siRNA干扰立早蛋白ICP4对HSV-1病毒复制能力的影响

目的观察siRNA作用于HSV-1病毒的ICP4后对HSV-1复制能力的影响。方法设计两段靶向HSV-1 ICP4的siRNA和一段阴性对照序列,酶切连接法构建重组质粒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;脂质体法包装重组慢病毒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;嘌呤霉素筛选法建立抗ICP4的siRNA单克隆细胞系(VERO115、VERO3604、VERO115+3604、VERO-CON);TCID50法检测siRNA对HSV-1的病毒复制能力的影响。结果成功构建重组质粒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;获得重组慢病毒pLKO-puror-hU6-siRNA/CON;成功构建四个抗ICP4的siRNA单克隆细胞系;BAC-HSV-1-GFP病毒感染单克隆细胞系,siRNA作用后野生型VERO细胞的细胞病变效应(CPE)及绿色荧光蛋白(GFP)表达率均近100%,VERO-CON细胞达90%以上。siRNAVERO115及VERO3604的CPE及GFP表达率明显高于VERO115+3604细胞,P<0.05。且不同位点联合干扰对病毒的抑制作用强于单一位点干扰,低于VERO115和VERO3604,P<0.05。结论抗ICP4的siRNA对HSV-1的复制有明显的抑制作用,且不同位点siRNA联合干扰对病毒的复制有协同抑制效果。

单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立

目的建立实时荧光PCR定量检测单纯疱疹病毒2型(HSV2)ICP4基因的方法。方法依据HSV2ICP4基因序列设计引物,PCR纯化后克隆到pMD-18T载体上进行测序,抽提重组质粒作为标准品。根据测序结果设计荧光定量PCR的引物和探针,质粒标准品10倍稀释后进行扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度和可靠性分析。结果测序结果显示在扩增的PCR片段中有在A-G无和T-C的无义突变。标准品101以下没有检测信号,101具有明确的检测信号,因而检测的灵敏度为10。可靠性测定结果:107～101进行10次重复Ct值的平均值分别为14.275±0.137、17.988±0.162、22.081±0.259、25.957±0.345、29.565±0.203、33.269±0.287、37.737±0.698,变异系数分别为0.965%、0.902%、1.174%、1.329%、0.686%、0.862%、1.851%。Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系。回归系数为0.998。结论成功建立了HSV2ICP4基因实时定量荧光PCR检测的方法,灵敏度高,重复性好,可用于HSV2ICP4基因的定量分析。

shRNA表达载体对HSV-2 ICP4基因的干扰效应

目的构建针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2) ICP4基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探究该载体表达的shRNA对HSV-2的抑制作用。方法重组表达载体通过脂质体转染法转染HEK293细胞,并接种HSV-2,48h后,实时荧光定量RT-PCR检测mRNA转录情况,Western blot检测ICP4蛋白的表达情况,终点滴定法测定病毒的滴度。结果与对照组相比,干扰组对mRNA抑制率为71%,使蛋白表达减少71.81%,并且病毒滴度也明显降低(P<0.05)。结论构建的pGPU6/Neo-shRNA ICP4重组质粒表达载体能在体外细胞水平上干扰HSV-2 ICP4的基因表达,抑制HSV-2在细胞中复制。

鸡传染性喉气管炎病毒WG株ICP4基因的鉴定及其在潜伏位点的表达

根据传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)SA-2株ICP4基因序列设计并合成3对引物,以ILTV中国王岗株(WG)DNA为模板扩增ICP4基因,并对其进行了序列测定。将ILTV WG株的ICP4基因及其推导的氨基酸序列,分别与ILTV SA-2株、BHV-1、EHV-1、EHV-4、MDV-1、MDV-2、HVT、PRV、VZV、HSV-1和HSV-2的ICP4基因及其推导的氨基酸序列比较后发现,ILTV毒株之间ICP4基因相对保守,核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为99.7%和99.1%,但与其它α-疱疹病毒的ICP4基因的同源性则较低,低于3.0%。对潜伏感染鸡三叉神经节中病毒基因的检测显示,在人工感染ILTV WG株后第10 d～60 d内均能检测到ICP4特异RNA,而gB、gC、TK则未能检出。鉴于目前国内外对α-疱疹病毒潜伏感染相关基因以及ICP4基因序列和结构功能的研究,ILTV WG株ICP4基因的克隆和序列测定,以及病毒基因在潜伏感染鸡三叉神经节中的差异表达,为进一步研究ICP4基因的功能及确定潜伏感染相关基因奠定了基础。

鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)WG株ICP4基因的鉴定及其在潜伏位点的表达

根据传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus，ILTV）SA2株ICP4基因序列设计并合成3对引物，以ILTV中国王岗株（WG）株DNA为模板扩增ICP4基因，并对其进行了序列测定。将ILTV WG株的ICP4基因及其推导的氨基酸序列分别与ILTVSA-2株、BHV-1、EHV-1、EHV-4、MDV-1、MDV-2、HVT、PRV、VZV、HSV-1和HSV-2的ICP4基因及其推导的氨基酸序列比较后发现，ILTV毒株之间ICP4基因相对保守，核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为99．7％和99．19／5，但与其他α-疱疹病毒的ICP4基因的同源性则较低，低于3．0％。对潜伏感染鸡三叉神经节中病毒基因的检测显示，在人工感染ILTVWG株后第10460d内均能检测到低水平的ICP4特异RNA，而gB、gC、TK则未能检出。鉴于目前国内外对α-疱疹病毒潜伏感染相关基因以及ICP4基因序列和结构功能的研究，ILTVWG株ICP4基因的克隆和序列测定，以及病毒基因在潜伏感染鸡三叉神经节中的差异表达，为进一步研究ICP4基因的功能及确定潜伏感染相关基因奠定了基础。

α疱疹病毒ICP4的转录调控机制

ICP4基因是α疱疹病毒的一个立即早期基因,其编码蛋白具有重要的调控作用,是病毒复制和基因表达的必须基因。本文在解析ICP4结构特点的基础上阐述了ICP4的转录激活或转录抑制作用、对病毒潜伏感染的影响、与其他蛋白的相互作用及其他一些重要功能,为深入研究α疱疹病毒的复制与基因表达调控和ICP4的功能提供参考。

靶向ICP4的小干扰RNA对HSV-1病毒复制能力的影响

HSV-1是一种嗜神经病毒,能引起一系列神经系统严重症状,然而目前抗HSV-1药物易反弹、不能完全清除潜伏的病毒。ICP4对HSV复制、转录起主要调节作用,决定着溶细胞型感染或潜伏状态的平衡点。为了探寻新的抗病毒策略,本课题以HSV-1ICP4基因为靶点,设计合成2对siRNA,并构建重组真核慢病毒表达质粒pL-KO-puror-hU6-siRNA,通过脂质体转染和嘌呤霉素筛选建立靶向ICP4的4个siRNA单克隆细胞系,Real-timePCR法检测细胞系中ICP4的mRNA表达水平,TCID50法检测siRNA对HSV-1病毒复制能力的影响。结果显示靶向siRNA能有效抑制单克隆细胞系中的ICP4表达,并且抑制ICP4的表达后HSV-1病毒复制能力明显减弱,表明靶向ICP4的siRNA对HSV-1复制有明显抑制作用,且多位点siRNA联合干扰对病毒复制有协同抑制效果,有望应用于生物抗病毒药物的制备。

siRNA对单纯疱疹病毒2型ICP4基因抑制作用的研究

目的 探讨RNA干扰对单纯疱疹病毒2型（HSV2）ICP4基因表达和HSV2 DNA复制的抑制作用.方法 化学合成靶向作用于HSV2 ICP4的四对siRNA和阴性对照siRNA,分别命名为siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3,siRNA-4及siRNA-N,转染Vero细胞,过夜后用HSV2 HG52标准毒株感染上述Veto细胞,1、2、3、4d和5d收集Vero细胞和上清液,荧光定量RT-PCR检测ICP4 mRNA的表达水平,荧光定量PCR检测HSV2 DNA拷贝数,Western-Blot检测ICP4蛋白表达水平.结果 与阴性对照相比,四对siRNA对HSV2 ICP4 mRNA和蛋白均有不同程度的抑制作用,以siRNA-2抑制作用最强,并且均可显著降低HSV2 DNA拷贝数.结论 靶向作用于HSV2 ICP4的siRNA可显著抑制ICP4mRNA及蛋白表达和HSV2 DNA拷贝数,提示siRNA可通过抑制HSV2 ICP4基因表达而抑制HSV2的复制.

传染性喉气管炎病毒田间分离株与疫苗株的遗传进化关系分析

采用PCR方法扩增了22个传染性喉气管炎病毒（ILTV）田间分离株的ICP4基因片段，并与GenBank收录的部分鸡胚源（CEO）弱毒疫苗毒株、细胞培养源（TCO）弱毒疫苗毒株和国内分离强毒株进行了序列比较。结果显示：所有田间分离株和国内近期分离的LJS09毒株所测定，C刚基因片段均为676bp；与国内早期分离的王岗（wG）株7LTCO疫苗株相比，田间分离株和CEO疫苗株在ICP4基因的272～283nt部位均存在12个碱基的缺失；遗传进化树显示，田间分离株与CEO疫苗株的距离较近，处于同一个大分支上，而与TCO疫苗株及WG株的距离相对较远，处于不同分支上。上述结果表明，我国ILTV田间分离株的遗传特性与CEO疫苗株接近。