健脾益气方干预内质网应激IRE1α-XBP1通路诱导腹膜间皮细胞自噬防治PF的机制

目的 研究健脾益气方通过干预腹膜透析(PD)大鼠内质网应激IRE1α-XBP1通路,诱导自噬以减轻腹膜间皮细胞(PMC)上皮间充质转化(EMT)的作用及机制。方法 SD大鼠72只,采用5/6肾切除联合腹膜透析液制备腹膜纤维化(PF)模型,随机分为假手术组、模型组、西药组、中药高、中、低剂量组,每组12只,进行28 d药物干预。苏木素-伊红(HE)染色观察腹膜组织形态学改变,免疫组化、Western印迹及RT-聚合酶链反应(PCR)测定IRE1α-XBP1通路自噬及纤维化标志蛋白表达。结果 与模型组比较,假手术组、西药组、中药高、中、低剂量组葡萄糖调节蛋白(GRP)78、XBP1s、微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ、自噬相关蛋白Beclin-1、E-钙黏蛋白(cadherin)、α-肌动蛋白(SMA) mRNA及蛋白、pIRE1α蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 健脾益气方能够通过干预内质网应激通路IRE1α-XBP1诱导PMC自噬,激活其适应性保护作用,达到减轻PMC的EMT、改善腹膜功能,最终起到拮抗PF作用。

IRE1α/Xbp1s靶向调控NKp46改善NK细胞杀伤功能清除HIV感染细胞的思路探析

自然杀伤细胞的杀伤活性无MHC限制,不依赖抗体,是抵御肿瘤和病毒感染的第一道防线。肿瘤或慢性病毒感染后,固有免疫NK细胞与适应性免疫T细胞共同发挥免疫功能对抗肿瘤及感染,但由于免疫系统无法迅速根除病灶,免疫细胞内质网稳态被打破,使其无法发挥正常的免疫杀伤及清除功能,导致病情迅速恶化甚至死亡。NKp46是仅表达在NK细胞上的特异性活化受体,它直接影响NK细胞的活化程度与杀伤作用的强弱。艾滋病是一种目前无法根治的慢性传染病之一,病毒持续感染引起NK细胞内质网应激,IRE1α/Xbp1s信号通路的启动导致NKp46蛋白翻译大部分被抑制,影响NK细胞活化发挥功能,因此基于IRE1α/Xbp1s靶向调控NKp46寻求改善NK细胞杀伤功能的新靶点成为研究的新思路。

内质网应激IRE1α/XBP-1通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用

目的探讨内质网应激1型跨膜蛋白激酶α(IRE1α)/X盒结合蛋白1(XBP-1)通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法利用内质网应激诱导剂Thapsigargin观察小鼠原代成纤维细胞中IRE1α/XBP-1通路活性。利用IRE1α抑制剂KIRA8探究IRE1α/XBP-1通路在原代中脑多巴胺能神经元变性死亡中作用。结果相比于未处理组细胞,Thapsigargin处理后原代成纤维细胞中内质网应激IRE1α/XBP-1通路明显上调。Thapsigargin处理可显著降低原代中脑多巴胺能神经元的存活率,而KIRA8处理可显著改善Thapsigargin导致的多巴胺能神经元存活率降低。结论内质网应激通过IRE1α/XBP-1通路介导多巴胺能神经元的变性死亡。

跨膜蛋白IRE1α参与系统性红斑狼疮发病的研究进展

系统性红斑狼疮(SLE)是一种复杂的全身性自身免疫疾病。目前已知该疾病是遗传、感染、环境等因素共同作用的集合体,各种免疫细胞、炎症细胞因子以及异常的信号通路参与其中。然而,现有的研究对其病因的认识仍存在很大程度的局限性。肌醇需要酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)是一种内质网(ER)I型跨膜蛋白,几乎表达于所有哺乳动物的细胞和组织,具有胞质激酶和核糖核酸酶活性,是ER应激的压力感受器,与造成免疫紊乱的多种生理和病理条件有关,多项研究已证明其在自身免疫性疾病中发挥着关键作用。本文主要围绕IRE1α如何参与SLE发生发展作一综述。

