牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)在MDBK细胞上的培养条件优化

本试验旨在探索对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV HL-2株)敏感的细胞种类及其在相应细胞上的培养特性和培养条件。将IBRV HL-2病毒液接种不同传代细胞,结果表明MDBK细胞对IBRV HL-2株敏感,能产生明显的细胞病变。对各种条件进行优化,结果表明接种时间、接毒量、维持液血清含量、培养基种类均对收获的病毒液病毒含量有影响。通过优化,得出最佳培养条件如下:在细胞传代后24 h接种,弃掉营养液,加入含2%血清的MEM作为维持液,接入0.01感染复数(moi)的病毒液,接种后44±2h收获,所获得的病毒液病毒含量最高。

IBRV重组gD蛋白的真核表达与间接ELISA检测方法的建立

通过优化牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD基因序列为Sf9细胞偏好密码子,转座形成穿梭载体,将质粒瞬时转染Sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统表达纯化重组IBRV gD蛋白;以制备的重组IBRV gD蛋白为包被抗原,建立检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法,并通过比对检测已知血清中和抗体效价的牛血清,验证所建立的间接ELISA方法的敏感性、特异性与重复性等指标。结果显示:本研究建立的间接ELISA方法对相关的牛病毒血清抗体无交叉反应,敏感性可达1:512,组内和组间变异系数均低于10%;使用建立的间接ELISA检测方法结合血清中和试验,对480份临床血清样品进行检测,发现两者敏感性符合率为98.18%,特异性符合率为93.33%,总符合率为96.67%。结果表明,本研究建立的检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可开发为临床适应的检测试剂盒。

IBRV DQ分离株gI基因的克隆与序列分析

通过PCR扩增得到牛传染性鼻气管炎病毒大庆分离株（IBRV-DQ）gI基因上一个398 bp的片段.扩增产物经克隆、测序,所得到的核苷酸序列与GenBank上已发表的此病毒其他分离株的核甘酸序列相比,其同源性在95.5%～99.3%,表明IBRV gI基因非常保守.在系统进化树中IBRV-DQ株与U14106.1、U14107.1株亲缘关系较近,属于同一个分支.

奶牛卵巢中一株IBRV的分离鉴定

利用MDBK细胞从奶牛卵巢中分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)毒株。设计扩增IBRV的通用引物,对卵巢组织中的病毒进行PCR扩增及测序;对卵巢组织感染MDBK细胞,进行IBRV的分离培养;测定IBRV的TCID_(50),同时利用IBRV FA进行鉴定。结果表明,分离到的病毒在MDBK细胞上产生了明显的病变;用特异性引物可扩增出特异性目的条带,目的序列与IBRV基因序列一致;该毒株的病毒滴度为10^(6.75) TCID_(50)/mL。

不同饲养方式下奶牛感染BVDV、IBRV的血清学检测

目的:了解不同饲养的方式下奶牛感染牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)情况以及对奶牛繁殖的影响,为降低感染率和提高奶牛的繁殖率提供科学依据。方法:采用完全随机抽样的方法,抽取内蒙西部地区散养牛151头,养牛场集中饲养牛176头作为研究对象。采用ELISA方法检测研究对象的血清,测定其感染性抗体。结果:患子宫炎奶牛、流产奶牛及患有肺炎的犊牛BVDV抗体检出率(32. 58%)高于BVDV抗体的总检出率(9. 79%);集中饲养牛组和散养牛组BVDV抗体检出率分别为13. 07%、9. 79%,且两组检出率差异有统计学意义(χ2=4. 65,P <0. 05);患子宫炎奶牛、流产奶牛及患有肺炎的犊牛IBRV抗体检出率(67. 42%)高于IBRV抗体的总检出率(21. 71%);集中饲养牛组和散养牛组IBRV抗体检出率分别为23. 30%、16. 56%,且两组检出率差异有统计学意义(χ2=9. 73,P <0. 05)。集中饲养牛组与散养牛组BVDV抗体和IBRV抗体双阳性感染率比较有统计学意义(χ2=5. 83,P <0. 05)。结论:不同饲养方式下奶牛感染BVDV、IBRV对奶牛繁殖有影响。集中饲养感染率高于散养饲养感染率。

BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含BVDV和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,构建了实时荧光定量PCR(qPCR)标准曲线,并对双重qPCR方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。试验结果显示,qPCR最适退火温度为54.0℃,BVDV引物浓度为0.2μmol/L,IBRV引物浓度为0.3μmol/L,BVDV探针浓度0.2μmol/L,IBRV探针浓度为0.1μmol/L。BVDV的RNA最低检测限为100拷贝/μL,IBRV的DNA最低检测限为1拷贝/μL,并具有良好的特异性和重复性,为BVDV和IBRV的同时、快速、定量检测提供了有效的方法。

