IPTG诱导浓度对重组李氏溶血素表达的影响

单核增生性李斯特杆菌(L.monocytogenes)的主要毒力基因hly与融合表达载体pGEX-6P-1相连,转化大肠杆菌BL-21。在摇床条件下,利用异丙基硫代-βD-半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,分析比较不同IPTG浓度对表达产物的影响,以确定最佳的IPTG浓度。结果表明,在装有LB培养基的三角瓶中,在37℃情况下,当IPTG终浓度为0.6mmol.L-1时,hly基因的表达量最大。当再增加IPTG的浓度时,抑制重组蛋白的表达。Western-blot分析,所表达的蛋白具有抗原特异性。实验为重组李氏溶血素的工业化生产提供依据。

IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大。最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大。

IPTG添加时机对大肠杆菌产α-酮基丁酸的影响

探究IPTG不同添加时间对大肠杆菌Escherichia coli THRD/pWSK29-ilvA发酵生产α-酮基丁酸菌体生长、产酸、代谢副产物和耗糖的影响.摇瓶发酵结果表明:在菌体处于对数生长中后期,菌体OD600值为10~15时,添加IPTG进行诱导,菌体生物量相对较高为6.5g/L,α-酮基丁酸积累量最高达到16g/L,同时糖酸转化率较其他诱导时间高,且副产物乙酸含量明显降低.利用7.5L发酵罐对此诱导条件进行发酵验证,α-酮基丁酸质量浓度为22g/L,高于已有报道中8g/L的生产水平.

猪流行性腹泻病毒重组M蛋白膜外区原核表达IPTG最佳诱导条件的确定

将猪流行性腹泻病毒编码M蛋白囊膜外区的基因片段(M’)亚克隆后,构建重组质粒pGEX-6p-M’并转化大肠杆菌以不同浓度IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,在以浓度为0.3～0.5mmol/L的IPTG诱导6h条件下pGEX-6p-M’获得了最高效表达。

乳糖代替IPTG诱导己糖激酶在大肠杆菌中的表达

构建了己糖激酶GLK高效表达的工程菌株BL21(DE3)/pET-glk,考察了乳糖代替IPTG诱导己糖激酶GLK在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性。实验结果表明,工程菌对数生长中期(OD_(600)约为1.0)添加终浓度为10g/L的乳糖于25℃的条件下诱导6h能获得最大量的目的蛋白和菌体量,目的蛋白表达量占总蛋白的30.45%,与IPTG诱导条件下的31.12%无明显差异。同时,乳糖诱导后收获的菌体量高于IPTG诱导,显示出了乳糖同样是一种T7启动子的廉价高效诱导剂,可以代替昂贵的IPTG用于己糖激酶GLK的规模化发酵,也为其他重组蛋白的生产提供了有益的参考和借鉴。

乳糖代替IPTG诱导重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达

研究以乳糖代替IPTG作为诱导剂诱导重组人胸腺肽α1表达的可行性,对乳糖诱导的时机、乳糖浓度、诱导持续时间以及其它诱导条件进行研究,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果表明,乳糖能有效地诱导重组人胸腺肽α1的表达,并且目的蛋白的表达量略高于IPTG的诱导量。

IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达

研究异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达的效果。在利用IPTG和乳糖分别作为诱导剂对右旋糖酐蔗糖酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET28-dexYG进行诱导表达的基础上,尝试将此两种诱导剂联合使用,在降低成本的同时获得较好的表达效果。在获得最佳培养基的基础上,考察菌体IPTG与乳糖的联合加入量、菌体浓度、诱导时间对右旋糖酐蔗糖酶表达的影响。在菌浓(OD600 nm)达到3.0时,加入0.1 mmol/L IPTG 95μL+2.5 g/L乳糖,25℃混合诱导培养4 h,酶活力最高,达到40.44 U/mL。IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达可行。

G—CSF工程菌在IPTG和乳糖诱导下表达结果比较

用5mM IPTG 或30mM 乳糖诱导 G—CSF 工程菌表达,其结果基本一致,工业生产中,采用乳糖作诱导剂,显著地降低了生产成本。

乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达

本文考察了乳糖代替IPTG诱导三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性,分别对用乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式进行优化并与IPTG诱导的差异等方面进行了比较分析,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果表明,在工程菌对数生长中期(OD600约为0.8)添加终浓度为0.4mmol/L的乳糖诱导6h的条件下能获得最大量的目的蛋白和菌体量。由于乳糖可以作为碳源被菌体利用,分批添加乳糖效果优于一次性添加。乳糖诱导条件下目的蛋白表达量占总蛋白的35.62%,与IPTG诱导条件下的35.03%无明显差异。乳糖诱导后外源蛋白的表达时间有所滞后,但收获的菌体量高于IPTG诱导,显示出了乳糖同样是一种T7启动子的廉价高效诱导剂,可以代替昂贵的IPTG用于脱色酶TpmD的规模化发酵,同时也为其他重组蛋白的生产提供了有益的参考和借鉴。

