广西黑衣壮族ADRB2基因、IL-4R基因多态性与儿童哮喘发病的关联研究

目的探讨β2肾上腺素受体(ADRB2)基因rs1042713、白细胞介素4受体(IL-4R)基因rs1801275位点的多态性与儿童哮喘的相关性。方法采用临床病例对照法,选取黑衣壮中年龄<16岁的儿童200例。其中哮喘组100例,健康组100例。采用聚合酶连接酶链式反应(PCR-LCR chain reaction)检测ADRB2基因rs1042713、IL-4R基因rs1801275位点多态性,并分析其检测结果。结果(1)ADRB2基因rs1042713、IL-4R基因rs1801275位点均检测出AA、AG、GG三种基因型;(2)ADRB2基因rs1042713、IL-4R基因rs1801275位点基因型在哮喘组与健康组中差异有统计学意义(P<0.05);(3)ADRB2基因rs1042713位点基因型AA、AG+AA和等位基因A可能增加哮喘发病风险,GG+AG可降低哮喘发病风险。IL-4R基因rs1801275位点AG、AG+GG和等位基因G可降低哮喘发病风险,相较杂合子AG,纯合子AA+GG能增加哮喘发病风险。结论(1)广西黑衣壮儿童中存在ADRB2基因rs1042713、IL-4R基因rs1801275位点多态性;(2)ADRB2基因rs1042713、IL-4R基因rs1801275位点可能是广西黑衣壮儿童哮喘发病的相关因子。

精氨酸对早期断奶仔猪肠道生长、组织形态及IL-2基因表达水平的影响

【目的】研究精氨酸对超早期断奶仔猪肠道发育和肠道免疫的影响。【方法】试验选用70头7日龄断奶的二元杂交仔猪,随机分成5个处理,每个处理14头,分别饲喂添加0.0%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%精氨酸的日粮。试验开始后第7天和第14天,每个处理分别选取6头猪屠宰取样,检测胃肠指数、小肠组织形态以及小肠IL-2基因表达水平。【结果】试验第7天,添加精氨酸一定程度上促进了胃和小肠以及小肠绒毛的生长(P>0.05),显著提高了空肠和回肠IL-2基因表达水平(P<0.05);试验第14天,添加0.6%和0.8%精氨酸显著提高仔猪小肠重量和长度(P<0.05),空肠和回肠绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值也均有提高的趋势(P>0.05)。【结论】精氨酸能促进超早期断奶仔猪的肠道发育,阻止肠绒毛萎缩,提高肠道IL-2基因表达水平,增强肠道免疫功能。

羊IL-2基因和羊口疮病毒B2L基因真核表达重组质粒联合免疫小鼠的效果评价

为评价羊白介素2(IL-2)基因和羊口疮病毒(OrfV)B2L基因真核表达重组质粒联合接种小鼠的免疫效果,本研究将pVAX1-B2L、pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2及空载体pVAX1和PBS对照组通过肌肉注射的方式免疫KM小鼠,并采用ELISA方法和MTT方法检测免疫小鼠的体液和细胞免疫反应。结果表明,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价和IL-2水平均显著高于pVAX1-B2L免疫组,与pVAX1和PBS对照组相比差异极显著(p<0.01)。而且pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L免疫组、空载体pVAX1组和PBS对照组(p<0.01)。因此,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫KM小鼠可以诱导特异性体液免疫和细胞免疫,并且IL-2具有免疫佐剂的作用,为进一步将其用于Orf的防制奠定了基础。

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,利用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析,表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17 ku大小的分泌性目的蛋白,采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化,纯化结果理想。

鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达

根据已发表的鸡白介素-2(ChIL-2)cDNA编码基因序列设计3条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429 bp的ChIL-2全长基因cDNA和363 bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA.将ChIL-2全长和去信号肽的基因cDNA分别克隆到原核表达载体pET28a(+),构建原核重组表达质粒pET28a-IL-2和pET28a-△SIL-2,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,在22 ku和18 ku处有2条清晰的蛋白带,相同条件下pET28a-△SIL-2表达量较高.RNAstructure软件分析表明,pET28a-IL-2的mRNA5′端序列形成了复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在原核细胞中的表达有一定的影响.