IBRV在MDBK细胞中的增殖规律研究

为了探讨牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）在MDBK细胞上的增殖规律,试验用100TCID50剂量的IBRV接种MDBK细胞,在不同时间点用倒置显微镜观察细胞病变效应（CPE）,同时用TaqMan荧光定量PCR技术对病毒DNA含量进行检测,绘制病毒增殖曲线。结果表明：病毒6-12h增殖缓慢,24-72h增殖快,72-144h增殖不明显;48小时时细胞出现病变,120小时时单层细胞基本脱落。说明IBRV可以在MDBK细胞中增殖并引起细胞病变,而且CPE情况与病毒的增殖规律相吻合。

IBRV内蒙古分离株NM06 gE基因的克隆与序列分析

参考GenBank发表的牛疱疹病毒Ⅰ型全基因序列设计gE基因PCR扩增引物,以牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株NM06提取的DNA为模板,运用PCR的方法扩增gE基因,扩增产物经克隆、序列测定和拼接,结果表明:测定序列全长为2086bp,包含gE基因1793bp,其中有1728bp组成的完整开放阅读框,编码576个氨基酸。将NM06株gE基因序列与GenBank发表的参考毒株核苷酸序列相比,与4株BHV-1病毒的同源性在99.3%～99.9%;与2株BHV-1.1型分离株同源性高达99.5%、99.6%;与BHV-1.2型分离株同源性为93.4%。从进化树中也可以看出:NM06株与BHV-1.1型分离株属于同一个进化分支,而BHV-1.2BH83株属于另一个进化分支,可以推测IBRVNM06分离株属于BHV-1.1型。NM06株与牛疱疹病毒5型N569病毒的同源性为82.9%,与鹿疱疹病毒2型Norway4病毒的同源性为72.6%。

IBRV与MB二温式多重PCR检测方法的建立

本研究根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛支原体(MB)的保守基因设计了两对特异引物,建立了可同时检测IBRV和MB的二温式多重PCR检测方法。结果表明,IBRV和MB的扩增长度分别为727bp和412bp,而其他对照病毒的检测结果均为阴性;该方法的IBRV和MB标准品最低检测限均为104拷贝。

牛精液中IBRV荧光PCR检测方法的建立及精液带毒与血清抗体的关系

【目的】建立牛精液中牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的荧光PCR检测方法,并分析精液带毒与血清抗体的关系,为牛精液中IBRV的荧光PCR诊断和判定提供技术依据。【方法】采用Sephycral S-400凝胶过滤法和蛋白酶K预消化法,分别对新鲜牛精液和冻存牛精液进行处理,用DNA Zol方法提取病毒核酸,通过PCR反应条件的优化,建立了牛精液中直接检测IBRV的荧光PCR方法,对该方法进行特异性和重复性检验;最后用该方法分别对120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液进行检测,同时用普通PCR方法和病毒分离方法加以对比;并对其中的10头牛定期采集精液、鼻腔拭子和血清样品,用该荧光PCR方法进行病原检测,对血清样品进行IBRV抗体检测。【结果】建立的荧光PCR方法具有较好的特异性,重复性和稳定性很好。用该方法可检测到新鲜牛精液中0.002 TCID50的病毒粒子,检测到冻存牛精液中0.02 TCID50的病毒粒子,检测时间在3 h之内,是OIE已报道方法灵敏度的40～400倍,是病毒分离方法灵敏度的100倍。120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液中,检测到阳性样品25份,用普通PCR检测得到阳性样品15份,病毒分离检测得到阳性样品12份。检测结果表明,精液为阳性的牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性的牛精液中也不一定携带病毒。【结论】建立了牛精液中IBRV的荧光PCR检测方法;通过分析精液带毒与血清抗体的关系,进一步表明不能简单地以血清抗体阴阳性作为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒具有间歇性。

IBRVgB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank登陆的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer Express 3.0分别设计2对特异引物及其相应的TaqMan探针,优化反应体系后,建立牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。本方法利用10倍稀释的标准品进行扩增确定该方法的灵敏性,通过对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)等检测验证特异性,并进行临床检验。结果显示,建立的IBRV gB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的灵敏度为11个拷贝/μL,而且与PRV等非IBRV无交叉反应。本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确、等优点.可用于IBRV的检测。

IBRV TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法在BVDV和IBRV共感染中病毒定量检测的应用

