单抗I-ELISA和TAS-ELISA检测百合无症病毒的研究

以抗百合无症病毒(Lily symptom less virus,LSV)的单克隆抗体为核心,建立了间接ELISA(I-ELISA)和三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)的检测方法。I-ELISA检测体系中,病叶汁液和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1∶20和1∶6 000,对病叶汁液的检测灵敏度达到了1∶2 560,可检测到提纯病毒绝对量为1.35 ng。TAS-ELISA检测体系中捕获抗体和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1∶200和1∶6 000,检测病叶汁液的灵敏度达到了1∶5 120,对于提纯病毒可检测到0.68 ng。使用美国Agd ia公司双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测试剂盒对病叶汁液的检测灵敏度为1∶2 560,提纯病毒检出量1.35 ng。用3种ELISA方法检测了采自浙江省丽水市的46个田间样品,I-ELISA、TAS-ELISA和DAS-ELISA测出的阳性样品数分别为19、21和18个,阳性率为41%、46%和39%。灵敏度检测和田间样品检测结果显示,TAS-ELISA的灵敏度高于DAS-ELISA和I-ELISA。相同样品I-ELISA所测出的OD405值和P/N值普遍高于DAS-ELISA,表明LSV单抗比多抗具有更强的特异性和更高的灵敏度。

甘蔗宿根矮化病的I-ELISA快速检测

利用从澳大利亚引进的RSD标准抗原抗体,研究建立了I-ELISA检测甘蔗宿根矮化病(RSD)的方法。通过对田间采集的样本进行检测,同时以电镜负染检测法印证,检测结果一致,表明I-ELISA能简便、快速、准确、有效地检测出RSD,为甘蔗宿根矮化病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供了技术支撑。

猪PCV2 ORF2蛋白I-ELISA检测方法的建立及猪场血清抗体检测分析

目的用猪PCV2 ORF2蛋白建立ELISA检测方法 ,有效区分猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2),并进行大规模化样本检测。方法以猪PCV2 ORF2蛋白作为包被抗原,以抗PCV2阳性血清为一抗,羊抗猪酶标物为二抗,通过预试验确定诱导温度、诱导时间、摇动转速、IPTG浓度以及反应板种类等参数,从而建立间接酶联免疫吸附方法(I-ELISA)以检测抗PCV2猪血清抗体滴度。结果采用本研究建立的ELISA方法测定山东省内4个猪场送检的316份猪血清,检出PCV2阳性率处于较高水平,表明猪群携带病毒比例很高。结论本试验建立的间接ELISA检测方法敏感度高、特异性强,可用于临床PCV2血清抗体的检测,为ELISA诊断试剂盒的研制开发奠定了基础,为建立规模化猪场PCV2感染的快速诊断方法提供了科学依据。

小鼠PVM血清抗体I-ELISA检测法的建立及其应用

对实验小鼠感染小鼠肺炎病毒(PVM)用间接酶联免疫吸附试验(IELISA)进行检测,其敏感性、特异性、重复性和稳定性均达到满意效果。结果显示,用PVM接种BHK21细胞经初、高、超差速离心浓缩制备的抗原,与仙台病毒(Sendai)、小鼠肝炎病毒(MHV)和呼肠孤病毒3型(Reo3)的免疫小鼠血清抗体不产生交叉反应,阻断抑制率大于50%;IELISA与HI对50份小鼠血清检测比较,其阳性检出率分别为30%和20%;将制备的检测抗原在-20℃保存6个月效价稳定。IELISA操作简便,适用于大批样品的检测。

I-ELISA特异诊断包虫病的研究通过鉴定

新疆军区后勤部卫生防疫大队王永辉等进行了包虫病特异诊断方法的研究。1.该研究项目采用亲和层析技术提纯了兔抗包虫特异性抗体,为建立具有较强特异性的诊断方法开辟了新途径,其特异性表现在与囊虫病、细颈囊尾蚴病没有交叉反应。2.采用酶标记技术,建立酶联免疫吸附抑制试验(I-ELISA),敏感性增强,使包虫病的阳性诊断率由70％提高到94.5％,并且消除了与囊虫病、细颈囊尾蚴病的交叉反应,降低了假阳性反应。3.

检测猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3AB经纯化后作为抗原,建立了3AB间接ELISA方法,该方法可用于判定被检动物是否感染了口蹄疫病毒.重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以兔抗猪IgG/HRP酶结合物作为第2抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法.用该方法检测了大量不同背景的猪血清,并与3ABC-I-ELISA检测结果进行比较.结果表明:3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA的总符合率为98.9%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA.

