鳙IGFBP1分子特征及基因表达模式研究

从鳙(Hypophthalmichthys nobilis)基因组中获得胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP1,insulin-like growth factor binding protein 1)基因序列,并对其蛋白质理化和进化特征以及基因表达模式进行分析。鳙IGFBP1开放阅读框(ORF)为789 bp,编码262个氨基酸,蛋白分子量为28139.23 u,等电点(pI)为7.42,具有1个信号肽但不具有跨膜结构,推测其为亲水性分泌蛋白。鳙IGFBP1蛋白具有两个保守的IB和TY结构域,与鲤形目鱼类IGFBP1有较高的序列同源性。鳙IGFBP1的基因时空表达分析结果显示:体节期表达量显著上调,出膜后表达水平迅速下降;成鱼肝脏中的表达量最高,皮肤、肠、性腺等组织也有一定的表达,其余组织的表达量较低。对群体中具有显著生长差异的个体进行IGFBP1表达分析,结果显示在极大个体与极小个体的肝脏组织中具有极显著性差异(P<0.01),提示该基因在鳙快速生长中发挥了正调控作用。研究结果对鳙生长调控分子机制研究及遗传改良研究具体理论和潜在应用价值。

IGFBP1在胃癌组织中的表达特点及其预后作用与机制的生物信息学分析

目的:通过综合方法分析IGFBP1在胃癌表达、预后以及参与的生物学功能,探讨其在胃癌中的诊断和治疗价值。方法:基于TCGA数据分析IGFBP1在胃癌中的表达水平,以及不同临床病理分期和生存状态下的表达差异;采用Kaplan-Meier曲线描述IGFBP1表达和胃癌患者预后的关系;采用ROC曲线、Cox回归及Meta分析评价IGFBP1在胃癌中诊断及预后价值,利用LASSO回归分析建立与IGFBP1相关的预后模型,并通过PPI网络筛选IGFBP1相关的核心基因;利用GO、KEGG及CIBERSORT等分析方法分析IGFBP1在胃癌中涉及的潜在致病通路及肿瘤免疫浸润;通过Cell Miner数据库预测IGFBP1与抗肿瘤药物敏感性的相关性。结果:IGFBP1在多种癌症中异常表达,包括胃癌,其中在III~IV期胃癌患者中表达显著上调;Cox回归证实IGFBP1是独立危险因素,预后分析提示IGFBP1与预后不良密切相关;GO分析提示IGFBP1相关差异基因在细胞粘附的正向调节、囊泡管腔和丝氨酸水解酶活性富集,KEGG分析提示其在IL-17信号通路中富集;肿瘤免疫浸润分析提示IGFBP1高低表达组间免疫细胞浸润显著差异;单因素Cox和LASSO回归分析构建了IGFBP1相关的胃癌预后模型,PPI网络从中筛选出7个核心基因,这些基因在胆固醇代谢、嘧啶代谢和PPAR信号通路中富集;IGFBP1的表达水平与Dasatinib等药物的敏感性相关。结论:IGFBP1在胃癌中表达上调并导致患者预后不良,可能通过影响IL-17信号通路和M0巨噬细胞浸润等机制调控胃癌发生发展。

建鲤IGFBP1基因的克隆及与增重相关的SNP位点分析

旨为查找建鲤(Cyprinus carpio var.jian)胰岛素样生长因子结合蛋白1(Insulin-like growth factor binding pro-teins 1,IGFBP1)基因上与增重相关的SNP位点。利用基因克隆,Clustal W比较8个个体的DNA序列,筛选SNP位点。并采用PCR-RFLP方法检测了其中2个位点(1b-E1-A210G,1b-E3-C108T)在913尾建鲤(♂469,♀444)中的基因型分布。成功分离得到了建鲤IGFBP1的2条DNA序列,并在1a、1b上分别找到7个和24个SNPs位点,其中,1a外显子上有2个,1b外显子上有4个。检测的2个位点与增重的相关性分析表明:2位点均与雄鱼增重呈极显著相关(P<0.01),其中,增重快的基因型在鱼种阶段分别为GG型和CC型,在成鱼阶段分别为AG型和CC型。与雌鱼鱼种阶段增重相关的位点为A210G,其AG型增重极显著快于AA型(P<0.01),与雌鱼成鱼阶段增重相关的位点为C108T,其CC型、CT型增重极显著快于TT型(P<0.01)。对组合成的9种双倍型与增重的相关性分析表明:雌雄鱼中双倍型D4、D5、D7个体生长显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)快于双倍型D6、D9个体,D4、D5、D7双倍型个体在整个样品中占60%,还存在改良空间。试验检测的2个位点A210G、C108T可作为建鲤增重相关的分子标记应用于育种实践。

