IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的 :构建含人IL 2cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3.1IL 2 /Fc ,并在真核细胞中表达 ,以期用于乙型肝炎病毒 (HBV)DNA疫苗的研究。 方法 :应用重叠延伸剪切技术 (SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL 2 /Fc,回收后克隆到中间 pGEM TEasyTA克隆载体 ,得到合适的酶切位点后 ,用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3.1中 ,得到真核重组载体 pcDNA 3.1IL 2 /Fc。然后用脂质体法转染SP2 / 0细胞。 结果 :对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析 ,证明连接正确 ;经ELISA检测证实 ,该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。 结论 :成功构建了真核表达载体 pcDNA 3.1IL 2 /Fc ,并在SP2 / 0细胞中有效表达。

串联IL-2的犬瘟热病毒F-H融合基因重组乳酸杆菌的构建与表达

为了研发犬瘟热乳酸杆菌载体疫苗,更好地预防犬瘟热,试验采用重叠延伸PCR(SOEPCR)技术扩增IL2-F-H融合基因,将IL2-F-H融合基因亚克隆至穿梭载体pSIP409上,构建pSIP-IL2-F-H重组表达载体,并电转化至植物乳杆菌NC8感受态细胞中,构建串联水貂白细胞介素-2(IL-2)的犬瘟热病毒(CDV)F-H融合基因重组乳酸杆菌;利用SDS-PAGE和Western-blot检测IL2-F-H融合蛋白的表达情况。检测表明,重组乳酸杆菌表达了分子量约为80.16kDa的IL2-F-H融合蛋白,且该融合蛋白能与CDV抗体发生反应,具有反应原性。

人IL-2/GM-CSF融合基因的克隆及序列测定

通过ＰＣＲ技术，对人ＩＬ２和ＧＭＣＳＦ基因分别改构，克隆了通过Ｐｒｏ（ＣＣＣ）连接臂相连的ＩＬ２／ＧＭＣＳＦ融合基因。经酶切鉴定和序列测定证实后，将上述融合基因克隆至原核表达载体ｐＬＹ４，为表达具有ＩＬ２，ＧＭＣＳＦ双功能活性的新型融合蛋白。

传染性法氏囊病病毒VP2/4/3-ChIL-2融合基因DNA疫苗免疫原性研究

应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,SOE),经3次PCR将传染性法氏囊病病毒(infectiousbursal disease virus,IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)基因和鸡白细胞介素2(Chicken IL-2,ChIL-2)基因进行融合,定向插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2和pCI-IL-2-VP2/4/3。将其制备成DNA疫苗,肌肉注射14日龄非免疫鸡,2周后加强免疫,定期测定鸡抗IBDV血清ELISA抗体效价及病毒中和抗体效价。加强免疫后3周用IBDV标准强毒株攻击,连续观察3天后全部扑杀,计算保护率及囊体比,并进行组织病理学检查。结果表明:1)融合基因重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3免疫后能明显增强IBDVDNA疫苗对强毒的攻击保护(保护率分别为83.3%、91.6%),显著高于pCI-VP2/4/3单独免疫对照组(58.3%);2)诱导产生的抗IBDV血清ELISA抗体效价明显增高(P<0.05),同时能提高DNA疫苗诱导产生的中和抗体效价(P<0.05);3)能显著促进鸡外周血液T淋巴细胞增殖反应。上述结果提示:IBDV VP2/4/3与ChIL-2基因融合后发挥了相互协同作用,ChIL-2产生了分子免疫佐剂效应;融合基因DNA疫苗能增强IBDV DNA疫苗的免疫原性,促进了机体特异性免疫应答。