抗猪囊虫单克隆抗体的制备及应用

目的利用杂交瘤技术制备抗猪囊虫单克隆抗体,建立抑制性酶联免疫吸附法I-ELISA并应用于临床。方法运用自提的猪囊虫囊液与福氏不完全佐剂加干扰素混合免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,反复筛选及克隆化;用低温无水乙醇沉淀法分离纯化单抗IgG(腹水抗体效价1:3200);用改良的过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标单抗;用I-ELISA检测患者脑脊液和血清中囊虫特异性抗体。结果获得了3株稳定分泌抗猪囊虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗的免疫球蛋白亚类鉴定为2株IgG3,1株IgM。标记的HRP-IgG酶标单抗,经临床病例标本验证,确诊的脑囊虫病患者脑脊液63例,抗体阳性61例,阳性率为96.83％;血清标本60例,抗体阳性53例,阳性率为88.33％;其他颅内感染性疾病患者脑脊液标本240例、血清标本240例,肝肺包虫病患者血清10例,正常脑脊液25例(阑尾炎手术腰麻患者),健康志愿者血清32例,检测结果均为阴性。结论本研究制备的HRP-IgG酶标单克隆抗体经临床应用,证实对脑囊虫病有良好诊断价值。

布鲁菌病血清学检测方法的比较

[目的]比较4种布鲁菌病的血清学检测方法。[方法]分别用虎红平板凝集试验(RBT)、间接酶联免疫吸附试验(i-ELISA)、竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)、试管凝集试验(SAT)4种方法检测876份奶牛血清。[结果]RBT、i-ELISA、SAT、c-ELISA检出的阳性血清分别为543份、501份、460份、500份,阳性率分别是61.99%、57.19%、52.51%、57.08%。

甘肃省部分规模场猪细小病毒病抗体检测与分析

【方法】采用间接ELISA方法,对采自11个规模养猪场(户)的224份血清,进行PPV抗体检测。【结果】PPV抗体阳性率仔猪为72.22%、育肥猪为78.20%、母猪为83.78%。【结论】仔猪和母猪母源抗体阳性率均偏低,且个体之间抗体均存在较大差异。育肥猪群体存在较为普遍的隐性感染。

I—ELISA特异诊断棘球蚴（包虫）病的研究

采用亲和层析技术纯化的兔抗棘球蚴抗体，建立了酶联免疫吸附抑制试验（Ｉ—ＥＬＩＳＡ）。取代反应和阻断反应均无非特异反应；检测健康对照血清１２６份（人３６，猪９０），均为阴性；与猪囊尾蚴病血清１３６份（人４６，猪９０）、细颈囊尾蚴病血清３８份（羊２２、猪１６）无交叉反应；对棘球蚴病血清１８３份（人６１、羊７１、猪５１）进行检测，其阳性符合率分别为８８．５％（５４／６１）、９８．６％（７０／７１）、９６．１％（４９／５１）。

用大肠杆菌表达FMDV NSP3ABC鉴别感染与注苗动物ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法。用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准。3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样品效价。当效价小于012为阴性,介于012～013之间为可疑,大于013为阳性。根据此判定标准所测试验感染动物血清都为阳性,敏感性达100%;97.06%疫苗注射动物血清为阴性;98.39%的非免疫健康牛(未感染也未注射疫苗牛)血清为阴性。研究证实感染牛在1年以后仍能检测到3ABC抗体。这说明3ABC-I-ELISA能够鉴别FMDV感染动物和注苗动物,可作为大面积疫情监测的方法应用。

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原域的高效表达及间接ELISA方法的初步建立

重组质粒pET-2e转化宿主菌BL21(DE3),以IPTG进行诱导表达,比较不同诱导条件下目的蛋白的表达量,确定其最佳表达条件,使外源基因获得了较高水平的表达,可达菌体蛋白总量的36.6％。Western-blot检测表明表达产物具有良好的免疫反应原性。将收集的纯培养物进行超声波裂解后以镍亲和层析柱纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定了目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度,初步建立了检测CSF血清抗体水平的间接ELISA方法。以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约120头份血清样品进行检测,结果显示:使用囊素与疫苗共同免疫猪的血清抗体水平明显高于未加囊素组猪的血清抗体水平,与以往的报道一致,为以CSFV重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法的标准化奠定基础。

弓形虫感染的循环抗原检测的研究

本文首次报道应用竞争抑制酶联免疫吸附试验(I-ELISA)观察到人工感染弓形虫兔血清循环抗原的消长规律。在感染后1d即可测出循环抗原(CA),4d后CA水平升高,10—13d达高峰,然后迅速下降,感染60d后测不到。提示CA的检测对弓形虫的活动性感染具有较好的诊断价值。结果还表明I-ELISA是一种敏感、特异性高、简便而快速的检测CA的方法。

牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的初步建立

以纯化的牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测牛巴贝斯虫血清特异性抗体的间接ELISA方法。方阵试验确定的GST-MSA-2C抗原的最适包被浓度为2.5μg/mL,血清最佳稀释倍数为20倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。经对多例血清检测表明,所建ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。

