伊丽莎白安格斯三角梅转录组的SSR、SNP和InDel特征分析

【目的】基于转录组测序数据分析伊丽莎白安格斯三角梅SSR、SNP和InDel位点特征,为开发三角梅分子标记、选育无刺或少刺品种、品种鉴定及亲缘关系分析提供理论依据。【方法】以伊丽莎白安格斯三角梅3个时期的枝刺和茎段为材料,对其进行转录组测序,采用Trinity对获得的高质量测序数据进行序列组装,利用MISA和GATK3对SSR、SNP和InDel进行特征分析。【结果】18个样本转录组测序平均获得45905982bpRawdata,质控过滤后获得45640193 bp Clean data,拼接后获得312812条转录本和144512条Unigenes,有54516个SSR位点分布于40820条Unigenes上,发生频率为28.25%,平均分布距离为2.67kb,包含1个以上SSR位点的Unigenes10269条,占Unigenes总数的4.25%。在重复基元类型中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复数量占优势,其中单核苷酸重复数量最多(39904个,占比73.20%),其次为二核苷酸重复(8169个,占比14.98%)和三核苷酸重复(5899个,占比10.82%),五核苷酸重复最少(31个,占比0.06%)。单核苷酸~六核苷酸重复类型共检测到98种重复基元,出现频率为0.01%~25.71%,其中出现频率最高的基元为A/T(37151个),占SSR位点总数的68.15%。SSR各类型重复基元的重复次数集中在5~23次,SSR序列的长度10~60bp,平均长度为20.38bp。共检测到231248个SNP位点和99580个InDel位点,其中SNP位点平均分布距离为1.59 kb,InDel位点平均分布距离为0.68 kb,且均以含1个位点的Unigenes数量最多,Unigenes数量随SNP和InDel位点数量的增加而逐渐减少。【结论】伊丽莎白安格斯三角梅转录组中SSR位点数量多、类型丰富,分布特征明显,可用于开发大量SSR标记,SNP和InDel位点发生频率低于模式植物,有待深度挖掘。

基于简化基因组测序筛选白斑狗鱼耐热性状关联的InDel标记

为了能给白斑狗鱼耐高温性状的改良提供有效的分子标记,本研究基于白斑狗鱼热敏感组(109尾)和耐高温组(103尾)进行简化基因组测序,对25个染色体中的InDel标记,以前两个PCA为协变量,利用MLM模型(Masked Language Mode)与白斑狗鱼的耐热性状进行了关联分析。结果显示,大部分InDel分布在内含子(63.69%),外显子分布的InDel位点较少(1.30%)。通过GWAS分析,发现5个位点与白斑狗鱼耐热性状显著关联,分别位于safb基因、未知基因LOC117593903和CLSTN2基因内含子中。其中9N del、4N del-1和4N del-2三个InDel位点均位于CLSTN2基因第3内含子,这3个位点在212尾个体中基因型分布高度连锁。本研究中发现的5个InDel突变可能会对白斑狗鱼的耐热性状产生显著的影响,可作为白斑狗鱼耐热性状改良的候选分子标记。进一步在验证群体中利用KASP技术对部分位点进行了验证。发现9N del位点DD基因型个体在热敏感组中占优势,DI基因型个体在耐高温组中占优势,与简化基因组测序结果基本一致。位于CLSTN2基因第2内含子的3个InDel位点可能影响CLSTN2基因的转录,该基因可能是白斑狗鱼耐高温性状相关的重要候选基因。研究结果为白斑狗鱼分子标记辅助育种提供了理论依据,为白斑狗鱼耐热性状的改良提供了候选分子标记。