^(60)Co辐射后IL-2基因修饰肿瘤细胞生物学行为的改变

目的研究IL - 2基因修饰人肿瘤细胞生物学行为是否因辐射而发生变化。 方法分别从细胞形态结构、MHC分子表达、整合的基因IL - 2基因是否丢失、能否保持mRNA表达、能否分泌表达生物活性的IL - 2等方面进行了实验。结果未见整合的IL - 2基因丢失 ,能表达IL - 2mRNA且在一定时间内持续分泌具有生物活性的IL - 2 ;细胞膜表面MHC分子无明显改变 ;细胞形态结构无明显变化。结论经60 Co辐射修饰的肿瘤细胞致瘤性消失 ,但在一定时间内能分泌IL - 2 ,这为开展基因工程“瘤苗”的临床应用提供了依据。

IL-2真核质粒对乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗猪体免疫反应的分子佐剂效应

为研究猪IL-2真核表达质粒对乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗(Lactobacillus acidophilusSFMD-1)猪体免疫的分子佐剂效应,通过RT-PCR方法从猪的肠系膜淋巴结克隆猪IL-2基因,基于pRc/CMV2载体,构建编码猪IL-2的真核表达质粒pCSIL2,以RT-PCR方法分析了该质粒转染PK15细胞以后的mRNA表达。结果显示预期的429 bp IL-2带仅出现在pCSIL2转染细胞。试验猪单独免疫L.acidophilusSFMD-1或者联合免疫pCSIL2质粒,后者能够增强FMDV-VP1特异的T细胞和B细胞反应,免疫后5周,单独免疫组和联合免疫组的抗体水平分别为1.50和1.66;免疫后6周,抗体水平分别上升到1.83和2.28;在T细胞增殖试验中,L.acidophilusSFMD-1单独免疫组和pCSIL2联合免疫组的刺激指数(SI)分别为2.00和2.70。结果表明,联合应用IL-2真核表达质粒是改进乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗免疫原性和效能的有效方法。

猪IL-2真核表达质粒构建及对PRRSV-ORF5基因疫苗免疫佐剂作用的研究

本研究应用真核表达载体pcDNA3.1(+)和猪白细胞介素2(IL-2)基因成功构建了IL-2的真核表达质粒(pcDNA-IL-2),探讨了pcDNA-IL-2作为分子免疫佐剂对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)ORF5基因疫苗(pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5)免疫猪的增强作用。经间接ELISA法、MTT比色法及流式细胞仪分别对pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪、pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪、pcDNA3.1(+)空载体和灭菌水免疫对照猪的血清抗PRRSV抗体IgG、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4+和CD8+细胞比例进行检测,结果表明pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪的IgG含量、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4+和CD8+细胞比例与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪相比有显著差异(P<0.05)。说明pcDNA-IL-2能显著增强pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5基因疫苗免疫猪的体液和细胞免疫应答,可作为PRRSV基因疫苗的良好佐剂。

胸腺九肽对鸡脾淋巴细胞增殖转化及IL-2基因表达与分泌的影响

采用MTT比色法、相对半定量RT-PCR法和放射免疫测定(RIA)法研究了不同浓度的胸腺九肽对离体培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化I、L-2基因表达与分泌的影响。结果表明,用10 ng/mL和1 ng/mL胸腺九肽处理鸡脾淋巴细胞8 h后,能显著增加由ConA诱导的淋巴细胞增殖转化反应,显著提高IL-2基因的表达水平以及细胞培养上清液中的IL-2含量(P<0.05);100 ng/mL的胸腺九肽虽有增强脾淋巴细胞增殖转化反应以及提高IL-2基因表达和分泌能力的趋势,但与对照组无显著差异(P>0.05)。提示,胸腺九肽能增强鸡脾淋巴细胞的增殖转化反应,并主要在基因转录水平上促进IL-2的合成与分泌,其作用与剂量大小有关。

