艾灸对亚急性衰老大鼠胸腺CD4^+T细胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB蛋白表达的影响

目的:通过观察IL-2及相关受体蛋白水平的变化情况,探讨艾灸对亚急性衰老大鼠胸腺CD4+T细胞的影响。方法:采用D-半乳糖致亚急性衰老大鼠模型。24只清洁级雄性SD大鼠随机分为:正常组,模型组和艾灸组。艾灸组温和灸双侧肾俞穴5 min/次,共计40 d。采用免疫磁珠法分离胸腺CD4+T细胞,并再用Western Blot方法检测各组大鼠胸腺CD4+T细胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB的蛋白表达量。结果:模型组大鼠胸腺CD4+T细胞中IL-2、IL-2Rα、NF-κB、I-κB蛋白的表达量较正常组降低,差异有统计学意义(P<0.05);艾灸组大鼠胸腺CD4+T细胞中IL-2、IL-2Rα、NF-κB、I-κB蛋白表达量升高,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:艾灸肾俞穴可上调胸腺CD4+T细胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB、I-κB的表达。

IL-2Rα模拟肽抑制小鼠皮肤移植排斥反应的研究

目的:研究IL-2Rα模拟肽CP对小鼠皮肤移植排斥反应的影响。方法:采用小鼠同种皮肤移植模型,通过淋巴细胞增殖试验、单向混合淋巴细胞反应、脾脏T淋巴细胞亚群分析和细胞因子分泌水平测定、皮肤移植物组织学改变、记录皮肤移植物平均存活时间(MST)研究环七肽CP的免疫抑制效应。结果:环七肽CP可降低小鼠脾细胞增殖反应的强度、减少受鼠脾脏T淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞的数目并降低CD4+/CD8+的比值、下调受鼠脾脏T淋巴细胞诱导上清中IL-2和IFN的水平,并可延长皮肤移植物平均存活时间(MST);环七肽CP与免疫抑制剂CsA联用,显示二者具有协同效应。结论:环肽CP以IL-2Rα模拟肽的方式发挥生物学效应,可有效抑制小鼠皮肤移植排斥反应。

利用噬菌体肽库筛选IL-2Rα模拟表位肽的研究

目的筛选IL-2Rα模拟表位肽,为研制高效、特异性强的小分子肽类免疫抑制剂奠定基础。方法应用离子交换层析法从小鼠腹水中纯化抗人IL-2Rα单克隆抗体5G1,细胞ELISA方法检测其特异性。用5G1单抗筛选噬菌体环七肽库,并对噬菌体克隆进行抗原性鉴定。根据阳性克隆的DNA序列合成环肽并鉴定其生物活性。结果经5轮筛选、鉴定,获得5个与5G1有较强结合特性的噬菌体阳性克隆。DNA测序并推导氨基酸序列,得到Lys-X-{X}-Lys-Gly保守序列。依此序列合成环七肽CP,小鼠淋巴细胞增殖试验证实其有免疫抑制活性。结论环肽CP为IL-2Rα模拟表位肽,可作为IL-2Rα的拮抗剂发挥免疫抑制效应。

人肝细胞毛细胆管表达IL-2Rα的研究及意义

目的了解人肝细胞毛细胆管是否表达IL-2Rα,观察其表达特异性和灵敏度。方法对正常人肝组织、慢性乙型肝炎等不同病种人肝组织进行IL-2Rα标记,通过免疫组织化学染色、免疫荧光化学染色及免疫电镜3种方法观察其表达。结果免疫组化染色法和免疫荧光染色法显示IL-2Rα标记人肝细胞膜毛细胆管面定位正确,无非特异性染色,而肝细胞膜的血窦面、细胞质、细胞核不被IL-2Rα标记。酶标记免疫电镜显示人肝细胞膜毛细胆管面有明显电子致密物沉积。结论人肝组织毛细胆管确实表达IL-2Rα,其特异性和灵敏度均优于CEA(多克隆抗体)。

可结合细胞表面IL-2Rα的短肽分子的筛选

目的利用噬菌体肽库技术筛选可特异性结合IL-2Rα的短肽序列,探索获得IL-2Rα小分子拮抗剂的可能性。方法以高表达IL-2Rα的MT-2细胞为钓饵,筛选噬菌体线性12肽库,用抗IL-2Rα单克隆抗体竞争洗脱结合的噬菌体,细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆,并测序。结果随机挑选的17个克隆中有7个可与MT-2细胞结合。免疫组化显示阳性噬菌体克隆M15可与MT-2细胞及PHA刺激的PBMC结合。根据阳性克隆DNA序列,推导出氨基酸序列,共有6种序列,富含亲水氨基酸并包含Tyr、Phe、Leu保守残基。结论得到含Tyr、Phe保守残基的序列,阳性序列可结合细胞表面的IL-2Rα。