大口黑鲈IGFBP1基因SNPs的筛选及与生长性状的关联分析

本研究使用PCR技术扩增得到2 743 bp长度的大口黑鲈IGFBP1基因序列,序列含4个外显子和3个内含子,编码263个氨基酸。采用直接测序法在IGFBP1基因上筛选到4个SNPs位点,分别位于该基因核苷酸序列中的第147个、第791个、第2 436个和第2 676个碱基,其中2个位点位于外显子上,A-141C位点发生了同义突变,C-791T发生了错义突变,随机检测同批430尾实验个体中4个位点的基因型,均符合Hardy-Weinberg定律。其中A-2436G和C-2676T位点完全连锁,组成单倍型标记H1。分析H1标记中的AB和AA基因型实验群体,显示两者在尾柄长、全长指标上存在显著差异(p<0.05)。综合分析表明,H1标记可用于大口黑鲈分子辅助育种研究。

中华鳖IGFBP1基因克隆及表达分析

[目的]克隆中华鳖IGFBP1 mRNA基因,分析基因生物信息,检测基因在胚胎和组织中表达情况。[方法]从中华鳖转录组中发掘IGFPB1 mRNA基因,并分析基因序列物信息;利用RT-PCR技术,从肝脏组织克隆IGFPB1c DNA基因,并检测其在胚胎和几种组织中的表达情况。[结果]从转录组中发掘到中华鳖IGFPB1 mRNA基因,基因长3 410 bp,包含81 bp的5’UCR序列,2 531 bp的3’UCR序列,798 bp开放阅读框,编码266个氨基酸,蛋白质分子量29.1 k Da,预测IGFPB1蛋白有1个α结构;对其构建的氨基酸序列系统进化树与传统形态分类相吻合;并在中华鳖受精卵孵化30d和45d的胚胎组织及300日龄的肝脏、肌肉和肾脏组织均检测到基因的表达。[结论]克隆到中华鳖IGFBP1基因,检测到该基因在30 d后的胚胎组织及300日龄的3种组织存在表达。

重楼皂苷Ⅰ激活IGFBP1信号通路抑制肝癌细胞生长和增殖的作用机制

目的:探讨中药单体重楼皂苷Ⅰ抑制肝癌细胞生长和增殖的分子作用机制。方法:采用MTT和EDU法检测肝癌Bel-7402细胞的生长和增殖情况;Western Blot法检测Bel-7402细胞中肿瘤相关特异蛋白1(Sp1)和胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP1)的表达水平;采用细胞瞬间转染技术将Sp1过表达质粒或IGFBP1 siRNA转染至细胞;双荧光素酶基因报告系统检测IGFBP1启动子活性。结果:MTT结果发现PPI处理肝癌Bel-7402细胞24、48、72 h后,显著抑制细胞的生长,且呈时间和剂量依赖关系;EDU实验结果显示PPI可显著抑制Bel-7402细胞的增殖(P<0.05);双荧光素酶检测结果表明PPI显著上调Bel-7402细胞中IGFBP1启动子活性(P<0.05);Western Blot结果证实,PPI显著下调Sp1蛋白表达水平(P<0.05),上调IGFBP1蛋白表达水平(P<0.05),过表达Sp1可阻断PPI对IGFBP1的上调作用(P<0.05),siRNA沉默IGFBP1有效逆转PPI对肝癌Bel-7402细胞的生长抑制作用(P<0.05)。结论:IGFBP1可能是PPI抑制肝癌Bel-7402细胞生长和增殖的关键靶蛋白,PPI通过调控Sp1/IGFBP1信号通路抑制肝癌Bel-7402细胞的生长和增殖。