15个鸡群体IL-2基因的遗传变异分析

为了深入研究鸡IL-2基因的多态性及为鸡抗病育种提供理论依据,本研究以IL-2基因为研究对象,采用直接测序的方法对11个中国地方鸡品种、3个引进鸡品种和1个培育鸡品种共448个个体该基因的遗传变异进行了分析。通过DNA池和直接测序技术,共发现了13个突变位点。对所有个体的一段包含5个SNPs的区域进行分析,发现不同等位基因在15个鸡群体间分布存在显著差异,表明不同品种间IL-2基因具有丰富的遗传变异资源,可为抗病基因的选择提供素材;群体遗传学指标分析表明,H系京星黄鸡的遗传多样性最低,这与其品种形成过程一致,其他品种多样性差异不大;单倍型分析共发现23种单倍型,其中H1(CAACG)、H2(CAATT)、H4(TGTTG)、H9(TGTTG)、H11(TATCG)和H16(CATCG)为中国地方鸡品种特有或优势单倍型,可能与抗病能力相关。

B7-1与B7-2对调节人IL-2基因的转录因子NF-κB和AP-1的相同作用

为了解B7共刺激对细胞因子 ,特别是对IL 2mRNA及转录因子NF κB和AP 1的影响 ,探讨B7介导的IL 2调节的分子机制 ,在异基因混合淋巴细胞反应 (MLR)体系中分别或联合加入抗B7 1、抗B7 2单克隆抗体和CTLA 4Ig以阻断B7/CD2 8信号传导 ,通过竞争性PCR定量检测其对IL 2和IL 4mRNA的影响 ,并初步测定IFN γmRNA的改变 ,同时用转染MHCⅡ类分子及联合转染等量B7 1或B7 2的NIH3T3转基因细胞tDR7,tDR7/B7 1和tDR7/B7 2刺激CD2 8+ T细胞 ,通过DNA 蛋白结合实验观察B7对IL 2转录因子NF κB和AP 1的影响。结果表明 :抗B7 2单抗和CTLA 4Ig可明显抑制B7介导的IL 2和IL 4mRNA合成 ,而抗B7 1单抗仅有轻度抑制作用 ,2种或 3种抗体联合应用时抑制作用相加。MLR 1 - 6小时 ,单独tDR7即可诱导NF κB的表达 ,联合转染B7早期对其结合活力无明显影响 ,6小时后tDR7诱导作用减弱 ,B7却可显著延长tDR7的诱导作用至 72小时。tDR7早期同样可诱导AP 1的表达 ,联合转染B7分子在 2 4小时内对其有一定的抑制作用 ,而在反应后期可延长tDR7对AP 1的上调作用 ,B7 1与B7 2间作用未见明显不同。结论 :B7通过减少IL 2mRNA降解和影响基因转录而上调IL 2分泌 ,并可同时影响多种细胞因子分泌 ;在转录水平B7 1与B7 2作用未见明显不同 。

HG-1/IL-2基因修饰瘤苗治疗晚期胃癌的初步临床研究(附8例报告)

