表达IFN-α的重组猪繁殖与呼吸综合病毒的构建及生物学特性分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害我国生猪业的重要疫病之一,其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),是一种免疫抑制性病毒。干扰素(IFN)是一类具有免疫调节功能和抗病毒作用的细胞因子。IFN-α除更直接的抗病毒作用外,还可以调节宿主的先天性和适应性免疫。论文构建表达IFN-α的重组PRRSV,分析重组病毒的生物学特性以及IFN-α的生物学活性。通过反向遗传操作方法将IFN-α插入到PRRSV ORF1b和ORF2a之间,重组质粒转染细胞后可以拯救出重组病毒(rGXAM-P-IFN-α)。插入到PRRSV基因组中的IFN-α可遗传稳定9代。重组病毒生长特性分析可发现rGXAM-P-IFN-α复制能力显著低于亲本病毒。rGXAM-P-IFN-α感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)可显著上调抗病毒基因(PKR,ISG15和ISG54)mRNA表达水平,为进一步研发新型PRRSV疫苗提供参考。

西藏羊和白-藏杂交羊外周血IFN-α、IgG和IL-2的研究

为了解西藏羊和白萨福克羊与西藏羊的杂交后代羊生长发育中免疫因子的分泌特点和免疫学特征,以西藏羊和白-藏杂交羊为研究对象,应用ELISA方法检测0.5、1和1.5岁外周血中干扰素(IFN-α)、免疫球蛋白G(IgG)和白细胞介素-2(IL-2)的质量浓度,分析其变化规律。结果表明:随年龄的增长,藏公羊IL-2呈逐渐降低的趋势,而藏母羊呈逐渐升高的趋势(P<0.05);藏杂交公羊和藏母羊IgG含量都呈逐渐降低趋势,藏公羊下降较明显(P<0.05);藏公羊IFN-α的含量逐渐降低,0.5岁与1岁之间下降趋势明显(P<0.05),而藏母羊变化不大。随年龄的增长,白-藏杂交羊公羊和母羊IL-2含量先降低再升高;白-藏杂交羊公羊IgG含量变化不大,母羊则是先升高后下降趋势,且1岁和1.5岁之间下降明显(P<0.05);白-藏杂交羊公羊IFN-α的含量逐渐降低,而母羊是先升高后下降。

IFN-αIL-6和IL-17检测对结核病辅助诊断价值

目的:评价血清免疫细胞因子对结核分枝杆菌肺病(TB)的诊断价值。方法:回顾性选取2020年11月至2022年10月于河北省胸科医院就诊的139例疑似肺结核患者作为研究对象。按照2018年最新实施的肺结核诊断标准(WS288-2017),其中确诊结核病69例,纳入结核组,非结核病70例纳入非结核组。采用流式免疫荧光发光法检测血清中免疫相关细胞因子IL-6、IL-17和IFN-α水平,并分析三种因子检测对结核病的诊断效能。结果:结核组患者IL-6浓度和IL-17浓度显著高于非结核组,差异有统计学意义(P<0.05);结核组患者IFN-α浓度略高于非结核组,但差异无统计学意义(P>0.05);进行ROC曲线分析:IL-6检测AUC面积为0.658(P<0.001)、IL-17检测AUC面积为0.734(P<0.001)、IFN-α检测AUC面积为0.571(P<0.001)。结论:MTB感染者IL-6、IL-17水平增高,IL-6、IL-17对结核的诊断具有较好的灵敏度和特异度;IL-6、IL-17在临床辅助诊断结核病具有一定的价值。

