新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的表达优化及下游纯化

目的优化提高重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白在原核细胞中的表达量,并建立有效的下游纯化路线。方法对IL6D24-PE40KDEL的受体菌、菌体生长状态及诱导表达时间等进行优化,经反复筛选确定了高效简捷的纯化路线:即将Q型强离子交换树脂与DEAE弱离子交换树脂相结合的两步纯化法。结果宿主工程菌HB101的优化表达条件为2%接种量,30℃培养3h,42℃再诱导4h,可使目标蛋白的表达量由最初的13.5%提高到23.8%;经12%SDS-PAGE蛋白电泳证实,特异性表达产物为包涵体形式,占包涵体蛋白的40%,分子量约为60kD,与所预测的IL6D24-PE40KDEL融合蛋白的分子量相吻合。两步纯化法可获得纯度>95%的IL6D24-PE40KDEL融合蛋白,纯化蛋白的回收率为8.7%,经Western-blot实验证明,它可同PEA多抗和IL6单抗特异性的结合。MTT试验检测证实,该融合蛋白能特异性的杀伤高表达IL6R的U266多发性骨髓瘤细胞,ID50为180ng/ml;而对IL6R的T淋巴白血病细胞CEM则无杀伤,ID50>1000ng/ml。结论获得了高表达重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的菌株并建立了高效简捷的下游纯化路线,融合蛋白能特异性的杀伤表达IL6R的多发性骨髓瘤细胞系U266。

新型重组IL6D24PE40KDEL外毒素融合蛋白的理化分析

为了对构建成功的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的部分物化表征进行分析鉴定 ,采用Edman法、SDS PAGE法、胰蛋白酶消化的MALDI TOF MS质谱法、蛋白印迹法和MTT法分别测定该融合蛋白的N 末端 6个氨基酸、相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性。结果表明 :所构建表达纯化的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白N末端 6个氨基酸序列为Met Ile Asp Lys Gln Ile ,而IL 6缺失 2 4个氨基酸后的原序列为Ile Asp Lys Gln Ile ,由于采用了大肠杆菌表达系统 ,因此在N末端第 1位多出了 1个Met,经12 %SDS PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算 ,其相对分子量为 5 8.75kD ,与理论值 5 6.9kD相比误差在5 %之内。MALTI TOF MS质谱测定共获得 10个与理论预测值相符的肽段 ,经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明 ,在分子量为 5 7kD左右的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白 ,证明本融合蛋白为全新蛋白 ,与预测的目的蛋白相符。WB实验显示IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白能与IL 6及PEA抗体特异性结合。MTT生物活性测定表明 ,该融合蛋白对表达IL 6R的多发性骨髓瘤细胞系U2 66产生特异性杀伤 ,而对不表达IL6R的CEM淋巴细胞系无任何杀伤。结论

新型重组IL-6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白复性及纯化

目的 :对高效表达的重组IL 6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白进行包涵体的分离、变性与复性以及纯化。方法 :对表达菌体进行超声破碎、洗涤、氧化还原法变性及复性 ,经离子交换层析。结果 :工程菌HB10 1/ pE0 1T的表达产物是以包涵体形式存在 ,菌体的破碎以高渗蔗糖溶液进行预处理后 ,再超声破碎效果最好 ;包涵体的洗涤则先用Triton X 10 0洗 2次 ,再用 8mol/L尿素洗涤一次效果更优 ;最佳变性条件为在 7mol/L盐酸胍中加入0 .0 6 5mmol/L的DTT和 0 .2mol/L的盐酸精氨酸 ;最佳复性条件为在 10℃复性保持 2 4h ,蛋白浓度保持在 30～80 μg/ml,并需加入 0 .2mol/L盐酸精氨酸 ;利用谷胱甘肽的氧化还原法 ,当氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的浓度比在 2∶1时所获得的活性成分得率最高 ;利用强弱离子交换结合的方法能获得纯度为 95 %的目的蛋白 ,所得融合蛋白可与IL 6及PEA抗体相结合并能特异性地杀伤高表达IL 6R的人多发性骨髓瘤细胞。结论 :本研究获得重组IL 6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白包涵体的分离、变性与复性条件和一条能获得大量高纯度该融合蛋白的纯化路线。