细胞自噬与缺氧诱导的人肺动脉内皮细胞凋亡的相关性研究

目的人肺动脉内皮细胞(HPAECs)凋亡是肺高压(PH)的始发环节和促发因素,本研究探讨细胞自噬在缺氧诱导的HPAECs凋亡中的作用。方法 HPAECs分为3组,即正常对照组(C组):常氧下培养24 h;缺氧组(H组):缺氧下培养24 h;缺氧+自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA)(H+3MA)组;3MA 10 mM预处理后再缺氧24 h。MTT法检测细胞活性,Hoechst33342染色法和Annexin V/PI流式法检测细胞凋亡,Western bolt测定细胞线粒体凋亡途径相关蛋白Caspase-3,Caspase-9,Bax,Bcl-2和自噬相关蛋白Beclin-1,Atg-12,LC-3B的表达以及探讨机制。结果①H组细胞活性较C组明显降低(P<0.05),3MA预处理加剧细胞活性降低(P<0.05);②H组细胞凋亡率较C组显著升高(P<0.05),3MA预处理进一步导致细胞凋亡(P<0.05);③H组细胞Caspase-3、Caspase-9的表达及Bax/Bcl-2表达比率较C组明显升高(P<0.05),3MA预处理进一步促进Caspase-3、Caspase-9的表达及Bax/Bcl-2表达比率的升高(P<0.05);④H组细胞LC-3BII/LC-3BI、Beclin-1和Atg-12的表达均较C组明显增加(P<0.05),3MA预处理抑制上述蛋白的表达(P<0.05)。结论缺氧诱导HPAECs通过线粒体途径凋亡,缺氧诱导的细胞自噬抑制HPAECs凋亡。

氯化钴预处理在培养分化的人神经母细胞瘤细胞株缺氧损伤中的保护作用

目的探讨氧化钴(CoCl2)对体外培养分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株的缺氧损伤保护作用及缺氧诱导因子1、2和其调节基因产物血管内皮生长因子在其中的作用。方法分化的SH-SY5Y细胞分为对照组、化学缺氧预处理组(细胞用50μmol/LCoCl2预处理3h,换液后常氧培养1h,然后在2%的低氧孵箱内缺氧28h)、缺氧组(无CoCl2预处理过程,其余同化学缺氧预处理组)。用Westernblotting法测细胞HIF-1α、HIF-2α和VEGF的蛋白表达,通过乳酸脱氢酶释放率测定、MTT细胞活力测定判断细胞损伤程度。结果化学缺氧预处理组细胞HIF-2α和VEGF的蛋白表达显著高于缺氧组(P<0.01),HIF-1α蛋白表达在两组之间没有显著性差异(P>0.05),化学缺氧预处理组细胞较缺氧组细胞存活率高、乳酸脱氢酶释放率减少(P<0.01)。结论CoCl2化学预缺氧可保护分化的SH-SY5Y细胞对缺氧产生耐受,缺氧预处理可能通过HIF-2促进VEGF的表达而产生保护作用。

TGF-β_1在低氧诱导肺动脉内皮细胞向平滑肌样细胞转分化中的作用

目的研究低氧条件下肺动脉内皮细胞(PAEC)向平滑肌样细胞的转分化及转化生长因子β1(TGF-β1)在此转分化过程中的作用。方法将经免疫磁珠法(用血小板内皮细胞粘附分子1做免疫分选标记)纯化后的原代肺动脉内皮细胞分别在常氧(含21%O2、5%CO2、74%N2)和低氧(含1%O2、5%CO2、94%N2)条件下培养1、4、7 d,用核酸干扰法(RNAi)阻断TGF-β1的表达,用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)和Western blot分别检测各组细胞TGF-β1mRNA和蛋白的表达,并用免疫细胞化学法检测平滑肌细胞标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)的表达,结合形态学观察从而判定有无平滑肌样细胞的转分化。结果低氧可增加肺动脉内皮细胞TGF-β1mRNA和蛋白的表达(P<0.05),RNAi沉默TGF-β1基因表达后可明显降低其mRNA和蛋白含量(P<0.05),随着低氧培养时间的延长,肺动脉内皮细胞转分化为平滑肌样细胞的比率逐渐增加(P<0.05);阻断TGFβ-1表达后,平滑肌样细胞的转化率明显降低(P<0.05)。结论肺动脉内皮中存在具有转分化为平滑肌样细胞潜能的细胞;低氧可明显促进转分化,TGF-β1在此转分化过程中起重要作用。