食道癌患者IL-2RαmRNA表达的初步研究

癌症患者的免疫功能与肿瘤的发生发展密切相关，IL-2通过和细胞膜上的IL-2R结合，调节T、B淋巴细胞、NK、LAK细胞的增殖和功能．发挥其抗瘤作用。IL2R的正常或异常表达与机体的生理、病理过程密切相关。本文重点探讨食道癌患者IL-2R mRNA表达与肿瘤转移的关系。

B细胞淋巴瘤TIL-T的IL-2Rα基因突变及蛋白表达检测

目的 :检测B细胞淋巴瘤 (B NHL)中肿瘤浸润T细胞 (TIL T)的活化标记IL 2Rα(CD2 5 )的基因及蛋白表达 ,寻找TIL T在B NHL肿瘤微环境中存在意义的实验依据。方法 :将 19例B NHL提取RNA ,采用RT PCR和SSCP检测其IL 2Rα的Ⅳ Ⅷ外显子基因突变与否 ;19例B NHL采用细胞免疫化学染色进行CD3、CD4、CD8、CD2 0、CD2 5细胞免疫表型的分析 ;2 9例B NHL和 2 0例良性淋巴组织 ,采用冰冻切片免疫组化方法进行IL 2Rα(CD2 5 )蛋白表达的检测。结果 :SSCP显示 19例TIL -T的IL 2Rα未发现异常泳动条带。细胞免疫化学染色示B NHL中 5 2 .6 3% (10 /19例 )的CD2 5 +细胞少于 10 % ,TIL T(CD3+)与CD4相关 (r =0 .5 7,P <0 .0 1)并与CD2 5相关 (r =0 .5 0 ,P <0 .0 5 )。免疫组化示 86 .2 % (2 5 /2 9例 )的B NHL中CD2 5表达 (+/- )和 (+) ,且主要表达在TIL T细胞上 ,呈散在分布 ,阳性细胞少于T标记细胞。结论 :19例TIL T的IL 2Rα在RNA水平未发现基因异常 ;CD2 5蛋白在B NHL中呈弱表达趋势。提示部分TIL T不表达CD2 5 ,推测TIL T的IL 2Rα的表达在转录后机制中可能出现异常或TIL T存在活化障碍。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

人IL-2RαcDNA探针的制备及其在mRNA检测上的应用

从质粒pJSB15中分离出人IL-2RαcDNA 673b_p片段,用放射性同位素α-^(32)p标记此片段,制备了IL-2RαcDNA探针。利用该探针与淋巴细胞RNA进行点杂交。结果证明,pHA、TPA均可诱导IL-2Rα转录增加,二者合用有明显的协同效应;且发现新鲜分离的多种白血病细胞测出的IL-2R_α(?)RNA水平高低不同,这可能有助于临床分型。

人IL-2Rα基因在CHO细胞中的稳定整合和表达及其应用

目的 应用本组制备的白细胞介素 2受体 (IL- 2 R) ,建立一种既安全又简便 ,并能定量检测白细胞介素2 (IL- 2 )生物活性的方法。方法 采用 Southern印迹杂交方法 ,检测重组分泌型 IL- 2 Rα亚基 (rs IL- 2 Rα)基因在高效表达的转染细胞基因组中的稳定整合 ;以 Western免疫印迹法测定 rs IL- 2 Rα的相对分子质量 ,建立定量检测人 IL- 2生物活性的受体与抗体夹心酶联免疫吸附测定 (r EL ISA)方法。结果 (1) Southern印迹分析表明 ,rs IL- 2 Rα基因已稳定整合到高表达的转染 CHO细胞基因组中 ;(2 ) rs IL- 2 Rα的相对分子质量为 40 0 0 0左右 ;(3)应用建立的r EL ISA方法测定人 IL- 2标准溶液结果表明 ,IL- 2的标准曲线范围为 31.2 5～ 5 0 0 .0 0 U (r=0 .9995 ) ;预先将山羊抗人 IL- 2 Ig G与 IL- 2保温后 ,所得标准曲线的斜率明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 与传统测定 IL- 2的方法相比 ,用rs IL- 2 Rα建立的受体 -抗体夹心 r EL ISA方法不仅具有准确、特异性强及操作简便的特点 ,而且 ,所得结果直接反映了被测样品中具有结合 IL- 2 R活性的 IL-