基于转录组测序的花斑裸鲤SSR、SNP和InDel位点特征分析

为利用分子标记规模化开发与辅助花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)良种选育,以花斑裸鲤(2+龄)的鳃、肾脏和肝脏组织为材料,经总RNA提取和cDNA文库构建后采用Illumina Novaseq 2000平台进行转录组测序,并采用MISA和GATK3软件分析转录组的SSR、SNP和插入缺失标记(InDel)位点特征。结果表明:在486221条Unigenes序列中共发现了128727个SSR,出现频率为26.47%,平均每3.76 kb出现1个SSR;花斑裸鲤SSR包括6个重复类型,以单碱基和二碱基重复基元类型为主,分别占总SSR位点数的46.53%和42.45%,重复基元类型共77种,其中,A/T和AC/GT两种基元的出现频率最高,是花斑裸鲤SSR的优势重复基元;所有重复次数中出现次数最多的为5~15次,占所有SSR位点的87.52%;通过GATK3软件搜索得到399080个SNP位点,转换类型多于颠换类型,分别占总SNP的56.29%和43.71%,转换类型中A/G发生频率略高于C/T,而颠换类型中A/T发生频率最高,C/G发生频率最低;InDel分析显示,从花斑裸鲤转录组Unigenes中共筛选出254065个InDel位点,平均每1903 bp出现1个InDel位点,且SNP位点和InDel位点均以含1个位点的Unigenes数最多。研究表明,花斑裸鲤转录组中SSR、SNP和InDel位点非常丰富,这些位点对花斑裸鲤种质资源鉴定、种群遗传学研究及保护管理具有重要价值。

利用InDel标记鉴定不同橘柚品种

【目的】橘柚(tangelo)是一类含有橘(mandarin,Citrus reticulata Blanco)和柚[pummelo,C.maxima(Burm.)Merr.]血统的杂种柑橘。旨在挖掘能快速有效区分和鉴定不同橘柚品种的插入缺失(InDel)分子标记。【方法】利用第二代测序技术对两种橘柚(阳光1号和阳光2号)及其亲本(爱媛28号和春香)进行全基因组重测序,通过生物信息学分析和琼脂糖凝胶电泳检测,挖掘、筛选和确定大于30 bp或小于-30 bp的InDel标记,使用这些标记鉴定和区分10个不同橘柚品种,并对共51份种质资源进行基因分型及遗传多样性分析。【结果】在4个柑橘品种的基因组共鉴定到607376个InDel位点,产生657414种变异方式,并进一步筛选出48个大于30 bp或小于-30 bp的InDel标记。他们适用于普通琼脂糖凝胶电泳检测,操作简单,省力省时,成本低。这些InDel标记能够对10个橘柚品种进行基因分型,区别和鉴定不同橘柚品种,在51份种质资源中具有遗传多样性,其中I3_744、I7_170、I8_516、I8_533、I9_669等InDel标记具有高多态信息含量(PIC)和期望杂合度(He)及低最大等位基因频率(MAF)的特点。基于这48个InDel标记基因分型的主坐标分析(PCoA)展示了51份种质资源的遗传距离,他们在PCoA二维散点图中的分布与已知的柑橘类型划分总体一致。【结论】发掘的48个适合普通琼脂糖电泳检测的InDel标记能准确快速区分和鉴定不同橘柚品种,也有助于对柑橘作物的遗传多样性和群体进行分类分析。

基于RAD-seq的菜心InDel标记开发及应用

【目的】开发多态性丰富的的InDel分子标记,为菜心育种提供研究基础。【方法】以Chiifu-401-42的基因组序列为模板,利用4份菜心材料的RAD-seq重测序数据,在全基因组范围内鉴定InDel位点。利用生物信息学方法筛选4份菜心材料间具有潜在多态性的InDel位点,挑选分布于10条染色体的80个InDel位点设计引物,对55份菜心种质材料进行遗传多样评价。【结果】通过与参考基因组序列比对,在4份菜心材料的重测序数据中共鉴定出84510个InDel位点,其中插入/缺失长度大于5 bp的3609个InDel位点在4份菜心材料间具有潜在多态性。挑选80个InDel位点进行PCR扩增验证,58个(72.5%)在4份测序样品中具有多态性,在55份菜心种质材料中检测到133个等位位点,多态性信息含量(PIC)为0.263~0.618,平均值为0.443。基于InDel标记的检测结果可知,55份菜心种质的遗传相似系数在0.366~0.756,平均值为0.570;在遗传相似系数为0.564时55份菜心种质被分为4个类群,但各类群间的耐热性没有明显差异。【结论】本研究开发的InDel标记具有良好的多态性,能有效地揭示不同菜心种质材料间的遗传距离,可为菜心遗传种质分析、新品种选育等方面提供可利用的标记信息。