目的 :评估同种异型 (HLA A2 +)IL 2基因工程化人胃癌细胞瘤苗 (HG 1/IL 2 )治疗晚期胃癌的毒副作用及临床安全性。方法 :应用基因工程技术 ,以逆转录病毒载体介导将人IL 2cDNA转导入人胃癌细胞株MKN 45 ,经10 0Gy60Co照射灭活后 ,制备成基因工程化胃癌细胞瘤苗 (HG 1/IL 2 )。 2 0 0 1年 4月～ 2 0 0 1年 7月 ,对 8例晚期胃癌病人施行HG 1/IL 2瘤苗治疗。以 5次接种为一疗程 ,接种时间分别在第 1、8、15、2 9和第 5 8天 ,每次于一侧腹股沟和对侧腋部皮下多点注射 1× 10 7个细胞。每次接种后严格观察毒副反应 ,并在治疗开始前一周和治疗结束后进行临床评估 ,同时进行凝血功能、血液生化学、肿瘤标记物及相关免疫指标检测。结果 :除 1例在第 3次接种后 ,因高热和全身性荨麻疹而终止试验外 ,余均顺利完成治疗。接种后低热和注射局部红肿、酸胀感是最常见的反应。治疗前后未观察到病人血液学、凝血功能、肝肾功能、血清标志物等指标的明显异常。部分病人治疗后血清转铁蛋白、IgG、IgA、IgM、IL 2等体液免疫指标和CD3 、CD4 、CD8等细胞免疫指标有一定程度升高。结论 :在密切观察的前提下 ,HG 1/IL

牛IL-2cDNA缺失突变的矫正及表达产物生物学活性测定

根据GenBank中的牛IL 2基因序列 ,设计一对引物Pa和Pd ,以牛外周血淋巴细胞为材料 ,用RT PCR方法扩增得到牛IL 2cDNA ,测序发现在扩增产物的第 2 4 0位缺失了一个A碱基。采用重叠延伸剪接术 (SOE法 )向突变体定点插入该碱基 ,然后与表达载体连接 ,获得了正确的表达产物。经RT PCR检测证明 ,重组的牛IL 2蛋白具有较好的生物学活性 ,能诱导肿瘤坏死因子TNF α和干扰素IFN γ的产生。

IL-2基因转染逆转绒癌耐药细胞系多药耐药性

用RT PCR的方法克隆人的IL 2基因 ,将IL 2基因插入真核表达载体pcDNA3 1(+)中 ,通过阳离子脂质体将IL 2基因转染用足叶乙甙 (VP 16 )诱导建立的绒癌耐药细胞系JEG 3/VP16 ,用G418筛选含IL 2DNA片段的单个细胞克隆 ,检测转染前后细胞对 5 氟尿嘧啶 (5 Fu) ,氨甲蝶呤 (MTX) ,VP 16 ,更生霉素 (KSM) ,紫杉醇 (TAXOL)耐药指数的变化 ,用RT PCR的方法测定转染前后细胞IL 2和多种耐药基因包括肺耐药蛋白 (LRP) ,多药耐药相关蛋白 (MRP) ,谷胱甘肽转移酶 (GST π) ,二氢叶酸还原酶 (DHFR)和多药耐药基因 (MDR 1)的mRNA表达情况。结果表明转染IL 2的细胞中用RT PCR的方法检测到IL 2mRNA表达 ,转染IL 2基因的细胞耐药指数降低 ,MDR 1mRNA表达转阴 ,而其它耐药基因的表达无明显改变。

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的 :构建含人IL 2cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3.1IL 2 /Fc ,并在真核细胞中表达 ,以期用于乙型肝炎病毒 (HBV)DNA疫苗的研究。 方法 :应用重叠延伸剪切技术 (SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL 2 /Fc,回收后克隆到中间 pGEM TEasyTA克隆载体 ,得到合适的酶切位点后 ,用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3.1中 ,得到真核重组载体 pcDNA 3.1IL 2 /Fc。然后用脂质体法转染SP2 / 0细胞。 结果 :对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析 ,证明连接正确 ;经ELISA检测证实 ,该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。 结论 :成功构建了真核表达载体 pcDNA 3.1IL 2 /Fc ,并在SP2 / 0细胞中有效表达。