人IL-2Rα链基因负调控元件结合蛋白的分离纯化

淋巴细胞表面高亲和力IL-2R的出现受IL－2Ra基因的诱导表达控制，而IL－2Ra链基因的表达受到严格的时空的调控。在IL-2Ra基因上游除存在正调控元件外还存在负调控元件（-391TCATCCCAGG-381，NRE）及其下游不完全反转重复序列（-153CCTGGTTTGA-143NIRS）。本组曾通过紫外交联实验发现Jurkat细胞有一种蛋白质与NIRS和NRE特异结合。本文利用肝素-亲和柱层析及序列特异DNA亲和层析认1010Jurkat细胞中获得了分子量约为75kD的NRE特异结合蛋白。EMSA实验表明，纯化后的蛋白与NRE所形成的结合物能被NIRS及HIVLTR的负调控元件所竞争，提示该NRE结合蛋白不仅可能参与IL-2Ra基因的转录调控，而且可能在HIV基因表达过程中起某种作用。

重组CHO细胞高效表达人IL-2Rα链的研究

将人IL-2Ra cDNA导入CHOdhfr^-细胞,经ELISA对180个重组克隆的鉴定,筛选出13株高产克隆,其OD值均大于0.80。再经MTX扩增基因试验,获得了3株更高表达水平的克隆,其OD值分别为1.95、1.86及1.66。稳定性试验表明:MTX诱导前的高效表达水平在30代次时未见改变,MTX的扩增基因效果可维持15—20代次,rIL-2Ra的分子量为50—55kd,具有Tac抗原性和结合IL-2的能力。Southern分析证实:MTX是通过扩增外源基因的份额来提高重组产物的表达水平。本试验为发酵培养重组CHO细胞、大量制备IL-2Ra蛋白奠定了坚实基础。

抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab的构建和表达

目的：构建和表达抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab片段，并测定该抗体片段的生物学活性。方法：采用连续PCR方法构建抗人 IL-2Rα抗体 Fab克隆载体5G1-pA22，并通过限制性酶切反应将抗人 IL-2Rα抗体 Fab基因从克隆载体 5G1-pA22重组人表达载体pET-28b，并在大肠杆菌BL21（DE3）中用IPTG诱导以包含体形式高效表达，该表达产物约占菌体蛋白20％以上。经超声破碎、洗涤、变性和复性后，采用双抗体夹心ELISA法及体外抗体竞争抑制试验鉴定表达产物的生物学活性。结果：抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab成功构建，并以包含体形式表达，表达产物的产量达1mg/ml。双抗体夹心ELISA法试验表明抗体 Fab段与 IL-2Rα有特异的结合能力，体外抗体竞争抑制实验表明 Fab段可桔抗 IL-2与活化T细胞表面 IL-2Rα有特异的结合，抑制T细胞活化，增殖，抑制率达90％以上。结论：成功地构建了抗人IL-2Rα抗体Fh段，并获得高效表达，其具有较好的生物学活性。

利用噬菌体肽库确定IL-2Rα表位序列

目的：确定ＩＬ－2Ｒα表位，为研制高效特异性强的小分子肽类免疫抑制剂奠定基础。方法：用抗ＩＬ－２Ｒα单克隆抗体５Ｇ１对噬菌体六肽库进行筛选，选择出与５Ｇ１结合较强的克隆，经ＤＮＡ序列分析，获得保守序列。对合保守序列的克隆进行生物学活性鉴定。结果：选择出３１个与５Ｇ１结合较强的克隆。获得Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ和Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ两种保守序列。生物学活性鉴定表明：含Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ序列克隆较含Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ被抑制效果好。结论：Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ是ＩＬ－２Ｒα表位的关键序列。以此表位序列合成的小分子肽可作为ＩＬ－２Ｒα的拮抗剂而成为免疫抑制剂。

B淋巴瘤中纯化TIL-T的IL-2Rα基因突变及蛋白表达检测

目的 :探讨B淋巴瘤 (B NHL)中肿瘤浸润T细胞 (TIL T)的活化标记IL 2Rα(CD2 5 )的基因突变 ,肿瘤组织中CD2 5蛋白表达及TIL T的增殖特点。方法 :19例B NHL提纯TIL T ,RT PCR和SSCP检测其IL 2Rα的基因突变与否 ;MTT法检测 17例TIL T在低浓度rIL 2刺激下的增殖情况 ;冰冻切片免疫组化检测 2 9例B NHL中IL 2Rα蛋白的表达。结果 :SSCP显示19例TIL T的IL 2Rα未发现异常泳动条带 ;rIL 2刺激下 ,13 17例 (76 5 % )TIL T增殖表现下调 ;免疫组化显示B NHL中 2 5 2 9例 (86 2 % )CD2 5表达为 (+ - )和 (+) ,4 2 9例 (13 8% )CD2 5表达为 (++～ +++)。结论 :TIL T的IL 2Rα未发现基因异常 ,但TIL T表达CD2 5蛋白数量异常 ,提示B T接触活化异常可能是B

