf2表达明显升高(P<0.05);桑白皮多糖对上述指标的作用与剂量有关。结论 桑白皮多糖可减轻慢性低氧环境大鼠心肌损伤,可能与激活Nrf2/ARE通路相关。

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的:探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。方法:构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高(P<0.001),细胞周期各期细胞数有所减少(P<0.05)。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,[HRE]hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低(P<0.01),诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高(P<0.01),G1期和G0期细胞数有所增高(P<0.05),S期细胞数减少(P<0.05)。结论:HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。

慢病毒介导的HRE-VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:通过慢病毒系统将HRE-VEGF整合基因转染至MSCs细胞,评价该新型MSCs用于缺血性心肌病的治疗的可行性。方法:运用同尾酶法构建9拷贝缺氧反应元件,并构建9HRE-VEGF表达载体。使用慢病毒系统将目的基因9HRE-VEGF转染干细胞建立转基因MSCs,检测其在不同缺氧、复氧时间VEGF的表达。结果:慢病毒系统转染MSCs具有较高的转染效率,成功构建了整合有9HRE-VEGF的新型转基因MSCs,在低氧下表达VEGF,而在常氧状态下VEGF表达关闭。结论:HRE对转导的VEGF基因表达具有调控作用,缺氧状态下VEGF稳定表达,此低氧诱导调控方式将更有利于缺血性心脏疾病的治疗。

LncRNA FGD5-AS1靶向miR-16-5p/CREB1轴减轻缺氧/复氧诱导大鼠H9c2心肌细胞凋亡的机制研究

目的:探究长链非编码RNA(LncRNA)FGD5反义RNA1(FGD5-AS1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡的影响以及对微小RNA-16-5p/cAMP响应元件结合蛋白1(miR-16-5p/CREB1)轴的调节机制。方法:将H9c2细胞分为对照组和H/R组(缺氧6 h,复氧6 h),然后将H/R组细胞分别进行转染,分为oe-NC组、oe-FGD5-AS1组、oe-FGD5-AS1+miR-16-5p mimic-NC组、oe-FGD5-AS1+miR-16-5p mimic组。实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应法(RT-qPCR)检测细胞中FGD5-AS1、miR-16-5p、CREB1的mRNA水平;蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达;CCK-8法测定细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶活性实验分别验证miR-16-5p和FGD5-AS1、CREB1的靶向关系。结果:与对照组比较,H/R组细胞中FGD5-AS1和CREB1的mRNA水平、细胞存活率、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),miR-16-5p mRNA水平、细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与H/R组和oe-NC组比较,转染过表达FGD5-AS1基因的H9c2细胞中FGD5-AS1和CREB1的mRNA水平、细胞存活率、Bcl-2蛋白表达增高,凋亡率及miR-16-5p、cleaved Caspase-3、Bax水平下降(P<0.05)。双荧光素酶活性实验验证了FGD5-AS1、CREB1均与miR-16-5p有结合位点。结论:过表达FGD5-AS1可能通过靶向下调miR-16-5p表达,上调CREB1表达,抑制H/R诱导的H9c2心肌细胞凋亡。

慢病毒介导5HRE-CEAp调控RASSF1A表达对胃癌细胞SGC7901抑制的研究

目的:探讨5拷贝低氧反应元件(5HRE)联合癌胚抗原启动子(CEAp)调控抑癌基因RAS相关域家族1A(RASSF1A)的慢病毒载体(LV-5HRE-CEAp-RASSF1A)对胃癌细胞SGC7901的体外抑制作用。方法:采用qRT-PCR方法检测空白对照组细胞SGC7901、阴性对照组细胞SGC7901/NC及慢病毒载体感染的实验组细胞SGC7901/5HRE-CEAp-RASSF1A中RASSF1A mRNA表达水平;通过CCK-8实验检测各组细胞的生长曲线;通过流式细胞技术检测各细胞的凋亡及细胞周期。结果:qRT-PCR结果显示,与其他组比较,实验组细胞的RASSF1A mRNA水平在低氧条件下明显升高(P<0.01);CCK-8实验结果显示从第3天开始,低氧条件下实验组细胞的OD值开始低于其它各组细胞(P<0.05);流式细胞检测结果显示与其它各组细胞比较,低氧条件下实验组细胞凋亡比例明显增加(P<0.01),并且其细胞周期G1期的细胞百分比明显增加(P<0.05)。结论:慢病毒载体LV-5HRE-CEAp-RASSF1A具有在低氧诱导下显著抑制胃癌细胞株SGC7901增殖的作用。