蕨麻正丁醇部位对EAHY926内皮细胞缺氧损伤的保护作用

【目的】探讨蕨麻正丁醇部位对内皮细胞缺氧损伤的保护作用。【方法】采用人脐静脉内皮细胞株(EAHY926)建立缺氧损伤实验模型,通过MTT法测定各实验组细胞代谢率;比色法测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和NO浓度;放射免疫法测定内皮素-1(endothelin-1,ET-1)的活性。【结果】3.00 mg/ml、1.50 mg/ml和0.75 mg/ml蕨麻正丁醇部位均能显著减少缺氧损伤内皮细胞LDH的外漏量,并可显著提高细胞内SOD活性,增加NO分泌、减少ET-1的生成。【结论】蕨麻正丁醇部位对内皮细胞缺氧损伤具有显著的保护作用,其机制之一可能是清除缺氧导致的内皮细胞自由基堆积,减少ET-1的释放,增加NO分泌,从而减轻内皮细胞损伤。

亚低温对缺氧/复氧内皮细胞胞间黏附分子-1表达和黏附率的影响

目的观察亚低温对缺氧/复氧内皮细胞胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达和黏附率的影响。方法以ECV304内皮细胞为研究对象,利用简易缺氧室,以缺氧模拟体内缺血性损伤,建立缺氧/复氧内皮细胞模型。将细胞分为33℃及37℃缺氧/复氧组。各组又分为缺氧6,12,18h后再复氧6h3个亚组。应用Western印迹检测两组各亚组ICAM-1的表达并应用细胞计数法检测各亚组细胞和中性粒细胞(PMN)的黏附率。结果①在缺氧6,12,18h亚组,37℃组内皮细胞表达ICAM-1的积分光密度值明显高于33℃组〔(0.185±0.026)vs(0.120±0.064)、(0.329±0.057)vs(0.218±0.027)、(0.443±0.068)vs(0.326±0.019)〕(P均<0.05)。②在缺氧6,12,18h亚组,33℃组内皮细胞和中性粒细胞的黏附率明显高于37℃组〔(29.41±1.77)%vs(22.30±3.25)%、(43.66±2.57)%vs(34.51±5.06)%、(62.92±4.82)%vs(49.68±4.34)%〕(P<0.05)。结论亚低温能有效抑制缺氧/复氧内皮细胞与中性粒细胞的黏附,其机制可能与降低缺氧/复氧内皮细胞ICAM-1的表达有关。

缺氧及血管紧张素Ⅱ体外诱导人大动脉内皮细胞损伤与银杏叶提取物的保护效应

目的实验以缺氧及血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)体外诱导的人大动脉损伤内皮细胞为对象,观察血管内皮细胞(VEC)钙离子浓度及线粒体膜电位(MMP)的变化,探讨银杏叶提取物金钠多对VEC可能的保护作用机制。方法建立VEC缺氧损伤模型;实验分别设空白对照组、缺氧组、缺氧加金钠多组、AngⅡ作用组、AngⅡ加金钠多组、缺氧和AngⅡ作用组及缺氧和AngⅡ加金钠多组等7组。各组细胞经过Fluo-3/AM负载后,用激光共聚焦显微镜测定VEC内Fluo-3的荧光强度代表钙离子浓度;各组细胞经过Rhodamine 123负载后,用激光共聚焦显微镜测定VEC内Rhodamine 123的荧光强度代表MMP。结果VEC分别经过缺氧及AngⅡ损伤后,细胞内钙离子浓度明显升高(P<0.01),MMP明显降低(P<0.01);缺氧条件下,AngⅡ可引起VEC钙离子浓度进一步升高(P<0.05),MMP较单纯缺氧或单纯AngⅡ作用进一步降低(P<0.05);金钠多可抑制细胞内钙离子浓度的升高并提高受损伤细胞的MMP。结论缺氧及AngⅡ等因素可引起VEC内钙离子浓度明显升高,MMP明显降低,金钠多明显减轻上述损伤,具有细胞保护作用。

低氧诱导因子促缺血下肢血管新生的可行性研究

目的低氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是低氧环境中起细胞调控作用的关键基因。探讨HIF-1α在细胞中的过表达是否有利于缺血性疾病的治疗。方法在体外通过腺病毒介导人HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)入人外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC),观察转染后EPC的扩增及迁移功能改变及其在裸鼠缺血下肢局部的促血管新生作用。结果转染Ad-HIF-1α后的EPC在体外细胞扩增数成倍增加,迁移功能改善(P<0.05);移植异种Ad-HIF-1α-EPC至BALB/c鼠缺血下肢后可见外源性EPC定向作用于缺血部位。Ad-HIF-1α-EPC较对照组进一步促进体内毛细血管数目增加(P<0.05),缺血面积减小(P<0.05)、缺血下肢的坏死/自体离断降低60%。结论在体外,Ad-HIF-1α感染后的EPC扩增及迁移功能改善;在体内,可促进缺血下肢的局部血管新生。