羊口疮病毒B2L、F1L基因融合真核表达质粒诱导小鼠的免疫应答及IL-2对其作用影响的研究

为评价羊口疮病毒(OrfV)B2L、F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答及IL-2对其免疫作用的影响。本研究将构建的pVAX1-B2L-F1L真核质粒转染MDBK细胞后,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测B2L-F1L融合基因在MDBK细胞中的表达;将pVAX1-B2L-F1L、pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1空载体、生理盐水对照组KM系小鼠通过后腿肌肉注射的方式免疫,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ)、Th2型(IL-4、IL-6)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-B2L-F1L重组质粒能够在MDBK细胞中表达;pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体及IL-2和IFN-γ水平均显著高于pVAX1-B2L-F1L组;该联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6细胞因子水平与pVAX1-B2L-F1L组相比差异不显著(p>0.05);该联合免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L-F1L组(p<0.05)。由此表明,pVAX1-B2L-F1L能够诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫应答,联合pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能够促进Th1型细胞因子的分泌。本研究为OrfV基因工程疫苗的研制提供了参考依据。

Hsp65与IL-2融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答及保护力

目的研究Hsp65与hIL-2的融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法在大肠杆菌中诱导表达Hsp65与hIL-2的融合蛋白,通过Ni-NTA亲合柱纯化后的蛋白经鉴定后,与佐剂DDA和MPL联合免疫小鼠,连续免疫3次,每次间隔2周,最后一次免疫结束后两周,分离5只小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞增殖指数,IFN-γ和IL-2水平,以及特异性淋巴细胞杀伤功能,其余5只免疫小鼠用于MTB毒株攻击实验。结果获得融合蛋白可分别与抗Hsp65和抗hIL-2的单抗发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞被有效活化,诱导产生的-γIFN和IL-2的水平以及CTL杀伤功能均显著高于BCG和单纯Hsp65免疫组(P<0.05)。融合蛋白免疫组可有效抵抗MTB毒株攻击,脾脏细菌数显著减少(4.36±0.48),提供的保护力与BCG相当(4.30±0.53)。结论Hsp65与hIL-2的融合蛋白是一种有效的亚单位疫苗,可用于TB的预防。

日本血吸虫抗独特型抗体NP30重链6×CDR3/IL-2融合基因构建及表达

目的:构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区6×CDR3基因/IL-2融合基因,以观察其对动物的抗血吸虫感染保护作用。方法:通过PCR方法体外扩增NP30 6×V_HCDR3和IL-2基因,经测序后先后重组入原核表达质粒pET-28a(+)相应的位点上,将构建正确的6×V_HCDR3/IL-2-pET-28a(+)表达质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达。结果:构建的6×V_HCDR3/IL-2融合基因中,6×V_HCDR3和IL-2序列均正确,融合基因经IPTG诱导表达重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析分子质量约为30ku,表达量约占菌体总蛋白的20％。结论:成功构建并原核表达了NP30 6×V_HCDR3/IL-2融合基因。

IL-2/HBV PreS融合基因的克隆及序列测定

目的：获得ＩＬ２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合基因克隆，为表达ＩＬ２／ＨＢＶｐｒｅＳ融合蛋白奠定基础。方法：用ＰＣＲ方法从乙肝全序列中扩增ＨＢＶｐｒｅＳ基因片段，并克隆入带有ＩＬ２基因的ｐｌｙ５质粒中，挑出的阳性克隆再亚克隆到ｐＵＣ１８中进行序列测定。结果：基因全长９３０ｂｐ，编码３１０个氨基酸，序列内有起始码和终止码。结论：所克隆的基因为ＩＬ２与ＨＢＶｐｒｅＳ的融合基因。

IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达

构建含有传染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus,IBDV)VP2/4/3和鸡白细胞介素2(ChickenInterleukin2,ChIL2)融合基因的真核表达载体pCIVP2/4/3IL2、pCIIL2VP2/4/3,并在Vero细胞中进行表达.应用重叠延伸剪切技术(splicingbyoverlappingextension),分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3IL2、IL2VP2/4/3,定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCIVP2/4/3IL2、pCIIL2VP2/4/3,在脂质体介导下,分别转染Vero细胞.RTPCR检测证实导入的外源基因在Vero细胞中得到了转录;间接免疫荧光试验(IFA)和Westernblot检测证实重组质粒在Vero细胞中正确表达了插入的外源基因编码的融合蛋白,且表达的融合蛋白具有免疫反应性.重组真核表达载体pCIVP2/4/3IL2、pCIIL2VP2/4/3的成功构建及其在Vero细胞中的有效表达,为进一步探讨ChIL2作为分子免疫佐剂对IBDVDNA疫苗的特异性免疫增强作用奠定了基础.