南瓜叶黄素基因紧密连锁的InDel分子标记开发及应用

本研究旨在开发与中国南瓜(Cucurbita moschata Duch.)叶黄素含量的数量性状基因座(Quantitative trait locus,QTL)紧密连锁且实用性强的分子标记,以加速南瓜的育种进程。前期在F_(2)代群体中定位到与叶黄素含量紧密连锁的主效QTL位点qlut11-a,在其两侧翼分子标记R1_38695和R2_55819之间开发了8对InDel分子标记。通过对F_(2)代群体及部分高代(F_(8)代)重组自交系株系进行基因型和叶黄素表型分析,明确了InDel分子标记G005310和G005670可有效筛选高叶黄素含量和低叶黄素含量材料,并在近等基因系构建中证实了其能用于创制高叶黄素含量的南瓜种质,BC5F1果实中的最高叶黄素含量约是低叶黄素含量亲本果实含量的2.8倍,且占高叶黄素含量亲本果实的96%。本研究结果为加速南瓜高叶黄素含量种质育种进程提供了更实用的分子标记。

性状鉴别联合InDel标记检测快速鉴定柑桔品种

品种鉴定是植物品种保护的前提。基于表型性状的DUS测试是受国际认可和具有法律依据的鉴定方法,但对果树开展完整的DUS测试,往往面临测试周期长和近似品种选择困难的挑战。基于分子标记的检测能准确揭示品种的遗传特征,但很难成功鉴定部分芽变、回交、高世代分离选种等育种方式获得的品种。根据《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南柑桔(NY/T 2435—2013)》的柑桔性状表,对5个测试材料(未知柑桔品种)进行部分(101个)性状鉴别,结果表明它们之间无明显性状差异。与国家柑桔种质资源圃(重庆)1900份柑桔种质资源的性状数据进行比对,发现测试材料与无核金诺(Citrus reticulata Blanco‘KinnowLS’)在1个性状(果实质量)上有1个代码值的差异,与091无核沃柑(C.reticulata Blanco‘091 Seedless Orah’)在4个性状(果实质量、果面主色、果面油胞凹凸、果汁含酸量)上分别有1~2个代码值的差异,由此确认091无核沃柑和无核金诺为测试材料的近似品种。进一步利用33个适用于琼脂糖凝胶电泳检测InDel标记进行分子检测,结果表明5个测试材料之间无位点差异,测试材料与无核金诺有0个位点的差异,与091无核沃柑有12个位点的差异。综合两种方法所得结果,5个测试材料被鉴定为无核金诺。性状鉴别联合InDel标记检测是准确、快速鉴定未知柑桔品种的有效方案。

蜂糖李种质鉴定中孢粉学与InDel标记的应用

【目的】寻找能够特异性地区分蜂糖李种质和其他李种质,以及蜂糖李中的不同品系(黄皮、青皮和一点红)的鉴定方法。【方法】选择蜂糖李中的3个品系(黄皮、青皮和一点红)及其他9个李种质作为研究对象,利用扫描电子显微镜(SEM)观察花粉形态并进行聚类分析,同时结合重测序数据进行分子标记开发,并利用21份其他李种质对分子标记的准确性进行验证。【结果】扫描电镜结果表明,蜂糖李与四月李、三月李在花粉形态上存在显著差异,而一点红蜂糖李与其他蜂糖李相比在花粉外壁纹饰上也存在一定差异。在分子标记开发方面,筛选出2对表现稳定的InDel分子标记,联合使用能够将蜂糖李与其他21份李种质有效区分,同时还筛选出一对InDel分子标记,可用于区分蜂糖李中的3个品系。【结论】研究结果为蜂糖李的种质鉴定提供了重要的孢粉学和分子标记依据,有望对蜂糖李产业的标准化与品质提升提供帮助。