缺氧预适应抑制内皮细胞冷缺氧/温复氧损伤

目的研究缺氧预适应对内皮细胞冷缺氧/温复氧损伤的作用及可能机制。方法培养的内皮细胞ECV-304分成4组,A组,对照组;B组,冷缺氧/温复氧(A/R)组95%N2/5%CO2缺氧装置中用4℃UW液保存24h;C组,缺氧预适应组(APC),内皮细胞在缺氧前遭受4个循环短时间缺氧/复氧;D组,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)抑制组缺氧预适应前,细胞培养液中加入5μmol/L的HIF-1α抑制剂NS398,余同C组。缺氧结束后,各组37℃5%CO295%空气中复氧6h。分别以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、Western blot法检测各组HIF-1αmRNA和蛋白表达,内皮细胞保护作用通过细胞存活率(台盼蓝拒染法)、LDH释出率及ICAM-1的表达判定。结果缺氧预适应明显上调HIF-1αmRNA和蛋白表达,显著抑制冷保存内皮细胞缺氧/复氧损伤,表现为更高的细胞存活率,更少的LDH释出和ICAM-1的表达。而HIF-1α抑制剂可逆转这种保护作用。结论缺氧预适应能有效地抑制冷保存内皮细胞缺氧/复氧损伤,这种细胞保护作用可能是通过HIF-1α介导的。

低氧诱导因子-1α激动剂对内皮祖细胞生物学行为的影响

目的观察低氧诱导因子-a（HIF-1a）的激动剂对兔骨髓内皮祖细胞（EPCs）的增殖和功能的生物学影响。方法以不同浓度的HIF-1a的激动剂二甲基乙二酰基甘氨酸（DMOG）干预EPCs，检测其增殖活性、集落形成能力、一氧化氮（NO）的产量、迁移能力、衰老状态、成血管功能及相关蛋白的表达。结果DMOG能显著激活EPCs中HIF-a蛋白表达，增加细胞的活性，且成剂量依赖关系，其中浓度500μmol／L时增殖作用达到峰值。同时DMOG增加EPCs集落形成能力（P〈0．01），抑制细胞的衰老（P〈0．05），并显著提高EPCs的的迁移能力和体外成血管功能。结论HIF—1a的激活剂能显著提高内皮祖细胞增殖能力、集落形成能力、迁移能力和成血管功能。

缺氧环境对培养的血管内皮细胞的损伤

目的:探讨缺氧对血管内皮细胞(VEC)的直接损伤及影响。方法:在氧分压为3.94kPa(1kPa=7.5mmHg)低氧环境中培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),观察在不同时相点培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、6-酮-PGF_(1α)变化和细胞内聚合肌动蛋白(F-actin)的含量与细胞形态学变化。结果:在低氧分压下1小时,培养液中 LDH 活性明显高于对照组。卡马斯兰染色观察到,此时 HUVEC 的核周出现许多小空泡样变性。2小时后,除培养液中6-酮-PGF_(1α)升高外,HUVEC 胞浆中 F-actin 含量也明显降低,扫描电镜可见 HUVEC 广泛收缩、部分细胞脱落、细胞间连接分离等现象。结论:HUVEC 在氧分压低于3.94kPa 时,对缺氧的耐受约1小时。2小时后,细胞广泛收缩,部分细胞脱落及微丝大量降解,HUVEC 发展成为不可逆性损伤。

丹参乙酸镁对缺氧／复氧条件下心肌微血管内皮细胞的保护及作用机制

目的探讨丹参乙酸镁（MLB）在抑制缺氧/复氧（H/R）诱导心肌微血管内皮细胞凋亡中的作用及机制。方法体外培养及建立大鼠心肌微血管内皮细胞H/R模型，MLB浓度分别为12.5、25、50、62.5 μmol/L，通过TUNEL法检测心肌微血管内皮细胞的凋亡率及MLB的最适浓度。确定MLB最适浓度后分为正常对照组、H/R组、H/R＋MLB组及H/R＋MLB＋锌原卟啉IX（ZnPPIX）组。采用Transwell法检测细胞迁移能力，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果与H/R组比较，不同浓度的MLB均可抑制细胞凋亡，并呈剂量依赖性，50 μmol/L MLB组出现明显保护作用（P〈0.01）。ZnPPIX干预后，细胞迁移能力明显减弱（P〈0.05），细胞凋亡率明显升高（P〈0.01）。结论丹参乙酸镁能够减少缺氧/复氧诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡，其机制可能与上调血红素加氧酶（HO-1）水平有关。

HIF-2α诱导MSCs向内皮细胞分化的机制

缺氧诱导因子-2（hypoxia—inducible factor-2，HIF-2）是一种转录因子。其主要活性作用部位是HIF-2α亚基，与HIF-10L有高度同源性，但二者在基因调节中有不同的作用，HIF-2α能优先表达某些靶基因如EPO、IGF、VEGFR等，是近年来研究较热门的一种促血管新生因子。骨髓间充质干细胞（mesenchy—real stem cells，MSCs）向内皮细胞分化、促进血管新生及管腔形成在很大程度上取决于HIF-2α的调节作用，此调节过程主要依赖于VEGF／VEGFR信号途径。