目的应用牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)Taq Man-MGB实时荧光定量PCR方法进行牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和IBRV共感染的病毒定量检测,进一步研究BVDV和IBRV共感染后BVDV对IBRV复制的影响。方法分别用0.2和1.0 MOI的BVDV感染MDBK细胞,待细胞出现50%CPE时,再用0.1 MOI的IBRV共感染,作用24 h后收集样品,采用Taqman-MGB实时荧光定量PCR方法检测IBRV的拷贝数,并与对照组(IBRV单独感染组)进行比较。结果在先感染0.2和1.0 MOI BVDV情况下,IBRV拷贝数分别为3.0×10~6和6.47×10~6拷贝/μL,单独感染IBRV的对照组的拷贝数为1.15×10~7拷贝/μL。结论在体外情况下,BVDV对IBRV的复制影响较小,为研究BVDV和IBRV的共感染机制以及制备BVDV和IBRV感染同一细胞的二联苗奠定了基础。

低温常压等离子体提高MDBK细胞中IBRV病毒滴度的作用与机制研究

加强病毒的繁殖可以帮助MDBK细胞生产更多的IBRV病毒用于生产灭活病毒疫苗。已证明低温常压等离子体(Cold atmospheric plasma,CAP)是一种依靠活性氧来实现MDBK细胞中病毒显著增殖的物理方法,可有效增强病毒的传播,其中牛鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotrachieitis virus,IBRV)和牛肾细胞(Madin-Darby Bovine Kidney,MDBK)分别被用作模型所需病毒和细胞系。CAP被证明与病毒感染具有协同作用,可以在G2/M期阻止宿主细胞分裂增殖,降低细胞膜电位,增加细胞内钙离子水平并诱导细胞选择性自噬。通过检测免疫相关蛋白表达,CAP被证明可以抑制病毒触发的免疫原性信号传导。综上所述,我们证明了CAP触发了宿主资源对病毒繁殖的最大化,这有利于病毒疫苗的生产,并为在医疗和卫生领域应用CAP开辟了新的可能。

FINE STRUCTURE OF INFECTIOUS BOVINE RHINOTRACHEITIS VIRUS (IBRV) ENVELOPE

IBRV belongs to the herpesvirus group. Herpesvirus can obtain a sheet of special biomembrane as its envelope by several ways. The envelope is closely related to the antigenicity and stability of virus particles, also the ability of attachment to and penetration into host cells. Biochemical study of these viruses shows that there are virus-specific glycoproteins on the envelope of herpesvirus, possibly all the viral glycoproteins exist on the en-

BVDV/IBRV主要抗原表位E2/gD基因串联表达及免疫原性

为开发研制牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV)及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的联合亚单位疫苗,开展了BVDV E2蛋白、IBRV gD蛋白主要抗原表位串联表达及免疫原性研究。利用2步PCR法获得E2-gD基因,构建原核表达载体pET28a-E2-gD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达,BCA工作盒测定纯化蛋白浓度为2.69 mg/mL;Western-blot结果显示其具有作为免疫原的特异性;免疫家兔制备抗血清,血清中和试验结果表明,中和抗体效价为44.7(IBRV)/22(BVDV)。这说明E2-gD蛋白免疫原性较好,可诱导产生较高效价的中和抗体。

IBRV gD蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

利用生物学软件分析牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白的抗原决定簇,发现相应的核酸序列,设计特异性引物用PCR扩增IBRVgD基因片段并克隆到原核表达载体pET-32a中,通过双酶切鉴定正确和测序正确后进行诱导表达。利用间接ELISA方法和Western blot鉴定gD重组蛋白的免疫原性和反应原性。最后将gD重组蛋白用作包被抗原,并通过优化相应的反应条件建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的gD重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,间接ELISA阴阳性临界值为:D450nm值=0.23。重组抗原gD与口蹄疫、牛病毒性腹泻、赤羽病、副结核病、布鲁菌病、结核病等阳性血清无交叉反应,具有比较好的特异性。组内和组间变异系数均小于5%,重复性较好。建立的ELISA方法结果显示,当测试相同的200个临床血清样本时,与IDEXX牛传染性鼻气管炎病毒gB X3抗体检测试剂盒相比,两者符合率为96%。本试验为IBRV抗体间接ELISA检测试剂盒的开发奠定了基础。

