目的构建抑制大鼠ERp29基因表达的重组质粒,并在IEC-6细胞中发挥作用。方法根据大鼠ERp29的基因序列,设计合成含有发夹结构的寡核苷酸片段,经退火形成双链后克隆至pAVU6+27载体质粒中,对阳性重组子进行酶切和测序鉴定后转染正常IEC-6细...目的构建抑制大鼠ERp29基因表达的重组质粒,并在IEC-6细胞中发挥作用。方法根据大鼠ERp29的基因序列,设计合成含有发夹结构的寡核苷酸片段,经退火形成双链后克隆至pAVU6+27载体质粒中,对阳性重组子进行酶切和测序鉴定后转染正常IEC-6细胞,通过PCR方法对siERp29干扰片段进行鉴定,并采用W estern b lot检测ERp29蛋白水平的表达变化。结果重组质粒经双酶切后,有目的条带出现,提示ERp29干扰片段已克隆至pAVU6+27载体质粒中,DNA测序结果显示插入序列与预先设计完全一致。重组质粒转染IEC-6细胞后经G418筛选,成功获得阳性克隆,W estern b lot结果显示ERp29的蛋白水平表达显著下降。结论成功构建ERp29基因RNA干扰表达质粒,并在IEC-6细胞中发挥抑制作用,这为深入研究该基因在电离辐射中的作用奠定了基础。展开更多
文摘目的构建抑制大鼠ERp29基因表达的重组质粒,并在IEC-6细胞中发挥作用。方法根据大鼠ERp29的基因序列,设计合成含有发夹结构的寡核苷酸片段,经退火形成双链后克隆至pAVU6+27载体质粒中,对阳性重组子进行酶切和测序鉴定后转染正常IEC-6细胞,通过PCR方法对siERp29干扰片段进行鉴定,并采用W estern b lot检测ERp29蛋白水平的表达变化。结果重组质粒经双酶切后,有目的条带出现,提示ERp29干扰片段已克隆至pAVU6+27载体质粒中,DNA测序结果显示插入序列与预先设计完全一致。重组质粒转染IEC-6细胞后经G418筛选,成功获得阳性克隆,W estern b lot结果显示ERp29的蛋白水平表达显著下降。结论成功构建ERp29基因RNA干扰表达质粒,并在IEC-6细胞中发挥抑制作用,这为深入研究该基因在电离辐射中的作用奠定了基础。