将IL-2基因构建到叶绿体转化载体并转入烟草

以人白细胞介素2（IL-2）基因为目的基因，烟草accD和ORF184同源序列为侧翼引导序列构建成烟草叶绿体转化载体pAIL。以火烟草NC89为转化受体，通过基因枪方法对烟草叶片进行轰击转化。轰击参数为：每枪0．6μm的金粉300～500μg，轰击距离6cm，真空度9．48×10^4Pa。在500mg/L的壮观霉素筛选眶下，经约30d的筛选分化，逐渐产牛绿色的抗壮观霉素芽或愈伤，目前已获得31株（丛）抗性芽及8块抗性愈伤。用IL-2基因的PCR引物对4株较大的小苗进行检测，初步证明3株为转基因植株。

插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的 :构建插入CpG序列和IL - 2基因的HBV重组真核表达载体。方法 :采用PCR产物直接克隆方法 ,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1+ -HBsAg ;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒 pcDNA3.1+ -S/CpG1、pcDNA3.1+ -S/CpG2、pcDNA3.1+ -S/CpG1+CpG2及IL - 2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1+ -S/IL - 2。通过脂质体基因转移技术导入Cos- 7细胞中检测其瞬间表达。结果 :通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL - 2基因和CpG序列 ,体外转染Cos- 7细胞后可见基因的表达和分泌。结论 :本实验成功构建了我们所设计的 5种重组质粒 。

改组猪IL-2和重组IL-6C基因增强猪口蹄疫疫苗的免疫应答

以离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒,包裹重组改组的猪IL-2基因表达质粒(VRIL2S)、重组IL-6和CpG(VPIL6C)质粒(CNP-VRIL2S-VPIL6C-CNP),按0.5mg/头肌肉注射壳聚糖包装质粒接种21日龄健康三元杂交猪,同时肌肉注射免疫灭活口蹄疫疫苗;在免疫后7、14、28、42和56d,采血检测实验猪的免疫球蛋白、特异抗体和免疫细胞的动态变化。结果发现:接种后56d,改组猪IL-2和重组IL-6C质粒接种猪血液中的特异性抗口蹄疫抗体、IgG、IgA和IgM含量均较对照空白疫苗免疫猪显著升高(P<0.05),其IL-2、IL-6水平和淋巴细胞、单核细胞的数量也相应较灭活疫苗对照组明显增加(P<0.05)。这些证明猪IL-2和IL-6基因与CpG有良好的免疫协同增强效应,能有效地增强疫苗的特异体液和细胞免疫应答反应,可作为安全高效的新型免疫基因分子佐剂,促进猪对口蹄疫疫苗的免疫防御抗病力,抵御口蹄疫的感染。

鸡新城疫系疫苗诱导鸡IL-2基因转录及cDNA克隆的研究

应用RT-PCR方法从鸡新城疫 系疫苗接种鸡胚的脾淋巴细胞中扩增出IL-2基因cDNA。结果表明,以鸡新城疫 系疫苗稀释50倍或100倍接种10日龄鸡胚,培养48h的脾脏提取mRNA的扩增效果最好。测序结果显示,所扩增片段的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列,与已发表的IL-2基因的同源性分别为97.7%～99.8%和95.1%～99.3%。其中第8位、68位和130位氨基酸(分别是L,V和S)的变异是其他品种鸡所没有的。

鸡IL-2基因cDNA输卵管组织特异性表达载体的构建与表达

将克隆并测序的鸡卵清蛋白基因5′端调控序列和鸡IL-2基因cDNA,以串联方式置于真核表达载体pcDNA3的CM V启动子下游,构建了鸡输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2。将真核表达载体pcDNA3-IL 2和构建的输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2分别转染鸡输卵管上皮细胞,激素诱导72 h后,用淋巴细胞转化试验检测细胞培养液中IL-2的表达水平及生物学活性。结果显示,转染细胞均可表达IL-2,且所表达的IL-2有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性;转染pcDNA3-OVP-IL 2的输卵管上皮细胞表达产物在1∶256稀释水平下仍具有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性。转染pcDNA3-IL 2载体的输卵管上皮细胞虽有IL-2表达,但水平较低。