共表达HIV-1CN与IL-2基因产物免疫鼠T淋巴细胞亚群的研究

目的 :研究细胞因子在机体免疫应答过程中的免疫佐剂效应。方法 :以表达中国流行株HIV lgag gp12 0基因的核酸疫苗质粒 pcDNAGP及共表达中国流行株HIV lgag gp12 0基因与Ⅱ 2基因的核酸疫苗质粒 pGPH 2免疫Balb/c鼠 ,用流式细胞仪测定 10 0 0 0个免疫鼠脾淋巴细胞中CD4+,CD8T细胞数及CD4+/CD8+比值。结果 :pGIL 2与pcDNAGP比较 ,pGIL 2免疫鼠CD4 和CD8T细胞数明显提高。结论 :在机体的免疫应答过程中 ,细胞因子IL

壳聚糖纳米颗粒包裹猪白细胞介素2和融合白细胞介素4/6基因对猪圆环病毒2型疫苗免疫的强化

目的探讨猪Sus scrofa domesticus白细胞介素2(IL-2)和融合白细胞介素4/6(IL-4/6)基因的共表达对仔猪免疫应答的影响,为进一步研制新型免疫调节剂来加强仔猪抵御断奶后多系统衰竭综合征奠定基础。方法将猪IL-2和IL-4/6融合基因的共表达重组质粒,用壳聚糖材料包裹制成纳米颗粒,记作VRIL-4/6-2-CS。将仔猪分为2组,分别肌肉注射VRIL-4/6-2-CS(实验组)和生理盐水(对照组),2组均同时接种猪圆环病毒2型(PCV-2)疫苗,在接种后的第0、7、14、28天采集血样并分析免疫变化。结果实验组仔猪血清中的IgG2a抗体数量和血液中CD4^+、CD8+~T淋巴细胞数量均显著高于对照组(P<0.05);同时,实验组仔猪的IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、TLRs(TLR-2,7)、STATs(STAT-1,2,3)基因表达水平也显著高于对照组(P<0.05)。尽管2组之间PCV-2特异性抗体的含量差异无统计学意义,但是实验组仔猪的生长速率显著高于对照组(P<0.05)。结论 VRIL-4/6-2-CS能促进仔猪对PCV-2疫苗的免疫应答,是一种安全有效的免疫佐剂。

重组鸡白介素2和干扰素α融合蛋白的表达及生物学活性的检测

为表达鸡的白介素-2(Interleukin-2,IL-2)和干扰素α(Interferon-α,IFN-α)融合蛋白,并进一步探究融合蛋白的生物学活性,本试验根据GenBank登录的鸡IL-2和IFN-α基因序列,使用linker连接成为嵌合基因,合成pET-32a-rChIL-2-IFN-α原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达。通过MTT法检测重组融合蛋白促鸡外周血淋巴细胞(PBLC)增殖活性;通过细胞病变抑制法检测重组融合蛋白在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的抗病毒活性;通过RT-qPCR检测了融合蛋白对干扰素刺激基因和内源性干扰素的作用。结果表明,重组融合蛋白促PBLC增殖活性效果显著,在CEF上具有抗VSV活性;重组融合蛋白能够显著地上调CEF中5种干扰素刺激基因和内源性干扰素的mRNA转录水平。综上所述,本试验表达的重组融合蛋白具有促淋巴细胞增殖活性和抗病毒作用,试验结果为进一步探究融合蛋白在鸡体内的活性奠定了基础。