PEG-IFNα-2b联合替诺福韦治疗慢性乙型肝炎的疗效及对HBeAg转阴率、免疫功能的影响

目的:分析聚乙二醇干扰素α-2b(PEG-IFNα-2b)联合替诺福韦治疗慢性乙型肝炎的效果及对HBeAg转阴率、免疫功能的影响。方法:选取某院2019年3月—2022年3月收治的慢性乙型肝炎患者88例作为研究对象,依据随机抽签法分成研究组与对照组,每组44例。对照组接受替诺福韦治疗,研究组接受PEG-IFNα-2b联合替诺福韦治疗,比较2组HBeAg转阴率、HBsAg转阴率、治疗前后肝功能指标[谷氨酰转肽酶(GGT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)]、免疫功能指标(CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、C3、C4)及血清炎性因子[视黄酸受体相关孤核受体(RORγt)、白细胞介素-17(IL-17)、IL-4]水平。结果:研究组HBeAg转阴率、HBsAg转阴率分别为45.45%、13.64%,高于对照组的11.36%、0,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,研究组GGT、AST、ALT、IL-4、IL-17、RORγt分别为(30.42±5.39)U/L、(31.08±6.64)U/L、(29.37±4.68)U/L、(1.32±0.42)pg/mL、(0.64±0.19)pg/mL、(0.80±0.30),均低于对照组的(56.93±8.75)U/L、(38.72±5.83)U/L、(49.61±6.42)U/L、(3.91±1.14)pg/ml、(3.01±0.87)pg/ml、(1.61±0.36),差异有统计学意义(P<0.05)。研究组CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、C3、C4分别为(66.81±8.55)%、(1.53±0.16)、(1.22±0.01)g/L、(0.42±0.07)g/L,均高于对照组的(61.03±8.49)%、(1.26±0.2)、(0.73±0.09)g/L、(0.22±0.06)g/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PEG-IFNα-2b联合替诺福韦治疗慢性乙型肝炎效果明显,可提高HBeAg、HBsAg转阴率,改善肝功能,增强免疫功能,抑制炎性反应。

IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-4在大鼠肝纤维化早期诊断中的意义

目的探讨细胞因子IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-4在肝纤维化形成过程中的变化及意义。方法50只雄性SD大鼠随机分为正常对照组和实验组,实验组腹腔注射四氯化碳(CCL4),联合饮用含硫代乙酰胺的酒精溶液诱导构建肝纤维化模型,共12 w。造模的第2、4、6、8、12 w收集血清及肝脏标本,苏木素-伊红染色观察肝脏的组织学变化,酶联免疫法检测细胞因子IL-10、TNF-a、IFN-γ和IL-4在血清中的表达水平,并分析其相关性。结果组织学观察发现,实验组2 w时细胞肿胀变性;4 w时小灶性肝细胞坏死,门管区大量炎症细胞浸润;6 w时可见明显肝细胞脂肪变性;8 w时肝细胞变性和坏死加重,出现胆汁淤积,门管区炎症细胞浸润及纤维组织增生,可见不完整假小叶形成;12 w时,可见完整假小叶形成。随造模时间延长,与对照组相比,血清中IL-4、IFN-γ、TNF-α的表达逐渐增加,均高于对照组,有统计学意义(P<0.01)。IL-10的表达水平在2 w时达到峰值后,接着开始降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4表达水平随肝纤维化程度加重而逐渐升高,在肝纤维化的进展过程中发挥重要作用,对肝纤维的诊断及进展观察有一定的参考价值。

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta(DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell,MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID50及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^(-1),Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基因的转录上调。与对照组细胞相比,山羊IFN-α显著下调MDBK细胞中CPIV3的病毒滴度,Western blot结果显示,山羊IFN-α孵育显著下调CPIV3非结构蛋白C的表达水平。山羊IFN-α对CPIV3在MDBK细胞中的增殖具有显著抑制作用。本研究扩展了I型干扰素的研究范围,为CPIV3等反刍动物疫病的防控提供新的思路。