高亲和PDGFβR多肽修饰的截短型TβRⅡ的可溶性表达条件优化

目的 探讨高亲和血小板衍生生长因子受体(Platelet derived growth factor-β receptor, PDGFβR)多肽ZPDGFβR修饰的截短型转化生长因子β Ⅱ型受体(Truncated transforming growth factor-β receptor type Ⅱ,tTβRⅡ)的重组蛋白(Z-tTβRⅡ)最佳可溶性表达的条件。方法 将含有原核表达质粒pET28/Z-tTβRⅡ的阳性大肠杆菌(Rossta/pET28-Z-tTβRⅡ)置于LB培养基中培养,接着加入不同浓度的IPTG,使其终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8 mmo/L,应用SDS-PAGE技术分析在不同温度时间下(16℃、18 h, 20℃、20 h和37℃、6 h)重组蛋白Z-tTβRⅡ的可溶性表达。结果 Z-tTβRⅡ在16℃、18 h下,0.8 mmol/L IPTG时,诱导后全菌表达约22%和诱导后上清表达约13%;Z-tTβRⅡ在20℃、20 h下,诱导后全菌0.8 mmol/L IPTG时表达约23%,诱导后上清0.2 mmol/L IPTG时表达约14%;Z-tTβRⅡ在37℃、6 h下,0.2 mmol/L IPTG时,诱导后全菌约30%和诱导后上清约20%。结论 Z-tTβRⅡ蛋白最佳表达条件为37℃、6 h、IPTG浓度为0.2 mmo/L。

重组大肠杆菌高密度发酵中乳糖诱导表达hBLyS

研究了乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达重组人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS).结果表明,乳糖不仅能够作为诱导剂诱导外源蛋白的合成,而且能作为碳源促进菌体的生长.通过对诱导条件进行优化,乳糖诱导外源蛋白的表达量约占菌体总蛋白的14.3%,达到IPTG的诱导水平(26%)的55%.在5L发酵罐中hBLyS的表达量达到16%,同时生物量OD600=62.

RGD-蜘蛛拖丝蛋白聚合物的生物合成与纯化

蜘蛛拖丝是自然界性能最好的蛋白质纤维之一 ,其独特的机械性能 ,良好的生物相容性和缓慢的可降解性 ,作为生物材料在组织工程领域有着潜在的应用前景。本文根据蜘蛛拖丝蛋白序列高度重复的特点 ,引入与细胞黏附有关的精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 (RGD)三肽 ,化学合成RGD 蜘蛛拖丝蛋白基因单体 ,通过头尾相连倍加构建策略 ,首次得到RGD 蜘蛛拖丝蛋白基因 8聚体和 16聚体。分别将这两种多聚体与原核高效表达载体 pET 30a(+)连接 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) pLysS ,用IPTG诱导表达。SDS PAGE图谱显示表达产物分子量分别为 35KD和 6 0KD ,与理论值基本相吻合 ;蛋白质印迹分析这两种表达产物均显示特异性。文中对表达产物的纯化方法进行了初步的摸索。

用乳糖作为诱导剂进行重组蛋白的表达

目的研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达。方法以表达SARS刺突蛋白片段的工程菌BL21(DE3)/S为模型菌株,采用葡萄糖、甘油作为碳源,不同浓度的乳糖和异乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。在40L发酵罐中进行验证。结果在摇瓶实验中,乳糖浓度大于0.5mmol/L即可以很好地诱导目的蛋白的表达,表达量与IPTG诱导时相当;葡萄糖的存在可以抑制乳糖,但不能抑制异乳糖的诱导作用;使用甘油作为碳源,既不抑制乳糖,也不抑制异乳糖的诱导作用。在发酵罐实验中,诱导初始阶段葡糖糖的存在抑制乳糖的诱导作用。结论在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导阶段应采用非葡萄糖碳源。

几丁质酶基因表达载体pET-chiB的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达(英文)

几丁质酶在降解几丁质的过程中起着重要作用,目前人们已从不同微生物体中分离并克隆出了多种几丁质酶基因。实验以pET-22b(+)为载体,利用从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)克隆出的chiB基因,构建出原核生物表达载体pET-chiB。通过表达载体pET-chiB的诱导表达,实验结果显示该基因表达的蛋白为可溶性蛋白,其分子量约为52 kD。利用不同参数包括时间、IPTG浓度和温度诱导表达载体pET-chiB表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示其诱导表达的最佳参数分别为4 h,0.5 mmol/L和25℃。这些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶工程菌生产奠定了良好的工作基础。