黄芪甲苷调控IGFBP1基因对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其机制研究

目的探讨黄芪甲苷对胰腺癌细胞PANC-1的增殖、迁移和侵袭的影响以及潜在的作用机制。方法设置黄芪甲苷各浓度(20、40、80、100μg/ml)实验组、对照组(无黄芪甲苷)、黄芪甲苷80μg/ml+pcDNA组、黄芪甲苷80μg/ml组+pcDNA-IGFBP1组、si-NC组(转染si-NC)、si-IGFBP1组(转染si-IGFBP1),均用脂质体法转染至胰腺癌细胞PANC-1中。免疫印迹检测蛋白表达;CCK-8法检测细胞抑制率;Transwell检测各组细胞的侵袭和迁移。结果相较于对照组,不同浓度黄芪甲苷组胰腺癌细胞PANC-1的抑制率都显著升高,迁移和侵袭数量显著降低(均P<0.05);相较于si-NC组,si-IGFBP1组胰腺癌细胞PANC-1的细胞抑制率都显著升高,迁移和侵袭数量显著降低(均P<0.05)。IGFBP1过表达可逆转黄芪甲苷对胰腺癌细胞PANC-1增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论黄芪甲苷可抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖、迁移和侵袭,其机制可能与调控IGFBP1的表达有关,可为胰腺癌的预防和治疗提供新靶点和新思路。

LncRNA MIAT在卵巢癌中表达及对肿瘤侵袭能力的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)MIAT在人卵巢癌组织内的表达及对SKOV3细胞侵袭的影响。方法选择行手术切除的50例卵巢癌与对应癌旁组织。PCR检测LncRNA MIAT的相对表达量,分析LncRNA MIAT表达的临床病理意义;采用LncRNA MIAT特异性siRNA转染SKOV3细胞,检测敲除LncRNA MIAT后SKOV3细胞迁移、侵袭能力的变化。PCR检测LncRNA MIAT潜在结合靶点miR-150的表达,PCR及Western印迹检测miR-150下游潜在靶点IGFBP1的表达。结果卵巢癌组织中LncRNA MIAT的表达水平为(1.581±0.063),而对应癌旁组织中LncRNA MIAT的表达水平为(0.438±0.026),差异有统计学意义(t=2.438,P=0.026)。以卵巢癌组织中LncRNA MIAT在卵巢癌组织中平均表达水平为界值,将50例卵巢癌组织分为LncRNA MIAT高表达组(n=33)及低表达组(n=17)。LncRNA MIAT高表达与卵巢癌患者存在淋巴结转移相关(χ^(2)=6.269,P=0.017),提示LncRNA MIAT可能与肿瘤侵袭转移相关。LncRNA MIAT高表达组患者的3年总体生存率(HR=2.392,P=0.004)及无病生存率(HR=1.639,P=0.023)较LncRNA MIAT低表达组的患者更低。LncRNA MIAT高表达是卵巢癌患者预后不良的独立危险因素之一(HR=3.318,P=0.009;HR=2.551,P=0.012)。转染LncRNA MIAT特异性siRNA的细胞内LncRNA MIAT表达水平为(0.257±0.028),转染阴性对照siRNA的细胞内LncRNA MIAT表达水平为(0.884±0.035),差异有统计学意义(t=10.375,P=0.008)。si-MIAT组迁移细胞数量〔(95.112±8.254)个〕显著低于si-control组迁移细胞数量〔(150.381±9.013)个,t=6.223,P=0.021〕。si-MIAT组侵袭细胞数量(68.291±6.364)显著低于si-control组侵袭细胞数量〔(98.462±7.128)个,t=3.328,P=0.035〕。si-MIAT组miR-150表达水平(0.632±0.051)显著高于si-control组(0.231±0.103,t=3.881,P=0.027)。si-MIAT组细胞内IGFBP1 mRNA的表达水平(0.231±0.042)显著低于si-control组(0.528±0.095,t=2.168,P=0.036)。si-MIAT组细胞内IGFBP1蛋白的表达水平(0.331±0.026)显著低于si-control组为(0.582±0.014,t=2.275,P=0.032)。结论卵巢癌中LncRNA MIAT表达升高,LncRNA MIAT可能通过直接下调miR-150的表达进而间接升高IGFBP1的表达来促进卵巢癌细胞的侵袭能力。