PEG-IFN α-2b治疗后慢性乙肝患者体内PBMC中的p11 mRNA GRα mRNA水平与抑郁症的相关性

目的 研究经聚乙二醇干扰素α-2b治疗后,慢性乙肝患者外周血单个核细胞中p11 mRNA、糖皮质激素受体α(GRα) mRNA水平与抑郁症的相关性。方法 对60例慢性乙型肝炎患者进行编号,采用随机数字表法,随机分为观察组和对照组各30例,均常规给予护肝和抗病毒治疗,观察组在此基础上给予聚乙二醇干扰素α-2b治疗,疗程均为24周。采用汉密顿抑郁量表评估两组患者治疗前后的抑郁水平,检测外周血中的炎症因子、神经递质、p11 mRNA和GRα mRNA水平,并对两组患者p11 mRNA、GRα mRNA水平与抑郁症评分进行相关性分析。结果 两组患者治疗24周后,乙型肝炎病毒DNA应答率均较治疗前升高,且观察组高于对照组(P<0.05)。两组患者治疗24周后,汉密顿抑郁量表评分、血清γ干扰素和肿瘤坏死因子α水平均较治疗前升高(P<0.05或0.01),白细胞介素-4、血浆甲肾上腺素和5-羟色胺水平较治疗前降低(P<0.05或0.01),而观察组汉密顿抑郁量表评分和抑郁症发生率均明显高于对照组(P<0.05)。两组患者治疗24周后,观察组外周血单个核细胞中p11 mRNA水平高于对照组(P<0.05),GRα mRNA水平则低于对照组(P<0.05),且观察组外周血单个核细胞中p11 mRNA与γ干扰素、TNF-α和汉密顿抑郁量表评分呈正相关性(P<0.01),GRα mRNA与血浆甲肾上腺素、5-羟色胺水平和汉密顿抑郁量表评分也呈正相关性(P<0.01)。结论 聚乙二醇干扰素α-2b治疗后慢性乙肝患者外周血单个核细胞中p11 mRNA表达明显升高,GRα mRNA表达明显降低,且与外周血炎症因子和神经递质表达密切相关,可能是导致抑郁症发生的重要原因。

清肺口服液黄酮类组分对呼吸道合胞病毒感染小鼠IFN-α/JAK1/STAT1信号通路的影响

目的基于IFN-α/JAK1/STAT1信号通路探讨清肺口服液黄酮类组分抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的作用机制。方法36只雌性清洁级BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、利巴韦林组及清肺口服液黄酮类组分低、中、高剂量组(黄酮组分低、中、高剂量组),每组6只。除正常组外,其余组经鼻予RSV病毒液造模,造模成功后给药,各给药组予相应药物灌胃,正常组和模型组予等体积生理盐水,共4 d。HE染色观察小鼠肺组织病理变化,ELISA检测血清α干扰素(IFN-α)含量,RT-PCR检测肺组织RSV-F、Janus酪氨酸蛋白激酶1(JAK1)和信号传导与转录激活因子1(STAT1)mRNA表达,Western blot及免疫组化染色检测肺组织JAK1和STAT1蛋白表达。结果与正常组比较,模型组小鼠肺组织明显充血,有大量炎性细胞浸润,血清IFN-α含量明显增加(P<0.001),肺组织RSV-F、JAK1和STAT1 mRNA表达明显升高(P<0.01),JAK1和STAT1蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.001)。与模型组比较,利巴韦林组及黄酮组分各剂量组小鼠肺组织病理损伤状况明显改善,肺组织RSV-F mRNA表达明显降低(P<0.05);黄酮组分高剂量组血清IFN-α含量明显增加,肺组织JAK1和STAT1 mRNA及蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论清肺口服液黄酮类组分具有抗RSV感染作用,其机制可能与上调IFN-α表达,激活JAK1/STAT1信号通路,增强机体免疫功能有关。

EBV通过抑制IFN-α蛋白表达逃逸免疫应答促进免疫性血小板减少症发生的机制

目的 研究爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)逃逸免疫应答促进免疫性血小板减少症(ITP)发生的机制。方法 从ITP患儿和健康儿童外周血中提取并培养单核细胞,并用EBV对外周血单核细胞进行感染,然后用酶联免疫吸附试验和Western blot检测干扰素-α(IFN-α)蛋白的表达情况。结果 与对照组比较,EBV感染后可抑制人外周血单核细胞分泌IFN-α(P<0.01)。与健康儿童比较,EBV刺激人外周血单核细胞后,IFN-α蛋白表达量显著降低,且ITP患儿外周血单核细胞IFN-α蛋白表达量也明显降低,SOCS3蛋白表达量显著增高(P<0.01)。siRNA靶向SOCS3转染实验结果中,与健康儿童比较,siSOCS3的敲除率高于70%,且敲除SOCS3后再用EBV感染,EBV抑制IFN-α蛋白分泌的作用显著减弱(P<0.01)。转染ZTA质粒后,ZTA蛋白及SOCS3蛋白表达均显著增高。结论 EBV能够通过调控ZTA蛋白表达,从而抑制IFN-α的表达,逃逸免疫应答促进ITP的发生。

