百合无症病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

应用DAS-ELISA,RT-PCR和IC-RT-PCR技术检测百合无症病毒(LSV)。结果表明:RT-PCR和IC-RT-PCR分别可从2ng和200ng百合叶片组织中检测出LSV,分别是DAS-ELISA敏感度的1000倍和10倍。百合鳞茎的不同取样部位对PCR检测结果的影响较大,RT-PCR难以从鳞片和根部检测出病毒,但IC-RT-PCR可以检测出病毒。

DAS-ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的比较研究

在生长季节分3次对部分葡萄品种枝条上部、中部和下部叶片及韧皮部,进行双抗体夹心法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)3种方法检测卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)的比较。结果表明:DAS-ELISA的检出率明显低于RT-PCR和IC-RT-PCR方法。RT-PCR可以检测出RNA提取液为1:10-4的GLRaV-3病毒,但它受到了提取RNA难以及其它物质(如蛋白质、DNA等)干扰的影响,检测难度增加。从检测的灵敏度来看,RT-PCR和IC-RT-PCR比DAS-ELISA灵敏;并且,IC-RT-PCR比其它两种方法较快,整个过程仅需8h。

烟草环斑病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法研究

根据TRSV CP基因的保守序列设计引物,RT-PCR和IC-RT-PCR能从TRSV的2个分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带,序列测定和分析表明所扩增序列为TRSV CP基因的部分序列,在系统关系树上与TRSV的其他分离物形成一簇,表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。

检测砂梨潜隐病毒的IC-RT-PCR和TC-RT-PCR的研究

以砂梨为试材,在生物学和血清学检测的基础上,采用免疫捕作RT-PCR穴IC-RT-PCR雪和试管捕作RT-PCR穴TC-RT-PCR雪技术,对苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)进行了检测分析。结果表明,TC/IC-RT-PCR均能有效检测梨粗提液中的ACLSV和ASGV,分别获得了大小约358bp和499bp的目标扩增片段;但IC-RT-PCR检测ACLSV的效果受到病毒分离株间血清学关系影响。与传统的RT-PCR相比,IC/TC-RT-PCR不仅灵敏度更高,而且不需提取总RNA,可以简化操作程序和减少苯酚、氯仿类有机试剂对人体的伤害和对环境的污染,适合于大量梨样品的病毒快速灵敏检测。

豇豆花叶病毒和黑眼豇豆花叶病毒RT-Realtime PCR及IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Realtime)PCR检测方法以及双重IC-RT-Realtime PCR检测方法。该单重及双重IC-RT-Real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点,适用于豆类种苗中对CPMV和BlCMV的检测。

应用IC-RT-PCR方法检测齿兰环斑病毒和建兰花叶病毒

根据已报道的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因序列设计PCR引物,建立了蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒IC-RT-PCR检测方法。用该方法对天津地区8个蝴蝶兰标样检测,结果显示:8个标样中有4个检测到建兰花叶病毒,另外4个检测到齿兰环斑病毒。该方法简化了操作程序,为蝴蝶兰种苗病毒的快速检测奠定了基础。

IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的研究

结合ELISA和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的特点,引入了另外一种方法,即免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)对葡萄卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)进行了检测。从免疫捕捉病毒、释放RNA到反转录成cDNA,最后扩增出了约300bp的预期目的片段。为了进一步明确PCR扩增的特异性,将PCR产物连接到pGEM-T载体上,转化大肠杆菌E.coliJM109菌株,通过蓝白斑筛选,获得重组质粒,提取质粒DNA,经酶切对重组质粒进行鉴定,结果得到了含有目的片段的重组质粒。由此证明,IC-RT-PCR检测GLRaV-3结果准确可靠。最重要的是它弥补了ELISA易出现假阴性、假阳性以及RT-PCR提取RNA难等的缺点,不失为病毒检测的新型方法。