萝卜SNP和InDel分子标记开发及与表型性状关联分析

为了挖掘与萝卜表型性状显著相关的分子标记,对60份萝卜的14个表型数据进行鉴定,筛选出具有多态性的分子标记29个(其中12个SNP标记和17个InDel标记)进行遗传多样性分析,并利用TASSEL5.0软件的广义线性模型(general linear mode, GLM)对萝卜的14个表型数据进行关联分析。研究结果表明,29个分子标记的等位基因(Na)数范围在2~3个,平均为2.14个;主等位基因频率(MAF)为0.53~0.94个,平均为0.68个;每个标记的期望杂合度(He)范围为0.12~0.93,平均为0.63。每个位点的多态性信息含量(PIC)值范围在0.11~0.37,平均为0.32;在12个表型性状中关联到17个显著相关的分子标记位点(其中7个SNP标记和10个InDel标记)(P≤0.01),贡献率在7.24%~23.25%。

基于InDel标记分析305份中国甘薯登记品种遗传多样性

对甘薯育成品种进行亲缘关系评价,是了解其遗传背景并有效利用种质资源的重要前提。利用本课题组前期开发的23对InDel引物对305份中国甘薯登记品种进行基因型分析,共扩增出56个条带,其中53个条带具有多态性,多态率达94.6%。多态信息量(PIC)、Nei′s遗传多样性指数(H)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的平均值分别为0.4098、0.4451、0.6003、0.4460。群体结构分析表明,群体数在K=2时ΔK达到最大值,K=4时有个小高峰;北方薯区和长江流域薯区在2个组群内均匀分布,南方薯区大部分(72.97%)汇聚在组群2。主坐标分析(PCoA)中南方薯区有部分汇聚,整体没有划分出明显的簇群。聚类结果将群体划分为4个主要类群,北方薯区和长江流域薯区的品种在类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中均匀分布,南方薯区主要(77.03%)集中于类群IV,这一聚类结果与群体结构研究、主坐标分析基本一致。通过系谱分析筛选出登记品种的13个主要亲本材料,各育种单位存在重复利用亲本进行正反交培育的情况。本研究将分子标记结果与系谱信息相结合,初步表明中国甘薯登记品种的亲缘关系较近,遗传背景狭窄,为甘薯的种质创新、新品种选育提供参考。

基于InDel标记的长杂谷2922杂交种纯度鉴定

为了鉴定谷子杂交种长杂谷2922的纯度,本研究从11个候选InDel标记中筛选出在长杂谷2922及其双亲之间具有多态性的InDel标记Re2632,利用Re2632对长杂谷2922进行分子标记鉴定,并喷施除草剂进行验证。分子鉴定结果显示,杂交种纯度在20.83%~44.68%之间,平均纯度为33.72%。除草剂鉴定结果显示,杂交种纯度在18.32%~50.60%之间,平均纯度为32.59%。t测验结果显示,2种方法鉴定结果无显著差异,表明Re2632可以作为长杂谷2922分子鉴定的标记。

平菇基因组InDel标记开发及杂交菌株遗传多样性分析

以1株平菇白色变异菌株以及黑色出发菌株为试验材料,采用全基因组重测序技术对两个菌株进行重测序,针对InDel变异位点设计17对引物对两个菌株的孢子单核菌株及杂交菌株进行遗传多样性分析。结果表明:重测序获得平菇白色变异菌株1 763 Mb高质量数据,平菇黑色出发菌株1 779 Mb高质量数据,在平菇白色变异菌株检测到331 099个InDel变异位点,在平菇黑色出发菌株中检测到339 682个InDel变异位点。随机选择InDel变异位点并设计引物进行PCR扩增试验,最终选择17对引物对变异菌株的单核菌株以及杂交菌株进行PCR扩增,研究其遗传多样性;结果 17对引物中P4、P7、P8、P9、P14菌株具有明显的多态性。进一步对12个平菇杂交菌株进行扩增,共扩增出30条清晰条带,其中扩增条带最多的引物是P9菌株,共扩增出9条条带,扩增引物最少是P14菌株,扩增出3条条带,多态性位点占66%。用5对引物对12份材料进行遗传多样性分析,发现平菇P9菌株扩增条带中多数材料均能在760 bp处扩增出多态性条带。