HRE对转染VEGF165基因表达的调控作用

血管内皮生长因子是一种内皮细胞特异性的促有丝分裂原，能与特异性受体结合，促进内皮细胞增殖、加速新生血管形成和增强血管通透性。缺氧反映元件与低氧诱导因子1结合来调控血管内皮生长凼子的表达。

低氧调控p53RFP基因启动子活性的初步研究

目的观察低氧对p53RFP基因表达及启动子活性的影响,探索低氧反应元件(HRE)是否参与了低氧对p53RFP基因启动子活性的调控。方法将HEK293细胞置于低氧条件下培养,实时定量PCR及Western blot检测p53RFP mRNA及蛋白表达水平;通过定点突变技术构建HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体并转染HEK293细胞,分别置于常氧和低氧条件下培养,双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。结果低氧处理不同时间点p53RFP mRNA表达水平均显著增加,差异有统计学意义(F=96.493,P<0.001);低氧组p53RFP及HIF-1α蛋白表达量均呈时间依赖性递增。成功构建了HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体,双荧光素酶报告基因检测显示,与常氧组相比,低氧条件下野生型p53RFP基因启动子活性增加(t=-19.504,P<0.001),HRE单突变或双突变后启动子活性均较野生型降低(F=160.891,P<0.001)。结论低氧可诱导p53RFP基因表达上调;成功构建了HRE突变型p53RFP双荧光素酶报告基因载体,HRE位点可能在低氧调控p53RFP基因启动子活性中发挥关键作用。

低氧细胞应激的HIF-1信号通路

低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成,在低氧下其能激活多种靶基因的转录,在细胞、组织生长发育和生理应激,以及某些病理过程中具有重要的作用。近10年来,有关HIF-1在细胞低氧应激时的信号转导通路,特别是HIF-1α介导的基因转录调控的研究取得了巨大进展。

缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定

目的检测本课题组已构建的缺氧诱导的hTERT基因启动子(5HRE-hTERTp)调控的基因表达载体调控元件的肿瘤特异性和对缺氧诱导的反应性。方法 MTT法检测不同浓度(100、200、300、400、500μmol/L)CoCl2对LoVo细胞活力以及增殖的影响。收集前期已包装成功的缺氧反应元件(hypoxia-response elements,HRE)和人端粒酶催化亚单位启动子hTERTp联合调控CDX2表达的慢病毒表达载体pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG(5HhC)病毒液,感染hTERT+LoVo细胞及hTERT-HK-2细胞,细胞免疫组化法验证该治疗载体的靶向性;复苏前期筛选的稳定表达5HhC的LoVo细胞(5HhC/LoVo),用缺氧模拟剂CoCl2模拟缺氧微环境,Western blot和RT-PCR分别检测缺氧调控下CDX2的表达水平。结果结肠癌细胞株LoVo在不同浓度CoCl2环境下随缺氧时间的延长,细胞活力及增殖均受到抑制,在高浓度(300、400、500μmol/L)作用下抑制效果更加明显;5HhC病毒成功感染hTERT+LoVo细胞,而在hTERT-HK-2细胞中不表达;Western blot和RT-PCR证实缺氧可上调5HhC/LoVo细胞中CDX2蛋白和mRNA的表达,且在300μmol/L CoCl2作用24h其蛋白表达量最高。结论缺氧微环境可明显上调hTERTp靶向性的治疗载体5HhC中抑癌基因CDX2的表达。