Poly(A)信号及3’非转译区对IL-2Rα表达调控的影响

将IL-2Ra cDNA3’端系列缺失克隆的重组质粒导入CHO细胞,经DNA、RNA及蛋白质印迹分析表明:缺3’非转译区(3’UTR)及Poly(A)信号序列的缺失子DNA,可以整合到受体细胞染色体上,但不能形成稳定的mRNA及表达rIL-2Ra;IL-2Ra cDNA上1297bp处的ATTAAA序列独立地显示出Poly(A)信号功能,相应的缺失子DNA能转录形成稳定的mRNA和表达rIL-2Ra。结果表明:poly(A)尾是位于3’端的转译调控因子,3’UTR与IL-2Ra cDNA的表达调控密切相关。

IL-2Rα链cDNA3’端系列缺失克隆的构建

运用Bal 31末端缺失技术将人IL-2Rα cDNA进行3’—5’的单向缺失,获得了IL-2RαcDNA3’端的系列缺失子。经DNA顺序分析表明:这些缺失克隆分别含有不同位置上的Poly(A)信号序列,将它们克隆到穿梭质粒P^(91023)上,得到了系列缺失子的表达性质粒P^(91-IL2R),为进一步分析Poly(A)及3’非转译区(3’UTR)对IL-2Rα基因转译调控的影响创造了必要条件。

乳杆菌Lb．casei Zhang诱生小鼠脾细胞IL-2和IL-2Rα的作用

目的：研究乳杆菌Lb．casel Zhang对小鼠脾细胞IL-2和其受体IL-2R仪的诱生作用，从基因转录水平探讨其免疫调节的特点。方法：利用分离自酸马奶，并经过耐酸性实验、人工胃肠消化液中存活能力筛选的Lb．caseiZhang，制备活菌制剂分高、中、低三个剂量组灌服小鼠，分别于第3、7、11、15d，摘取脾脏，计算脾指数，RT—PCR法测定睥脏中IL-2和IL-2R仪mRNA的转录水平。结果：脾指数在连续灌服7d后开始明显增加，至11d时仍保持较高水平，并具有一定的剂量依赖效应；IL-2和IL-2R仪mRNA的转录水平与脾指数相适应在连续灌服7d后开始明显增加，至11d时达到高峰，且具有一定的剂量依赖效应。结论：乳杆菌Lb．caseiZhang能够诱导脾脏淋巴细胞自分泌生长因子IL-2及其活化受体IL-2R仅的转录及分泌，进而激活Till细胞，从而发挥免疫调节作用。

人外周血淋巴细胞IL-2R_α表达特性及动力学

本文研究了PHA诱导人外周血淋巴细胞(PBl)IL-2Rα表达的动力学,并探讨了TPA、5-氮胞苷、羟基脲、放线菌素D和秋水仙素等对PHA作用的影响。新分离的PBL几乎不表达IL-2Rα。接受PHA刺激12h时,IL-2Rα表达即明显增加,72h达高峰,随后逐渐降下,至第七天接近未刺激水平。TPA、5-氮胞苷可增加PHA的作用,羟基脲和秋水仙素不影响,而放线菌素D可抑制pHA的效应。这表明人PBL IL-2Rα表达在转录水平调节,与DNA合成及细胞有丝分裂关系不大。体外培养的淋巴母细胞再次接触上述试剂时与初次接触呈现相同的反应性。

人肝细胞毛细胆管表达IL-2R_α的初步研究

目的了解人肝细胞毛细胆管是否表达IL-2Rα。方法对正常人肝组织、慢性乙型肝炎等不同病种人肝组织进行IL-2Rα标记,通过免疫组织化学染色、免疫荧光化学染色及免疫电镜三种方法观察其表达。结果免疫组化染色法和免疫荧光染色法显示IL-2Rα标记人肝细胞膜毛细胆管面定位正确,无非特异性染色,而肝细胞膜的血窦面、细胞浆、细胞核不被IL-2Rα标记。酶标记免疫电镜显示人肝细胞膜毛细胆管面有明显电子致密物沉积。结论人肝组织毛细胆管确实表达IL-2Rα,并且有很强的特异性和灵敏度。