利用InDel标记鉴定典湖1号杂交种纯度

典湖1号是宁波微萌种业有限公司育成的青梗菜新品种,但种子纯度鉴定速度限制了该品种的推广。为实现对该品种杂交种纯度的高通量快速鉴定,在典湖1号父母本(父本EPG-194,母本EPG-168)基因组重测序的基础上开发用于纯度检测的InDel标记。试验以典湖1号及其父母本DNA样品为材料筛选到亲本带型互补、扩增条带清晰和分离速度快的引物D1-7,并用该引物检测田间典湖1号F_(1)群体(EpG-194×EpG-168群体400株,EpG-168×EpG-194群体400株)。试验中,引物D1-7的分子检测结果显示,EpG-194×EpG-168群体和EpG-168×EpG-194群体分别存在非F_(1)杂株146和32株,田间表型鉴定发现EpG-194×EpG-168群体和EpG-168×EpG-194群体分别存在非F_(1)杂株146和32株,对比后二者鉴定的800株单株结果完全一致。结果表明,InDel分子标记引物D1-7准确鉴定了典湖1号群体中混杂的母本自交种,为之后典湖1号杂交种纯度的快速鉴定奠定了基础。

沙田柚×枳杂交群体创建与InDel标记鉴定

【目的】以沙田柚为母本,枳为父本杂交,以期获得具有枳优良特性并与柚嫁接亲和性强的砧木品种。【方法】2018—2021年在广西阳朔进行常规有性杂交,共采集274个果实,已播种70个果实的种子获得1830株F1代植株,结合形态学与InDel分子标记对F1代进行鉴定。【结果】授粉果实种子数量及形态与母本沙田柚相似,数量多,平均达123粒,但较母本大并稍圆;含饱满种子与败育种子,饱满种子∶败育种子≈1∶2.64;其中28个杂交果实繁育群体的叶片均为三出复叶,计551株;42个杂交果实繁育群体的叶片均为单身复叶,计1279株,通过InDel标记鉴定出杂种苗698株。【结论】沙田柚×枳的杂交后代叶型差异较大,需结合InDel标记进行精准鉴定。

利用InDel标记筛选多胚山金柑珠心苗后代

【目的】柑橘的遗传转化通常以实生苗上胚轴为外植体。作为基因组高度杂合的无融合生殖物种,柑橘多胚种子中常含有一定比例的、因遗传重组较亲本表现出遗传背景差异的有性后代,从实生群体中筛选无性后代进行遗传转化实验可有效保证外植体材料遗传背景的一致性及后续相关研究的科学性和可靠性。基于此,开发分子标记用于快速准确筛选柑橘短童期种质——多胚山金柑(Fortunella hindsii)子代中的珠心胚实生苗,以期为优化完善山金柑遗传转化体系提供基础。【方法】利用母本山金柑材料DB02重测序数据进行InDel标记的挖掘,筛选出可以区分有性后代和无性后代的InDel标记,通过琼脂糖凝胶电泳对DB02系山金柑的子代幼苗进行鉴定。【结果】开发出7对可以区分DB02系山金柑种子中有性和无性后代的InDel杂合位点标记(InDel1~InDel7),基于这些标记进一步研究,发现土播幼苗和试管幼苗中的珠心苗比例分别为87.5%和74.2%。【结论】利用InDel标记可以成功筛选出与DB02系山金柑遗传背景一致的无性克隆后代,进一步完善了山金柑实生苗上胚轴遗传转化体系。

基于SNP和InDel标记的余甘子群体遗传分析

【目的】采用高通量测序技术解析余甘子种质资源的群体遗传结构和遗传多样性,为余甘子系统分类、遗传资源创新利用提供理论基础。【方法】利用ddRADseq技术对112份余甘子种质资源进行高通量简化基因组测序,利用Cutadapt和Trimmomatic软件对原始数据进行过滤,筛选得到高质量测序数据;使用MUNEAK软件进行多态性标记发掘,基于获得的SNP和InDel标记,进行群体结构分析、主成分分析、系统发育分析及遗传多样性分析。【结果】余甘子测序样品共获得8934个SNP和InDel标记,群体结构分析将余甘子种质分为2个类群,类群划分与种质来源地相关,该结果与主成分分析和系统发育分析相一致。余甘子各种质间遗传距离为0.027~0.459,平均遗传距离为0.248;云南地区的余甘子种质的期望杂合度、观测杂合度及多态性信息含量值最高,依次为0.267、0.184及0.218;余甘子群体间的Fst在0.080~0.266之间,群体遗传分化程度中等偏高。【结论】该测序技术可有效地解析余甘子种质的群体结构和遗传多样性,为余甘子种质资源的鉴定评价、系统分类及遗传多样性研究提供参考。