原位土壤镉铜铅复合污染对天锡杜拉蚓(Drawida gisti)的毒性效应

为探究河北省保定周边地区重金属(Cd、Cu与Pb)污染土壤对蚯蚓的毒性效应,采用室内培养方法,分别在清洁土(S0)和2种原位重金属[Cd-Cu(S1)和Cd-Cu-Pb(S2)]污染土壤下,研究野生蚓—天锡杜拉蚓(Drawida gisti)暴露7、14和28 d后生物量变化、重金属富集及其生化响应特征。结果表明:1)随暴露时间增加,S1与S2污染土壤下天锡杜拉蚓的生物量均显著下降(P<0.05);2)S1与S2处理下蚯蚓重金属富集系数(BAF)均表现为Cd>Pb>Cu,且S1处理下BAF均大于S2下结果,这与污染土中重金属有效性有关;3)采用IBRv2指数分析蚯蚓体内生化指标(TP、GPx、GSH、MDA和AChE)的变化趋势。前期暴露7 d时S1与S2处理下蚯蚓体内各项生化指标响应剧烈,表现为机体氧化胁迫、脂质损伤、神经抑制和蛋白消耗,GSH与GPx参与解毒过程等现象;14 d时蚯蚓体内各项指标趋于平缓(MDA降低,AChE与GPx活性抑制);28 d时S1与S2处理下蚯蚓响应呈相似趋势(GPx与AChE激活)。根据IBRv2综合指数,S1与S2处理下天锡杜拉蚓IBRv2指数呈先升后降趋势,其中14 d时机体应激反应显著;随着暴露时间的增加,Cd-Cu复合污染土壤对天锡杜拉蚓在生化水平上的毒性效应表现更强。研究结果可为土壤重金属Cd、Cu和Pb复合污染对蚯蚓的生态风险评价提供理论依据。

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中IBRV gB(UL27)和BVDV 5’-UTR基因序列分别合成特异性引物,优化反应条件,建立了能够同时检测IBRV和BVDV的双重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性进行了测试。结果显示:该方法对IBRV、BVDV和IBRV/BVDV可分别扩增出500、198、500/198 bp的特异性目标条带,对牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛细小病毒、牛纽布病毒和牛支原体检测结果均为阴性;对混合液中IBRV、BVDV的最低检测限分别为10^(4)和10^(3)copies/μL;3次重复性试验结果一致。采用建立的方法对79份临床可疑牛血清样品进行IBRV、BVDV和IBRV+BVDV检测,阳性率分别为12.66%、17.72%和8.86%,与IBRV和BVDV单重PCR检测结果符合率分别为90.00%和93.33%,两种病原混合感染的阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的IBRV和BVDV双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,为兽医临床快速诊断IBRV和BVDV提供了一种方便、快捷的分子生物学检测手段。

牛病毒性腹泻病毒1型RT-RAA快速诊断方法的建立

为解决牛病毒性腹泻病毒(BVDV)现场快速诊断难点,提升应急响应速度,根据BVDV 1型基因组5’-UTR保守区序列设计特异性引物和探针,建立了BVDV 1型重组酶聚合酶等温核酸扩增方法(reverse transcription recombinase aid amplification,RT-RAA),并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果显示:该方法在39℃等温条件下检测时间为20 min,对BVDV 1型核酸检测下限为1.2×10^(2) copies/μL;3个浓度梯度的核酸组内重复性试验的变异系数(CV)分别为3.24%、9.48%和8.79%,均在10.00%以内,重复性好;建立的方法与猪瘟病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等无特异性反应。对66份临床样品进行检测,发现所建立的方法与荧光定量PCR检测结果符合率为98.48%,Kappa值为0.881(P<0.001)。结果表明,本研究建立的RT-RAA快速诊断方法特异性强、灵敏度高、操作便捷,可用于BVDV 1型的现场快速检测。

一起牦牛呼吸道疾病的病原学诊断

2022年2月,川西北某地牦牛暴发以呼吸道症状为突出特征的传染病。为确定病因,对发病牦牛进行了相关病原的病原学诊断。共采集13头发病牦牛的20份病料,采用PCR方法对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛腺病毒3型(BAdV-3)以及多杀性巴氏杆菌(P.multocida,Pm)、溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica,Mh)和牛支原体(M.bovis,Mb)等9种牛呼吸道病原进行检测。结果显示:在20份样本中共检测出IBRV、BAdV-3和Pm 3种病原,且存在混合感染,其他病原未检出;4份全血样本中检测出3份IBRV、1份BAdV-3阳性,1份胎盘组织样本中检出IBRV阳性,8份鼻拭子样本中检出3份IBRV、5份BAdV-3阳性,2份流产中阴道拭子中检出2份BAdV-3阳性,5份肺脏组织样本中检出4份Pm阳性;进一步对IBRV和Pm进行分型鉴定,确定该地牦牛感染的为1.2型IBRV和A型Pm。结果表明,引发该地牦牛呼吸道疫病的是1.2型IBRV、BAdV-3和A型Pm。本研究证实了BAdV-3与1.2型IBRV在该地牦牛中的存在和流行,为当地牦牛呼吸道疾病防控提供了参考。