低氧调节大鼠前额叶皮层IGFs家族基因的表达

目的：探讨急性和慢性低氧对胰岛素样生长因子（IGFs）家族中IGF-I，IGF一Ⅱ，IGF-1R和IGFBPlmRNA表达变化的调节。方法：我们利用低压低氧舱模拟5km低氧环境，研究大鼠暴露于急性和慢性低氧后的前额叶皮层IGF家族基因的表达变化。结果：急性和慢性连续低氧暴露后，大鼠前额叶皮层中IGF-I，IGF-II，IGF-1R和IGFBPlmRNA对低氧应激表现出明显不同的变化模式。急性低氧时，IGF-I和IGFBPlmRNA表达显著升高。而在慢性连续低氧暴露5～15d后，IGF-I和IGFBPlmRNA表达量逐渐回复到对照水平。但IGF-1R的表达仍然保持较高水平。结论：急性低氧上调IGF基因表达可能参与皮层神经元的保护，而慢性低氧升高的IGF-1R基因表达可能参与慢性低氧损伤的适应过程。

黄颡鱼胰岛素样生长因子结合蛋白1基因的克隆及表达分析

为研究黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胰岛素样生长因子结合蛋白1基因(IGFBP1)的特征,阐明IGFBP1基因在不同性别黄颡鱼组织中的表达特征和IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉中的表达差异,克隆IGFBP1基因的c DNA全长,并进行实时荧光定量PCR检测和Western Blot分析。结果表明:黄颡鱼IGFBP1基因c DNA全长为1 259 bp,其开放阅读框长度为714 bp,编码237个氨基酸,3'端和5'端非翻译区分别为407 bp和138 bp;黄颡鱼IGFBP1基因核苷酸序列与鲇形目斑点叉尾鮰的相似度(89%)较高,与鲢、鲤、鲫、草鱼和团头鲂等的差异较大;肝脏是黄颡鱼IGFBP1基因m RNA表达最丰富的组织,IGFBP1基因在雄性个体心脏、肾脏、肌肉和肠组织中的表达量显著高于雌性的(P<0.05);IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉组织中都有表达,且在雄性个体中的表达量高于在雌性个体中的表达量。

长链非编码RNA IGFBP4-1在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的:探讨鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)患者癌组织中长链非编码RNA IGFBP4-1(LncRNA IGFBP4-1)的表达及临床意义。方法:选取2014年1月至2014年12月海南省人民医院(海南医学院附属海南医院)耳鼻喉科收治的NPC患者88例为研究组,同期慢性鼻咽炎患者66例为对照组。采用实时定量PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测两组鼻咽部组织中LncRNA IGFBP4-1表达水平,分析LncRNA IGFBP4-1表达水平与临床病理参数的关系;采用Kaplan-Meier生存曲线及Log-rank分析和比较LncRNA IGFBP4-1高﹑低表达组患者总生存率差异;采用Cox风险比例模型分析影响预后的因素。结果:研究组癌组织中LncRNA IGFBP4-1表达水平高于对照组(6.24±1.09 vs 1.23±0.35,P<0.001)。NPC患者癌组织中LncRNA IGFBP4-1表达水平与性别和年龄无关(P>0.05),与临床分期、T分级、N分级、远处转移、淋巴结转移﹑复发及EBV DNA相关(P<0.05)。当截断值为4.12时,LncRNA IGFBP4-1区分诊断NPC的曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.893(95%CI:0.763~0.911,P<0.001),敏感度81.3%,特异度71.4%。LncRNA IGFBP4-1高表达组5年总生存率低于LncRNA IGFBP4-1低表达组(42.26%v s57.33%,P<0.05)。多因素分析示,淋巴结转移、临床分期、T分级、LncRNA IGFBP4-1高表达及EBVDNA是影响患者总生存率的独立危险因素。结论:LncRNA IGFBP4-1可很好区分NPC和慢性鼻咽炎患者,LncRNA IGFBP4-1高表达是NPC患者预后不良的分子标志物。