阿拉伯木聚糖联合美多芭对帕金森病大鼠炎症因子TNF-α、IL-1β及IFN-γ表达的影响

目的探究阿拉伯木聚糖(araboxylan,AX)联合美多芭对鱼藤酮诱导的帕金森病(parkinson’s disease,PD)大鼠模型炎症因子TNF-α、IL-1β及IFN-γ的影响。方法42只大鼠随机选取28只进行PD造模,造模后分为帕金森模型组(PD组)、美多芭组(M组)和阿拉伯木聚糖组(AX组)、美多芭+阿拉伯木聚糖组(MX组)4个组;其余14只随机均分为空白组和溶剂组,每组7只。M组美多芭干预,AX组AX干预,MX组AX联合美多芭干预,灌胃14 d,每天1次。进行悬挂试验及爬杆实验,蛋白免疫印迹(Western Blotting,WB)检测黑质纹状体IFN-γ蛋白和免疫组化检测黑质纹状体IL-1β蛋白,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组血清TNF-α、IL-1β的表达。结果悬挂实验:AX、M组、MX组较PD组悬挂时间延长,四肢肌力改善,且MX组症状恢复更明显(P<0.01)。WB:AX组、M组、MX组与PD组比较,黑质纹状体IFN-γ的含量减少(P<0.05)。免疫组化:AX组、M组、MX组与PD组比较,黑质纹状体IL-1β表达量明显减少。ELISA:AX组、M组、MX组与PD组比较血清TNF-α降低。差异有统计学意义(P<0.05),MX组较AX组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论阿拉伯木聚糖联合美多芭抑制鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠炎症因子TNF-α、IL-1β及IFN-γ的释放,较好地改善了大鼠的神经功能。

惠阳胡须鸡IFN-α基因克隆和序列分析

根据红色原鸡IFN A基因设计了引物对 ,采用PCR法克隆并测序了我国地方标准品种惠阳胡须鸡的IFN α基因 ,定名为HyIFNA4。HyIFNA4与红色原鸡类IFN α比较 ,ORF长度均为 582个核苷酸、编码 162个氨基酸 ,相互间同源性在 97 4 %～ 99%。

鸡IFN-α和IFN-β及IFN-γ基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上鸡α-、β-、γ-干扰素（ChIFNα-、β-、γ-）基因的序列，在保守区设计并合成各自特异引物，并以鸡3-磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）基因为内参，采用SYBRGreen工染料以建立实时荧光定量PCR检测方法。将IFNα-、β-、γ-基因克隆至pGEM-T载体上，以各阳性质粒作为标准品，构建标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，鸡IFNα-、β-、γ-和GAPDH基因的C1值与标准品稀释度在1×10^2～1×10^8 copies／μL范围分别呈良好的线性关系，r^2均大于0．990。熔解曲线分析表明，产物为特异的单峰，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4h。建立的鸡IFNα-、β-、γ-基N实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短，为在mRNA水平对鸡IFN的定量分析奠定了基础。

连翘酯苷对IFN-α和Mx1表达的影响

【目的】探讨连翘酯苷作用于感染PCV2的小鼠模型后,对IFN-α和Mx1表达的影响,以评价连翘酯苷的抗病毒作用。【方法】复制PCV2感染小鼠模型。以(2、4、10mg·mL-1)连翘酯苷分为高、中、低3个剂量组,并设空白对照组和病毒对照组。给药12、24、36h后,分别提取小鼠肺组织总RNA和总蛋白,应用实时荧光定量PCR检测IFN-α、Mx1 mRNA含量,采用Western blotting检测Mx1蛋白的表达水平。【结果】空白对照组小鼠肺组织中Mx1和IFN-α无表达,病毒对照组少量表达。随着连翘酯苷浓度的升高,IFN-α和Mx1 mRNA水平逐步升高,两者的表达量呈现平行相关;高剂量组中IFN-α和Mx1表达量最高(P<0.001);随着药物作用时间的延长表达量降低,12h时达到最高(P<0.001),其后逐渐下降。【结论】昆明小鼠适于PCV2感染模型的建立。中药连翘酯苷能显著上调IFN-α和Mx1的表达,并在给予高剂量药物后12h发挥显著的抗病毒作用。Mx1蛋白与病毒的感染密切相关,可用于病毒感染的早期诊断,及具有较好的应用前景。