禽波氏杆菌免疫荧光检测和抗体检测ELISA方法的建立与应用

采用改良的Wooldridge法提取了禽波氏杆菌外膜蛋白(OMP),通过Bradford方法测定禽波氏杆菌OMP含量为320μg/mL,SDS-PAGE电泳检测发现禽波氏杆菌P5株OMP含有5种成分,相对分子质量分别为58、47、41、36、24 ku;P8株OMP含有6种成分,相对分子质量分别为58、47、41、38、211、6 ku。将提取的禽波氏杆菌OMP免疫健康青紫兰兔,每周免疫1次,共免疫4次,获得了兔抗禽波氏杆菌OMP高免血清,以此高免血清建立了检测禽波氏杆菌的间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)方法,并对其工作条件进行了优化和筛选,试验结果表明间接ELISA抗原、抗血清最佳工作浓度分别为10μg/mL、1∶12 800,酶标二抗工作浓度为1∶5 000,最佳包被条件为4℃2、4 h,最佳封闭条件为37℃1、h;间接免疫荧光(IFA)兔高免血清释释度为1∶20,FITC标记羊抗兔IgG稀释度为1∶10,感作时间为45 min时,禽波氏杆菌特异性黄绿色荧光最清晰,非特异性荧光最弱。经临床检测证明该两种方法均具有简便、快速、特异性强的特点,为禽波氏杆菌病的流行病学、血清学调查和临床快速诊断奠定了基础。

3种奶牛布鲁氏菌病血清学检测方法的贝叶斯评估

在无"金标准"的情况下,为评估虎红平板凝集试验(RBT)、荧光偏振分析法(FPA)和间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)用于奶牛布鲁氏菌病的抗体检测能力,作者分别以RBT、FPA、I-ELISA3种方法对采自某奶牛场的血清样品进行检测,通过贝叶斯分析法对检测结果进行分析,研究3种方法检测奶牛布鲁氏菌血清抗体的敏感性(Se)和特异性(Sp)。结果显示,RBT、FPA、I-ELISA3种检测方法的敏感性(Se)分别为91.81%、95.92%和95.98%;特异性(Sp)分别为98.80%、86.54%和98.65%。本研究表明,3种血清学检测方法中以I-ELISA的检测能力最好。

水牛初乳中免疫因子和生长因子质量浓度的研究

研究水牛初乳中免疫球蛋白IgG，IgA和类胰岛素样生长因子（IGF—I）质量浓度的变化特点。用ELISA方法检测水牛分娩后7d内初乳样品的IgG，IgA和IGF—I质量浓度，同时检测3种成分在水牛常乳中的质量浓度。结果表明：分娩后3h的水牛初乳IgG，IgA和IGF—I质量浓度最高，分别为78．22g／L，8．83g／L和1099．78μg/L，常乳中的质量浓度分别为1．87g／L，0．71g／L＆358．30μg/L。IgG在泌乳的第1天内下降91．18％，IGF—I下降57．02％，IgA在头2d内下降85．84％，之后缓慢下降接近常乳。因此，水牛泌乳最初的1～2d内初乳含有丰富的IgG,IgA和IGF-I．具有很高的开发利用价值.

可溶性HLA-I检测技术和贮存血中可溶性HLA-I的浓度变化观察

本研究建立可溶性人类白细胞抗原 I类 (sHLA I)检测方法 ,并探讨贮存血中sHLA I浓度变化的意义。采用ELISA双抗夹心法定量检测 6 0例正常广东人血清中sHLA I水平和 2 0例献血员成分血中sHLA I含量。结果表明 :采用本技术时 ,可溶性HLA I最低检测限为 2 .84ng ml,批内变异系数为 5 .80 % ,批间变异系数为 9.0 0 % ,回收率≥ 98 5 7% ,广东人sHLA I平均值为 (6 99.5 4± 36 0 .10 )ng ml。贮存 2 8天的RBC和随机供者血小板的sHLA I的浓度明显高于其它成分血 ,并且与成分血中残存的白细胞数和贮存时间有关。结论 :用ELISA法检测可溶性HLA I灵敏、特异、稳定 ,在临床输血过程中可考虑选择性输注含有不同浓度可溶性HLA I的成分血。

ELISA法检测IgA肾病患者血清β_2-GPI/LDL复合物

目的建立人血清β2-糖蛋白Ⅰ/低密度脂蛋白(β2-GPI/LDL)复合物ELISA检测法,探讨其对IgA肾病的诊断价值。方法建立以抗人β2-GPI抗体为包被抗体、酶标记抗apoB为检测抗体的β2-GPI/LDL ELISA检测法,对50例IgA肾病患者和50例健康对照者检测分析。结果建立的β2-GPI/LDL ELISA检测法灵敏度0.25 U/m l,批内、批间变异系数为5.73%和10.67%,参考范围(0.66±0.17)U/m l。IgA肾病组β2-GPI/LDL水平显著高于对照组[(1.27±0.23)U/m l vs(0.66±0.17)U/m l,P<0.0001]。敏感性86%,特异性为100%。结论β2-GPI/LDL以健康对照组x-+2s即1.0 U/m l为cut off值,对IgA肾病有较高的敏感性与特异性,提示其有潜在的临床诊断价值。