乳糖诱导D塔格糖3差向异构酶基因在大肠杆菌中的表达

以D-塔格糖3-差向异构酶高效表达菌株BL21(DE3)/pET22b-cbdte为研究对象,考察乳糖作为诱导剂诱导D-塔格糖3-差向异构酶在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性。在摇瓶发酵条件下,从诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等四个方面,研究诱导条件对目的蛋白表达的影响。结果表明,工程菌培养至对数生长中期OD值为1.0左右后,加入终浓度为5g/L的乳糖,于20℃的条件下诱导7h,可获得最大酶活。与异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)最适诱导条件相比,优化后的乳糖诱导酶活提高82.7%,可溶性目的蛋白的表达量提高99.5%,菌体生物量提高30.5%。研究结果为乳糖作为诱导剂应用于D-塔格糖3-差向异构酶的工业化生产提供有益的参考和借鉴。

实时荧光定量PCR技术在实验教学中的应用

设计了"实时荧光定量PCR分析IPTG诱导EGFP基因在大肠杆菌中的异源表达"实验,研究IPTG诱导浓度和温度对EGFP基因表达的影响。结果表明,IPTG浓度为270μmol/L、诱导温度为16℃、诱导时间为18h的条件下,EGFP mRNA的表达量最大。通过该实验的学习,使学生掌握实时荧光定量PCR的相关实验原理、技术以及实时荧光定量PCR仪的使用,培养学生的科研能力和综合素质。

大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体的构建及内皮抑素基因的表达

目的:构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体,并通过此载体使人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中得到表达。方法:以质粒pDG7、pBCSK(+)、pET-9C为基础,构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pET-1128,并将人内皮抑素基因插入到新构建的表达载体中,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和长双歧杆菌NQ-1501。诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和WesternBlot鉴定。结果:成功构建了大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体,人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中均可表达。结论:构建的穿梭载体为今后用双歧杆菌作为生理菌载体进行肿瘤的基因治疗奠定了基础。

乳糖诱导重组多价人精子表位肽在大肠杆菌中的表达

旨在研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组多价人精子抗原表位肽的表达及诱导表达的优化条件。在摇瓶发酵条件下,通过改变培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导方式等条件,利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,研究以上条件改变对GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白表达量的影响,并与IPTG诱导结果相比较。结果显示,在摇瓶试验中,最优表达条件为选用TB培养基,在菌体对数生长的中期进行诱导,诱导温度37℃、乳糖诱导终浓度3 mmol/L、诱导时间6 h。GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.5%,且主要以可溶形式表达,与IPTG的诱导结果相同。分批流加乳糖和一次性加入乳糖诱导,效果一样。乳糖可以替代IPTG作为诱导剂诱导GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达,优化条件下可获得与IPTG相同的诱导表达效果。

基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ发酵产麦芽糖转糖基酶的研究

为了获得最佳的基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ发酵产酶条件,通过进行诱导时间﹑诱导温度﹑IPTG的浓度﹑诱导前菌液浓度(OD600)等因素梯度实验,研究各因素对发酵产酶的影响。实验结果表明,基因工程菌的最佳诱导条件分别为:诱导时间为2.5h,诱导温度为30℃,IPTG浓度为0.5mmol/L,诱导前OD600值为0.5。在最佳工艺条件下,粗酶液的酶活为130U,相当于出发菌产酶效率的135倍。

生长抑素(SS)基因在pET-32表达系统中的高效表达

分别将SS基因克隆至pET 32a和pET 32c表达系统中 ,得到重组质粒SS N/X和SS N/S。实验结果表明 ,SS N/X Thioredoxin (硫氧还原蛋白 )和SS N/S Thioredoxin融合蛋白在IPTG (异丙基硫代 β D半乳糖苷 )诱导 3h后(37℃ )表达产量最高 ,约占菌体总蛋白的 30 %左右。 0 0 5～ 1mmol·L-1IPTG对SS融合蛋白表达产量的影响并不太大 ,0 0 5mmol·L-1IPTG即可达到有效的诱导效果 ,但单位体积内的表达产量以 0 5mmol·L-1时为最高。乳糖诱导 4h(37℃ )的效果明显低于IPTG ,但当培养时间延长至 8h时 ,2 0mg·mL-1的乳糖可达到与IPTG同样的诱导效果 ,10和 5mg·mL-1的乳糖也可接近IPTG的诱导效果。SS N/X融合蛋白在 2 6℃表达时 ,主要以可溶性形式存在 ,占75 8% ,包涵体仅占 2 4 2 % ;而SS N/S融合蛋白则主要以包涵体形式存在 ,占 6 0 2 % ,可溶性蛋白仅占 39 8%。SS可溶性融合蛋白具有良好的SS抗原性。