连翘酯苷对小鼠的急性毒性及体内诱生IFN-α的研究

测定连翘酯苷对小鼠腹腔注射急性毒性试验的半数致死量(LD50),检测连翘酯苷体内诱生干扰素的效果。腹腔注射连翘酯苷,用改良寇氏法计算半数致死量。眼部采血,ELISA方法测定血清中IFN-α。测得连翘酯苷对小鼠腹腔注射急性毒性的LD50为1 976.5 mg/kg,LD50的95%可信限为1 863.7 mg/kg^2 096.1 mg/kg。连翘酯苷诱生干扰素在48 h达到最高峰845.8 pg/mL±150.92 pg/mL(P<0.01)。表明连翘酯苷为低毒化合物,体内能够诱生IFN-α。

可在鱼体内表达hu-IFN-α的基因重组构建及转化

通过分子重组 ,将人α 干扰素 (hu IFN α)基因编码序列克隆到鲤鱼β 肌动蛋白基因启动子下游 ,构建成能在鱼体内组成型表达hu IFN α的基因重组分子。经限制性酶切分析、Southern杂交和序列测定 ,证明重组分子构建的正确性。采用显微注射法将这一重组基因转化草鱼受精卵 ,获得了表达人α

黄芩苷、连翘酯苷对肺微血管内皮细胞分泌IFN-α、IFN-γ的影响

为了研究黄芩苷、连翘酯苷对大鼠肺微血管内皮细胞(pul monary microvascular endothelial cells,PMVECs)分泌IFN-α、IFN-γ的影响,本试验以体外培养的PMVECs为模型,用ELISA法检测这2种中药成分在不同浓度、不同时间点诱导PMVECs分泌IFN-α和IFN-γ的量。结果表明,黄芩苷在10μg/mL,24 h时诱导PMVECs分泌的IFN-α和IFN-γ的量均最高,连翘酯苷分别在20μg/mL、12 h时和5μg/mL、24 h时诱导PMVECs分泌的IFN-α和IFN-γ的量最高。这一结果为体外筛选诱导PMVECs表达干扰素的中药成分提供了参考,为进一步研究中药成分的抗病毒机理奠定了基础。

转Hu-IFN-α基因草鱼的分子验证及抗性研究

采用显微注射法将人α-干扰素抗病基因转移到草鱼受精卵中 ,获得转基因群体 ,通过 PCR及 Southern杂交对转基因草鱼进行分子水平的检测 ,以进一步验证外源人α-干扰素是否整合入草鱼基因组 .结果表明 ,外源人α-干扰素抗病基因已整合入草鱼基因组中 .采用腹腔注射法 ,对转基因鱼进行草鱼出血病病毒接种攻毒试验 。

牛IFN-α基因高效表达及纯化的研究

基于对RNA二级结构的预测和密码子偏性计算,通过计算机辅助软件进行牛IFN-α基因优化,经人工合成优化后的基因与pWL表达载体连接后诱导表达,并对表达条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,其产物分子量约为17ku,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的33%,表达产物以包涵体形式存在。经过包涵体溶解、初步复性后利用CM Sepharose Fast Flow离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,采用梯度法进行牛α-干扰素包涵体蛋白质的纯化复性。结果表明,梯度离子交换层析法能有效地复性牛α-干扰素包涵体,复性后的重组牛α-干扰素的纯度达95%,通过离子交换层析柱纯化和复性后,重组牛α-干扰素在MDBK/VSV细胞系上的抗病毒活性为5.56×106u/mg。

牛IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA实时SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。将BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γcDNA分别克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α内,经PCR及测序鉴定,将得到的阳性重组质粒制备成标准品,建立SYBR Green荧光定量PCR标准曲线并分析溶解曲线,进行灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明:BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL～1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。本研究建立的检测牛IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA的实时荧光定量PCR方法,为牛IFN mRNA水平上的定量分析奠定了基础。