共表达蛋白质折叠辅助因子对毕赤酵母分泌表达IFNβ-HSA融合蛋白质的影响

探索共表达蛋白质折叠辅助因子Ero1、PDI和Bi P对毕赤酵母GS115分泌表达融合蛋白质IFNβ-HSA的影响。将构建的蛋白质折叠辅助因子表达载体p GAP-Ero1、p GAP-PDI、p GAPBi P和空载对照线性化后,电击转化重组毕赤酵母GS115/IFNβ-HSA细胞,用含有400μg/m L zeocin的YPD平板筛选阳性转化子,并采用PCR和Western blot法进一步鉴定。阳性转化子进行摇瓶发酵后,采用SDS-PAGE及Western blot法分析共表达Ero1、PDI和Bi P对IFNβ-HSA表达水平的影响。结果表明,Ero1、PDI和Bi P成功地在胞内过量表达,且不影响宿主细胞的正常生长;共表达Ero1和PDI分别使IFNβ-HSA的表达量提高了80%和90%,而共表达Bi P则对IFNβ-HSA的表达水平无明显影响。

提高重组毕赤酵母表达hIFNβ-HSA的碳源控制策略

研究了重组毕赤酵母KM71/IH菌体生长阶段饥饿培养对其细胞相对活性及人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白(hIFNβ-HSA)表达的影响.结果表明,在以甘油为唯一碳源的细胞培养后期进行饥饿培养以耗尽培养基中的甘油会导致重组细胞相对活性的降低,进而减少hIFNβ-HSA的表达量.在此基础上,提出了菌体培养后期,即过渡阶段流加甘露醇碳源代替饥饿培养的策略,不仅可以消除培养液中甘油残留对甲醇诱导表达hIFNβ-HSA的不利影响,而且能够保持重组细胞培养物较高的相对活性(>97%),从而可以提高甲醇诱导表达hIFNβ-HSA的水平,表达量可达37.3mg/L,最大生产强度为0.78mg/(L-h),较对照分别提高了92.3%和44.4%

重组毕氏酵母中降解hIFN-βHSA蛋白酶的鉴定及其活性控制

研究了重组毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA表达融合蛋白hIFNβ-HSA过程中产物降解的问题。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-Blotting分析结果表明,发酵液中除了9.0×104的目的融合蛋白hIFNβ-HSA外,同时还出现了6.5×104的降解带,进一步结合HPLC分析证实该降解发生在融合蛋白hIFNβ-HSA的HSA区域。在此基础上,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)活性电泳的方法,确定在融合蛋白hIFNβ-HSA表达的过程中,引起融合蛋白hIFNβ-HSA降解的蛋白酶为蛋白酶B(Proteinase B,PrB)。最后,确定了可以抑制融合蛋白hIFNβ-HSA降解的最佳的蛋白酶抑制剂EDTA,通过在诱导表达阶段添加不同浓度的蛋白酶抑制剂EDTA,使融合蛋白的表达量达到22.18 mg/mL,与空白对照组相比增加了61%。

提高重组表达体系相对活性促进外源蛋白表达:人干扰素毕赤酵母表达体系研究

以毕赤酵母KM71/IH的hIFNβ-HAS表达体系为研究对象,较为系统地研究了不同因素引起的细胞相对活性变化与毕赤酵母外源蛋白表达的相关性。结果表明:(1)细胞相对活性变化与外源蛋白的表达成正相关;(2)处在对数生长中后期的细胞相对活性最高,更适合用于外源蛋白的表达;(3)诱导阶段的环境因素直接影响诱导期细胞相对活性,合适的甲醇浓度、诱导pH及温度是维持细胞高活性,促进外源蛋白高表达的关键。对于hIFNβ-HAS表达体系最佳诱导条件为:以培养21～24h的细胞为诱导种子,初始甲醇浓度为2%(V/V),pH6.0,25℃,细胞活性维持在98%以上,hIFNβ-HSA表达量高达45.6mg/L,较优化前提高了62.3%。