蓝莓休克病毒IC-RT-nested PCR检测技术

【目的】蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是蓝莓上主要病毒之一,侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR技术,为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据GenBank已报道的BlShV基因序列,设计一对外侧引物(BlShV-F/BlShV-R)和一对内侧引物(BlShV-1/BlShV-2),以感染BlShV的蓝莓病叶为材料,利用免疫IC-RT-PCR(免疫捕获RT-PCR)和nested PCR(巢式PCR)建立BlShV的IC-RT-nested PCR检测技术;分别以BlShV、蓝莓焦枯病毒(Blueberry scorch virus,BlScV)、蓝莓带化病毒(Blueberry shoestring virus,BSSV)、蓝莓叶斑驳病毒(Blueberry leaf mottle virus,BLMoV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)和健康蓝莓叶片为对象,测定该检测技术的特异性;将BlShV第1轮、第2轮PCR产物分别回收纯化后连接到pMD18-T载体,连接产物转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,进行测序和序列比对验证该检测技术的准确性;将感染BlShV的蓝莓病叶提取液用健康蓝莓叶片提取液进行10倍梯度稀释,测定该检测技术的灵敏度,并与DAS-ELISA方法相比较;利用建立的IC-RT-nested PCR对收集的中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品(53份)和进境美国蓝莓叶片(15份)进行实际检测,并对上述样品采用普通RT-PCR方法进行验证。【结果】建立的IC-RT-nested PCR方法成功从感染BlShV病叶提取液第1轮PCR扩增出约746 bp大小的目的片段,第2轮PCR扩增出约486 bp大小的目的片段,未从健康蓝莓叶片提取液和空白对照扩增出目的片段;特异性测定结果表明,IC-RT-nested PCR具有良好的特异性,仅从感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR分别扩增到目的片段,而从BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康蓝莓叶片提取液第1轮、第2轮均未扩增到相应的目的片段;序列分析结果显示,感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR产物的序列同预期大小完全一致,分别为746、486 bp,将获得的两轮PCR产物序列与GenBank数据库中的BlShV基因序列进行比对,结果显示第1轮、第2轮PCR产物的序列与已报道的BlShV核苷酸序列一致性均达99%,证实两轮PCR产物均为BlShV特异性产物,进一步验证了扩增结果的准确性;灵敏度测定结果表明,IC-RT-nested PCR的第1轮PCR能够检测到稀释102倍的BlShV病叶提取液,灵敏度与DAS-ELISA相当,经过第2轮PCR,灵敏度提高100倍,能够检测到稀释104倍的BlShV病叶提取液;蓝莓样品IC-RT-nested PCR测定结果显示,2份来自于美国的蓝莓叶片样品扩增出大小约486 bp的目的片段,BlShV检出率为13.3%,而中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品上均未扩增出相应的目的片段,未检测到BlShV,该检测结果与普通RT-PCR验证结果完全相符,表明建立的IC-RT-nested PCR能够用于蓝莓样品的实际检测。【结论】建立的IC-RT-nested PCR具有快速、特异、准确和灵敏的优点,适合于田间和进出境口岸蓝莓样品上BlShV的检测鉴定。

应用IC-RT-PCR方法检测水仙中百合斑驳病毒

水仙病毒严重影响水仙的品质与规模化生产，而快速检测水仙病毒可以有效防控其危害与扩散。根据已报道的百合斑驳病毒外壳蛋白基因序列设计PCR引物，利用免疫捕获PCR检测了水仙样品中百合斑驳病毒。PCR扩增产物回收后克隆到PMD19-T载体中测序。把克隆得到的百合斑驳病毒外壳蛋白基因部分序列提交到Genbank中。结果表明：基因登录号为JF714974，克隆的百合斑驳病毒外壳蛋白基因部分序列与国内外百合斑驳病毒同源性为90．4%～99．5％。建立了水仙中百合斑驳病毒的IC-RT-PCR的检测方法，简化了试验步骤，适合于水仙中百合斑驳病毒的快速检测。

葡萄A病毒的IC-RT-PCR检测研究

葡萄A病毒是葡萄皱木综合证的病原之一,通常与其它病毒混合发生,造成葡萄产量的损失。为有效检测葡萄A病毒,该研究建立了免疫捕获-反转录-聚合酶链式反应检测方法(IC-RT-PCR),将免疫学和核酸扩增技术结合起来使用。结果表明:IC-RT-PCR方法检测的特异性较强,检测葡萄A病毒2个株系的结果为阳性,检测葡萄扇叶病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒结果为阴性。该方法检测提纯葡萄A病毒的灵敏度为10ng/mL,检测葡萄A病毒感染的Nicotiana benthamiana叶片可稀释到10-6。

TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国重要的检疫性有害生物,BPMV传入的风险随大豆进境数量增多而加大。本文针对菜豆荚斑驳病毒,以大豆种子提取液为材料,分别建立了TaqMan-MGB荧光定量IC-RTPCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR快速检测方法。根据GenBank公布的BPMV外壳蛋白基因序列,选择其保守区域,设计1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,测定了TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR方法的特异性和灵敏度,并将TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR、TaqMan-MGB荧光定量TC-RTPCR、IC-RT-PCR和TC-RT-PCR 4种检测方法的灵敏度进行比较。结果表明:所建立的两种检测方法特异性良好;TCRT-PCR的灵敏度为10-1倍病毒提取液原液;IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR灵敏度相当,为10-3倍病毒提取液原液;TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR灵敏度最高,为10-5倍病毒提取液原液,是IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR检测方法的102倍,是TC-RT-PCR检测方法的104倍;两种检测方法均能较好应用于实际大豆样品的检测。本文所建立的TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测方法利用抗原特异性或试管非特异性捕捉病毒粒子,无需提取RNA,为进境大豆种子上BPMV的检测提供了稳定、快速、简便的技术依据,其较高的灵敏度和特异性具有较好的应用价值。

