犬IFNα1-THYα1融合蛋白的生物活性检测

用细胞病变抑制试验和E玫瑰花环形成试验检测犬IFNα1-THYα1融合蛋白的生物活性。结果表明,IFNα1-THYα1融合蛋白能够抑制病毒感染的DK细胞,提高玫瑰花环形成率,说明犬IFNα1-THYα1融合蛋白具有一定的犬干扰素α1(IFNα1)与胸腺肽α1(THYα1)的生物活性。

猪IFN-α_1和IFN-β_1基因的克隆与序列分析

从猪的肝细胞中提取总RNA，应用RT-PCR技术扩增IFN-α1扣IFN-β1基因，分别克隆到PMD18-T载体上。测序结果表明，克隆的IFN—α1核苷酸序列与GenBank上登录的猪IFN-α1核苷酸同源性为100％，与鼠、犬、人和牛IFN—α1基因同源性为71．1％～81．4％。克隆的IFN—β1核苷酸序列与Gen—Bank上登录的猪IFN-β1核苷酸同源性为99．6％，推导的氨基酸同源性为99．5％；与人、牛和马IFN-β1基因同源性为76．9％～80．4％。

鸡干扰素α1及胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立

根据GenBank已发表的鸡干扰素α1(IFNα1)基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR方法,从鸡基因组中扩增出鸡IFNα1基因。根据胸腺肽α1(THYα1)氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,设计基因序列,同时在IFNα1-THYα1之间设计1个5肽Linker。在IFNα1基因结构基础上,设计4条寡核苷酸单链作为下游引物,以搭桥的方式延伸和扩增,最终获得IFNα1-THYα1融合基因;将该基因克隆至pGEX4T-1载体后,转化至BL21(DE3)受体菌中,37℃培养至菌液D600为0.6～1.0时,IPTG(1.0mmol/L)诱导培养4h;经western blot鉴定证实,成功构建了鸡干扰素α1及胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统,表达产物以包涵体形式存在,获得高纯度的IFNα1-THYα1蛋白。以细胞病变抑制试验及E玫瑰花结形成试验对目的蛋白进行体外活性检测,结果显示该蛋白具有生物活性。

犬干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立

依据IFNα1和THYα1的分子结构特征设计了1个连接肽，根据氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性，采用PCR方法合成了三者融合基因，将该基因克隆至pGEX4T-2载体中，构建了pGEX4T-2-IFNα1-THYα1原核表达质粒。将重组质粒转化至BL21（DE3）受体菌中，37℃培养至D600为0．6～1．0时，IPTG（1．0mmol／L）诱导培养4h，经SDS-PEGA和Western-blot鉴定，目的蛋白获得高效表达。

犬干扰素α1和胸腺肽α1融合蛋白在毕赤酵母GS115中的表达

为探索犬干扰素和胸腺肽融合蛋白的抗病毒活性,根据已知的基因序列,合成了犬干扰素(IFNα1)和胸腺肽(THYα1)的基因片段,通过一个连接肽将IFNα1和THYα1片段连接起来。将该基因克隆于pPIC9K载体中,构建重组质粒pPIC9K-IFNα1-THYα1,转化到感受态细胞毕赤酵母GS115受体菌中,30℃培养18h至菌体OD600nm值约为4时用甲醇诱导培养5d,使最终浓度维持1%,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定证实,获得高纯度的重组蛋白。以MDCK/VSV抗病毒检测系统对目的蛋白进行体外活性检测,结果显示该蛋白具有抗病毒活性。