缺氧/辐射双敏感性启动子调控HSV-TK表达对肺癌移植瘤的作用

背景与目的放射-基因治疗是近年来国际上肿瘤治疗的新策略,由于实体瘤常处于缺氧状态而对放射敏感性低,放射-基因治疗尚未达理想疗效。本研究拟构建缺氧/辐射双敏感性启动子,增强缺氧条件下放射诱导的HSV-TK表达水平,提高肺癌放射-基因治疗效果。方法利用基因重组构建HRE-Egr启动子及其调控的HSV-TK表达载体;脂质体介导重组质粒转染肺癌A549细胞,分为对照组、放射组(6Gy)、缺氧组(1%氧浓度)和放射合并缺氧组,Northernblot法检测转染细胞中HSV-TK表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测放射、缺氧和GCV处理后的细胞存活率。建立BALB/c裸鼠肺癌移植瘤模型,检测放射合并质粒转染后移植瘤体积变化并计算抑瘤率。结果对照组细胞仅可检测到HyTK的低水平表达(21U),放射组和缺氧组HyTK基因表达水平均显著升高(分别为227U和94U),放射合并缺氧组(769U)显著高于放射组。在缺氧条件下,放射合并GCV处理后细胞存活率为(7.2±1.8)%,显著低于常氧组的(32.7±4.6)%。放射联合GCV可明显抑制HRE-Egr启动子转染肺癌移植瘤,抑瘤率达91.2%。结论HRE-Egr启动子具有辐射/缺氧双重敏感性,并使放射后的HSV-TK表达水平在缺氧下得到显著增强。放射联合HRE-Egr启动子可显著抑制肺癌移植瘤的生长。

缺氧诱导Canstatin基因表达实验研究

目的构建Canstatin基因缺氧表达增强体系,观察其在常氧与缺氧条件的基因表达量和生物学效应。方法定向克隆法构建含有缺氧反应元件(HRE)的Canstatin基因表达载体,荧光定量PCR法检测转染细胞在常氧和缺氧条件下Canstatin mRNA表达量,流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡,电镜下观察内皮细胞超微结构的改变。结果成功构建Canstatin缺氧增强表达体系。缺氧条件下该体系转染的细胞Canstatin mRNA的表达显著增强。该体系转染后人脐静脉内皮细胞出现G0-G1期阻滞并伴有大量细胞凋亡,电镜下观察到典型的凋亡改变。结论Canstatin缺氧表达体系在缺氧条件下表达量及生物学效应显著增强。

慢性间歇低氧对幼鼠认知及相关脑区CREB的影响

目的:观察慢性间歇低氧(CIH)对幼鼠认知的影响并探讨其潜在的机制。方法:取八臂迷宫训练成功的SPF级健康雄性SD幼鼠40只,随机分为:间歇低氧2周(2IH)、4周组(4IH),对照2周(2C)、4周组(4C),建立IH幼鼠模型,低氧结束后进行八臂迷宫测试,观察海马和前额叶皮层超微结构变化及cAMP反应元件结合蛋白(CREB)mRNA和磷酸化CREB蛋白的表达。结果:4组幼鼠的记忆错误次数比较均有显著差别(均P<0.05);IH各组海马及前额叶皮层神经元均出现早期凋亡和变性,尤以4IH组最为明显,对照组则基本正常;与相应对照组相比,2IH、4IH组幼鼠海马和前额叶皮层CREB mRNA和p-CREB蛋白的表达水平显著降低(均P<0.05),且以4IH组最低(均P<0.01),差异显著,两对照组之间无显著差异(P>0.05)。结论:慢性间歇低氧诱导海马和前额叶皮层神经元超微结构改变,还下调CREB的基因转录和抑制CREB蛋白磷酸化,抑制记忆相关蛋白的合成,这可能是引起学习记忆能力下降的重要机制之一。

缺氧诱导的肝癌靶向性基因治疗载体的构建和检测

目的:构建缺氧诱导的AFP基因启动子(HRE-AFPp)调控的基因表达载体,并检测该调控元件的特异性和对缺氧诱导的反应性。方法:用PCR方法从人类基因组中扩增VEGF基因缺氧反应元件(HRE)和AFP基因启动子(AFPp),将上述片段与含有报告基因(强化绿色荧光蛋白基因)载体pEGFP-1的多克隆位点连接,构建成为缺氧诱导的AFP基因启动子调控的基因表达载体(pEGFP-[HRE]AFPp)。用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的细胞系,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观测重组AFPp的活性,并用流式细胞术检测缺氧诱导是否对其有调控作用。结果:成功地将HRE、AFPp克隆到报告基因载体pWGFP-1的多克隆位点,酶切鉴定和DNA序列分析无误,荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达,流式细胞术检测证实,16 h缺氧诱导能增强EGFP的表达(P<0．01)。结论:缺氧诱导的AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体,在基因转录水平特异性调控目的基因的表达,为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础。