马铃薯X病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是侵染马铃薯重要病毒之一,通常引起花叶症状,在田间常与其他病毒混合感染导致马铃薯的毁灭性减产。PVX尚无有效的药剂可以防治,加强对PVX的快速检测是一个亟待解决的课题。本研究应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)技术检测马铃薯X病毒。结果表明:IC-RT-PCR方法可检测出稀释至1.0×10-3的粗汁液中的病毒;RT-PCR方法可从稀释至1.0×10-4的总RNA中扩增出特异的目的条带。这两种方法均具有较高的检测灵敏度,均可用于马铃薯X病毒的检测。

免疫斑点法和免疫捕获RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科作物上重要的病毒之一.用提纯的黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫新西兰大白兔制备CGMMV的多克隆抗体.该多克隆抗体的间接ELISA效价达1∶512 000,与CGMMV17.5 ku外壳蛋白有特异性反应,而与烟草花叶病毒、齿兰环斑病毒和健康植物没有任何反应.用ACP-ELISA分析多抗灵敏度表明多抗检测1∶40 960倍稀释的CGMMV病叶时仍呈阳性反应.用该多抗建立了检测CGMMV的免疫斑点法(dot-ELISA)和免疫捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR).病叶汁液可被dot-ELISA检出的最大稀释度为1∶10 240.IC-RT-PCR从感染CGMMV的病叶组织中扩增到与预期大小相同的480 bp DNA条带,且当CGMMV病叶稀释1∶163 840倍时检测仍呈阳性.检测CGMMV的dot-ELISA和IC-RT-PCR方法的建立为该病毒病的诊断和控制提供了技术支撑.

Detection and Comparison of Pathogen of Virus Disease in Pumpkin by RT-PCR and IC-PCR

Two kinds of methods RT-PCR and IC-PCR were used to detect pathogen of virus disease of pumpkin and the sensitivity of the two methods was compared. The results showed that PRSV-W and CMV were detected in diseased samples gathered in Yunnan Province, while WMV and CMV were detected in diseased samples gathered in Heilongjiang Province. The sensitivity of RT-PCR is higher than that of IC-PCR, but the effect of IC-PCR in the specialization of bonding reaction and requisition for experiment material is better than that of RT-PCR.

菜豆荚斑驳病毒免疫捕获一步RT-PCR检测

【研究目的】建立快速、准确、简便的检测大豆种子上菜豆荚斑驳病毒的免疫捕获一步RT-PCR方法(一步IC-RT-PCR)。【方法】采用抗原捕获和一步RT-PCR相结合的方法,并通过反应条件优化,确定一步IC-RT-PCR的反应程序,同时对该方法的特异性及实际检测效果进行验证。【结果】成功建立了一步IC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒方法,能够从感染菜豆荚斑驳病毒的大豆种子上扩增出预期大小的特异性片段,而对其他病毒及健康大豆无特异性反应;应用该方法对不同产地大豆种子样品进行检测,结果从来自美国的大豆样品中检出菜豆荚斑驳病毒,检出率为50%。【结论】一步IC-RT-PCR方法可以快速、准确地检测大豆种子上的菜豆荚斑驳病毒,适用于口岸检验检疫。

应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测TGF-β1诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞中PAI-1mRNA表达

目的应用SYBR荧光实时定量RT—PCR法检测转化生长因子-β1（transforming growth factor betal，TGF-β1）诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts，KFS）中纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor1，PAI-1）mRNA的表达。方法体外分离培养KFs，应用不同浓度（1．25～20pmol·L-1）TGF-β1刺激KFs3h或TGF-β1（10pmol·L-1）刺激KFs不同时间（0．5～6h），采用SYBRGreenI荧光实时定量RT—PCR法检测，以B—actin基因作为内参，计算各组PAI-1mRNA的相对表达量。结果与空白对照组相比，TGF-β1能明显诱导KFs中PAI-1mRNA的表达，10、20pmol·L-1浓度组表达比值分别增至4．19及4．44倍（P〈0．01）；TGF-β1（10pmol·L。）的1、2h时问组表达比值分别增至2．29及2．41倍（P〈0．05），3、6h时间组分别增至4．19及5．83倍（P〈0．01）。提示，TGF-β1诱导KFs中PAI=1mRNA表达的最适浓度为10pmol·L-1、最适时间为3h。结论利用SYBR荧光实时定量RT—PCR法检测TGF-β1诱导KFs中PAI-1mRNA的表达，为进一步研究瘢痕疙瘩中TGF-β1信号通路的靶基因调控机制，以及开发治疗瘢痕疙瘩的新药提供了基础。