基于核心InDel标记樱桃番茄种质资源的遗传多样性分析与应用

在樱桃番茄育种进程中,遗传多样性丰富的材料有利于进一步培育重要目标性状的品种。利用从鲜食番茄和加工番茄重测序中挖掘和筛选出的48对核心In Del标记对110份樱桃番茄自交系和12个樱桃番茄商业种进行遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建。结果表明,122份樱桃番茄材料田间表型呈现明显的遗传多样性;48对核心In Del标记在参试樱桃番茄材料中也表现良好的多态性,122份材料的遗传距离为0~0.886 cM,平均遗传距离为0.473 cM;聚类分析结果将122份材料划分为3个主要类群,其中110份自交系分散在不同类群中,且在粉贝贝、粉贝妮所属类群中分布最多。对利用自交系配制的420个F_1组合进行综合评价,发现10个入选组合中6个表现产量较好组合的遗传距离接近或大于平均值,表现一定的杂种优势。利用48对核心InDel标记构建了10个组合的亲本和12个商业种的清晰指纹图谱,可将上述材料完全区分。

InDel分子标记WC656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5VS纯合易位中的应用

簇毛麦是小麦品种改良重要的遗传资源,其5VS上含有硬度基因Dina/Dinb、抗白粉病基因Pm55和抗条锈病基因Yr5V,创制普通小麦-簇毛麦5VS易位系新种质,对于高效利用5VS上的有益基因进行小麦品种遗传改良具有重要意义。为了便于鉴别普通小麦-簇毛麦5VS纯合易位,本研究以mInDel软件分析普通小麦中国春基因组序列,开发了小麦第5同源群短臂的InDel特异分子标记WC656,对小麦品种以及普通小麦-簇毛麦5VS.5AL和5VS.5DL易位系及其衍生后代进行PCR扩增,根据扩增片段大小来区分5AS、5BS、5DS染色体臂以及5VS易位系。结果表明,在21个普通小麦品种、小麦-簇毛麦5VS回交F 2代中杂合易位单株,均扩增出379 bp(5AS)、471 bp(5BS)、422 bp(5DS)3条带。在T5VS.5AL高代品系、回交F 2代中纯合易位单株扩增出471 bp(5BS)、422 bp(5DS)2条带,379 bp(5AS)条带缺失。T5VS.5DL高代品系、回交F 2代中纯合易位单株扩增出379 bp(5AS)、471 bp(5BS)2条带,422 bp(5DS)条带缺失。WC656鉴别的5VS纯合易位结果与顺序FISH-GISH分析结果一致。T5VS.5AL、T5VS.5DL具有抗白粉病、籽粒硬度指数低等优良特性。因此,利用InDel分子标记WC656可以鉴别普通小麦-簇毛麦T5VS.5AL、T5VS.5DL衍生后代中的纯合易位,PCR扩增实验操作相对简便,可以为分子标记辅助选育携有5VS纯合易位的软质弱筋小麦提供帮助。

利用InDel标记划分玉米自交系的杂种优势群

利用北京市农林科学院玉米研究中心构建的多重扩增靶向捕获测序基因分型InDel标记组合,对102份玉米自交系进行InDel标记的基因分型。利用UPGMA方法将102份玉米自交系划分为6个杂种优势群包括瑞德群、塘四平头、兰卡斯特群、旅大红骨群、P群及热带和亚热带混血群。类群分析结果与现有的杂种群和已知谱系高度一致。

樱桃番茄美小红杂交种子纯度的InDel标记鉴定

为准确高效地鉴定番茄杂交种纯度,以美小红及其父母本为试验材料,从48对核心InDel标记中挑选3对在双亲中具有明显差异且条带清晰的InDel标记,对100个美小红单株进行纯度检测,并与田间调查结果相比较。结果表明,在3对分子标记检测结果中,100个杂交种单株中有98个表现为父母本双亲互补的共显性条带,2个单株表现为母本类型的条带,种子纯度为98%,上述结果与大田鉴定结果高度一致。因此,利用该方法可准确高效地检测杂交种纯度,节约检测成本,缩短检测时间。