融合蛋白ABD-Fc-IL-2的真核表达及其生物学活性鉴定

目的 真核表达融合蛋白ABD-Fc-IL-2,并检测其生物学活性。方法 通过直接PCR及重叠延伸PCR法扩增目的基因SP-ABD-Fc-IL-2,连接至载体pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1/SP-ABD-Fc-IL-2。将重组质粒转染CHO-S细胞表达融合蛋白ABD-Fc-IL-2,并进行Protein A beads亲和层析纯化。Western blot法检测纯化融合蛋白的特异性,CTLL-2/MTT细胞增殖比色法测定其生物学活性,pull down/Western blot法检测融合蛋白中链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(albumin-binding domain,ABD)与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的相互作用。结果重组质粒pcDNA3.1/SP-ABD-Fc-IL-2经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。纯化融合蛋白ABD-Fc-IL-2纯度达90%,可与鼠抗IL-2单克隆抗体发生特异性结合,生物学活性为3.29×108IU/mL,融合蛋白中ABD与HSA可相互结合。结论 真核表达的融合蛋白ABD-Fc-IL-2具有较高的生物学活性,可促进CTLL-2细胞增殖,且保持了ABD片段与HSA结合的能力。

禽IL-2与传染性法氏囊VP2融合蛋白免疫学特性

为研究禽细胞因子IL-2与IBDV主要保护性抗原VP2基因融合蛋白的免疫学特性,将重组的rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡,通过IBDV-VP2 ELISA抗体效价、抗体亚型(IgG1和IgG2a)、淋巴细胞增殖、INF-γ和IL-4细胞因子的分泌水平、中和抗体以及动物攻毒试验检测评价其对鸡体免疫水平的影响。抗体滴度测定和淋巴细胞增殖试验结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫鸡体的体液和细胞免疫应答水平均明显高于单独的VP2蛋白免疫组。抗体亚型测定结果显示,rVP2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。细胞因子ELISA试验结果表明rVP2-IL-2融合蛋白能有效平衡Th1(γ-IFN)和Th2(IL-4)类型的细胞免疫反应。动物攻毒试验rVp2-IL-2融合蛋白免疫组鸡体获得了85%的保护率,表明构建的rVP2-IL-2融合蛋白对IBDV的攻击具有较好的免疫保护作用。本研究为进一步研制IBD高效的基因工程疫苗奠定了基础。

IL－6／IL－2融合蛋白（CH925）在大肠杆菌中高效表达

本文设计重组ＩＬ－６／ＩＬ－２的嵌合基因，选取合适的中间接头，并对ＩＬ－６及ＩＬ－２功能区基因进行修饰，运用ＰＣＲ拼接技术，克隆了中间接头与ＩＬ－２功能区基因。再与ＩＬ－６基因连接后转化Ｅ．ｃｏｌｉ，经序列分析证实获得ＩＬ－６／ＩＬ－２融合蛋白表达载体ＰＦＩＬ－６／２经诱导表达ＩＬ－６／ＩＬ－２（ＣＨ９２５）占菌体总蛋白３２％，融合蛋白分子量约为３７ｋＤ，分别以ＩＬ－６及ＩＬ－２依赖株测得融合蛋白具有双功能生物活性。

猪IL-2对pcDNA-E39.VP2真核共表达质粒免疫原性的影响

为了研究猪IL-2基因的真核质粒和融合基因形式对pcDNA-E39.VP2真核共表达质粒的免疫增强作用,分别将IL-2基因插入pcDNA3.1(+)和pcDNA-E39.VP2(已构建)中构建重组质粒pcDNA-IL2和pcDNA-IL2-E39.VP2。将真核质粒pcDNA-IL2-E39.VP2免疫小鼠,另外,将pcDNA-IL2分别先于和后于pcDNA-E39.VP2 3d免疫小鼠,同时设pcDNA-E39.VP2对照组。对免疫小鼠进行PPV(JEV)抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖功能和外周血T淋巴细胞亚群变化的检测。结果显示,1周后,pcDNA-IL2-E39.VP2免疫组和pcDNA-IL2后于pcDNA-E39.VP注射的免疫组JEV/PPV抗体水平和脾脏淋巴细胞增殖活性显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组,pcDNA-IL2先于pcDNA-E39.VP注射的免疫组仅在第5周显著(P<0.05)高于对照组;各组(除对照组外)CD8+值差异不显著(P>0.05),CD4+、CD4/CD8值都高于对照组,其中pcDNA-IL2-E39.VP2免疫组与对照组差异极显著(P<0.01)。结果表明,IL-2能增强pcDNA-E39.VP诱导小鼠的免疫能力,且以融合基因形式构建的真核质粒免疫增强效果最明显。