竞争RT-PCR方法检测Ctr1基因mRNA变化的内参构建

构建定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)的内参标准 ,用以检测铜代谢过程中Ctr1基因mRNA表达的变化情况。采用双引物 ,经 2次克隆将 4 0 0bp左右的外源基因片段插入到 5 30bp目的片段的单酶切位点中 ,构建成突变型DNA阳性竞争重组质粒。结果 ,成功构建了 930bp左右的竞争模板重组质粒。

RT-PCR检测乳腺癌患者外周血表皮生长因子受体和细胞角质蛋白-19mRNA的表达

目的 探讨逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR )方法检测乳腺癌患者外周血表皮生长因子受体(EGFR)mRNA作为乳腺癌循环肿瘤细胞标志的可能性及意义。方法 以转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,分别对40例乳腺癌患者和30例健康人静脉血进行EGFRmRNA检测,同时与目前研究较多的循环上皮细胞标志:细胞角质蛋白CK-19的mRNA做比较。结果 在30例健康人外周静脉血中没有发现EGFRmR NA的表达( 0% ),但有8例CK-19阳性( 26. 7% )。而40例乳腺癌患者检测出13例EGFRmRNA阳性(32. 5% ),与正常人相比P<0. 01,两组间存在显著性差异;CK-19的mRNA阳性例数为14 (35. 0% ),与正常人相比P>0. 05,两组间无统计学差异。通过免疫组化检测到25例( 62. 5% )的肿瘤组织中EGFR阳性,所有外周血中EGFRmRNA阳性的病例,相应的原发肿瘤病灶中EGFR蛋白均为阳性,组织中EGFR蛋白高表达的患者外周血EGFRmRNA检出率也高(P<0. 01)。26例初治患者中5例EGFRmRNA阳性(19. 2% ),14例复治患者中8例EGFRmRNA阳性(57. 1% ),两组相比P<0. 05,存在显著性差异。6例曾使用过紫杉醇类药物挽救化疗的转移性患者中1例EGFRmRNA阳性(16. 7% ), 8例未使用过紫杉醇类药物挽救化疗的转移性患者中7例EGFRmRNA阳性(87. 5% ),两组相比P<0. 05,存在显著性差异。

晶状体上皮细胞mRNA定量分析中内部参照标准β-肌动蛋白RT-PCR反应条件的研究

目的 探讨晶状体上皮细胞mRNA定量分析中内部参照标准β-肌动蛋白RT-PC反应条件。方法 从培养的人晶状体上皮细胞中提取mRNA，应用设计的引物RT-PCR检测β-肌动蛋白，电泳分析53.2℃、53.9℃、55℃、56.2℃、57.4℃、58.6℃、59.8℃、60℃、62℃、62.7℃不同的退火温度的扩增产物。结果 各退火温度条件下，β-actin扩增产物均形成长度为302bp片段，且未见非特异性扩增产物条带。退火温度为58.6℃时，β-actin扩增产物的条带最清晰。结论 采用本实验中所设计的引物联合58.6℃退火温度等实验条件所扩增的长度为302bp片段，清晰稳定，是晶状体上皮细胞mRNA定量分析中良好的内部参照标准。

颌骨肿瘤中骨形成蛋白-2基因扩增的RT-PCR研究

目的探讨颌骨肿瘤中骨形成蛋白(BMP)-2基因的扩增与颌骨肿瘤的发生、发展及生物学行为之间的关系。方法采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测9类87例新鲜颌骨肿瘤标本中BMP-2基因扩增结果。结果含肿瘤性硬组织的全部42例颌骨肿瘤(骨肉瘤、软骨肉瘤、牙源性纤维瘤、骨化性纤维瘤、化牙骨质纤维瘤)和部分颌骨成釉细胞瘤(27/31)均显示人BMP-2特异性扩增条带,而不含肿瘤性硬组织的其他颌骨肿瘤(牙源性钙化上皮瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤)均未见特异性扩增条带。结论颌骨肿瘤中BMP-2基因扩增存在差异,BMP-2基因扩增与肿瘤性硬组织的形成有关,与某些颌骨肿瘤的发生、发展及生物学行为之间存在一定关系。