生长激素在营养不良、尿毒症及酸中毒中对胰岛素样生长因子及结合蛋白的作用

目的：研究重组人生长激素（ｒｈＧＨ，２ＩＵ／ｄ）对食物限制、尿毒症和酸中毒幼年大白鼠的影响。方法：食物限制（ＣＲ）是限制食物摄入为正常随意进食（ＡＬ）量的５０％；尿毒症（ＵＢ）产生于大部分肾切除伴有富含蛋白（３０％）ＮａＨＣＯ３饮食；酸中毒（ＣＡ）产生于饮用含有ＮＨ４Ｃｌ的水。采用ＷｅｓｔｅｒｎＬｉｇａｎｄＢｌｏｔ测定血浆ＩＧＦＢＰ３（３８ＫＤ～４２ＫＤ）和ＩＧＦＢＰ４（２４ＫＤ）；然后进一步采用Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ鉴定血浆ＩＧＦＢＰ１和ＩＧＦＢＰ２；在ＣＲ和ＵＢ组采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ测定肝脏ＩＧＦＢＰｓｍＲＮＡ。结果：①ｒｈＧＨ治疗可促进ＣＲＨ和ＵＢＨ组生长指标和血浆ＩＧＦⅠ升高，不增加饮食；②在ＵＢＨ组，ｒｈＧＨ治疗增加ＩＧＦＢＰ１和ＩＧＦＢＰ２在肝脏的ｍＲＮＡ表达，但血浆水平是降低的；③在ＣＲＨ组，ｒｈＧＨ引起ＩＧＦＢＰ１进一步升高，但ＩＧＦＢＰ２降低，肝脏ｍＲＮＡ水平也是降低的；④在ＣＡＨ，ｒｈＧＨ治疗引起血浆ＩＧＦＢＰ２进一步降低，不能增加体重；⑤在所有的ｒｈＧＨ治疗组，ＩＧＦＢＰ４的血浆水平升高（只有ＵＢＨ，Ｐ＜００５），而肝脏ｍＲＮＡ是低水平（只有ＣＲＨ，Ｐ＜００５）。结论：ｒ?

LncRNA IGFBP7-AS1对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及机制

目的探讨LncRNA胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)7-AS1对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法qRT-PCR检测正常星形胶质细胞HA1800、脑胶质瘤细胞系U251、A172、U87中IGFBP7-AS1表达水平。转染IGFBP7-AS1的si-RNA(si-IGFBP7-AS1组)、si-RNA阴性对照(si-con组)、共转染si-IGFBP7-AS1与IGFBP7过表达载体(si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7组)、si-IGFBP7-AS1与空载体(si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control组)至U87细胞,qRT-PCR检测IGFBP7-AS1、Western印迹检测IGFBP7蛋白水平验证转染效果,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell检测细胞迁移和侵袭,Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平。结果与HA1800细胞比较,脑胶质瘤细胞系U251、A172、U87中IGFBP7-AS1表达显著升高(P<0.05)。与si-con组比较,si-IGFBP7-AS1组U251细胞A值、迁移和侵袭数显著降低(P<0.05),U251细胞凋亡率和Bax蛋白表达显著升高(P<0.05),Bcl-2和IGFBP7蛋白表达显著降低(P<0.05)。与si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control组比较,si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7组U251细胞A值、迁移和侵袭数显著升高(P<0.05),细胞凋亡率和Bax蛋白表达显著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论敲减IGFBP7-AS1可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导其凋亡,作用机制可能与下调IGFBP7表达有关。

RbAp46基因激活IGFBP-rPl基因在K562细胞中的表达

目的 探讨视网膜母细胞瘤相关蛋白46（RbAp46）基因对白血病细胞的作用机制。方法 将全长RbAp46基因的cDNA转染人白血病细胞系K562细胞及人脑膜胶质瘤细胞系SHG44细胞，建立稳定过度表达RbAp46基因的细胞株，观察细胞的生物学行为的同时，通过RT—PCR方法寻找表达差异的相关基因。结果 过度表达RbAp46基因的K562细胞及SHG44细胞生长受抑。表现在K562／RbAp46细胞与K562／CMV细胞于生长第4天分别为（90．00±8．40）×10^4和（119．58±9．87）×10^4，SHG44／RbAp46细胞与SHG44／CMV细胞于生长第5天分别为（89．13±4．88）×10^4和（149．42±10．83）×10^4。生长第7天时，K562／RbAp46细胞和K562／CMV细胞集落数分别为131．67±15．57和250．33±26．31（P〈0．01），SHG44／RbAp46细胞和SHG44／CMV细胞集落数分别为50．78±6．77和206．67±37．18（P〈0．01）。K562／RbA046细胞与K562／CMV细胞S期细胞分别占（48．88±4.35）％和（62．78±4．78）％（P〈0．01），G0／G1期细胞分别占（29．10±4．14）％和（22．40±2．43）％（P〈0．05），而SHG44／RbAp46细胞与SHG44／CMV细胞G0／G1期细胞分别占65．6％和48．8％，S期细胞分别占22．6％和38．4％。过度表达RbAp46基因的K562细胞出现胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（IGFBP—rP1）基因的诱导性表达。结论 在K562细胞中可能存在RbAp46和IGFBP-rP1基因之间的调控通路。