天麻素经IRE1α/TRAF2/NF-κB通路调控大鼠急性心肌梗死诱导的炎性反应及机制研究

目的探讨天麻素对大鼠急性心肌梗死(AMI)诱导的炎性反应的影响,并分析其作用机制。方法50只SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(AMI)组、天麻素低剂量(L-GAD)组、天麻素高剂量(H-GAD)组、卡托普利(CAP)组,每组10只。采用超声心动图检测大鼠心功能,TTC染色评估大鼠心肌梗死面积比,HE染色观察大鼠心肌组织病理形态学变化,ELISA法和qRT-PCR法分别检测大鼠血清及心肌组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量及mRNA表达,Western blot法检测大鼠心肌组织中肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)/肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)/核因子(NF)-κB通路蛋白表达。结果与Sham组比较,AMI组大鼠心肌组织受损,存在明显心肌梗死,LVEF降低,LVDs和LVDd升高,血清和心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1水平及mRNA表达升高,心肌组织中TRAF2蛋白表达量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与AMI组比较,L-GAD、H-GAD组和CAP组大鼠心肌组织损伤减轻,心肌梗死面积比减小,LVEF升高,LVDs和LVDd降低,血清和心肌组织中TNF-α、IL-6、MCP-1水平及mRNA表达降低,心肌组织中TRAF2蛋白表达量、p-IRE1α/IRE1α和p-p65/p65比值下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论天麻素可通过调控IRE1α/TRAF2/NF-κB通路减轻AMI大鼠心肌组织损伤及心肌梗死面积,改善大鼠心功能,抑制炎性反应。

糖络宁通过外泌体调控IRE1α诱导细胞凋亡的作用机制研究

目的:探讨糖络宁(以下简称TLN)通过外泌体对雪旺细胞(schwann cells,SCs)IRE1α诱导的细胞凋亡的调控作用。方法:将30只SD大鼠分为空白组、模型组和糖络宁组,每组10只。除空白组外,其余各组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病模型。空白组及模型组灌胃给予蒸馏水,TLN组灌胃给予糖络宁溶液,12周后处死大鼠并收集血清。差速离心法分离血清中的外泌体,将SCs分为3组并分别与3组大鼠血清外泌体共培养。收集SCs,提取细胞中的总蛋白和总RNA,采用Western blot法测定TRAF2、p-JNK、Bcl-2、Bax、Cyto C和cleaved-Caspase-3的蛋白表达,采用RT-PCR法测定ASK1和Caspase-9的mRNA表达。结果:与空白组比较,模型组TRAF2、p-JNK、Bax、Cyto C和cleaved-Caspase-3的蛋白表达显著升高,Bcl-2的蛋白表达显著降低,ASK1和Caspase-9的mRNA表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,TLN组TRAF2、p-JNK、Bax、Cyto C和cleaved-Caspase-3的蛋白表达显著降低,Bcl-2的蛋白表达显著升高,ASK1和Caspase-9的mRNA表达显著降低(P<0.01)。结论:糖络宁能够通过外泌体抑制IRE1α-TRAF2-ASK1复合体,进而抑制JNK的磷酸化,然后分别抑制Bax表达,促进Bcl-2表达,以及抑制Cyto C、Caspase-9和Caspase-3的表达,从而抑制细胞凋亡。

黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾组织IRE1α及GRP78表达的影响

目的:观察黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾组织IRE1α及GRP78表达的影响。方法:将40只SD雄性大鼠随机分为黄芪甲苷组(40 mg/kg)、糖尿病肾病组与白藜芦醇组(20 mg/kg)并设立空白对照组,每组各10只,干预时长8周。实验过程中记录大鼠一般情况,定期测量血糖、体重,收集大鼠的尿液,测定24 h尿蛋白定量、尿微量白蛋白浓度。8周末检测血肌酐、尿素氮、胆固醇、三酰甘油并观察肾组织病理变化;采用免疫组化检测各组间GRP78、IRE-1α表达情况。结果:相较正常组,8周末,糖尿病肾病组大鼠肾组织病理损伤,IRE1α与GRP78表达显著增加;相较糖尿病肾病组,黄芪甲苷组大鼠GRP78、IRE-1α表达明显下降,肾组织病理损伤明显减轻。结论:黄芪甲苷可能通过改善内质网应激状态参与缓解糖尿病肾病的作用。

杨桃根DMDD对高糖诱导的肾小管上皮细胞HK-2内质网应激IRE1α通路及炎症反应的抑制作用

目的研究杨桃根活性成分2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮(DMDD)对高糖诱导肾小管上皮细胞HK-2内质网应激及炎症反应的抑制作用。方法体外培养HK-2细胞,并分为正常组、高糖组、内质网应激抑制剂4-PBA组(5 mmoL·L^(-1))和DMDD高、中、低浓度组(8、4、2μmol·L^(-1))。各组细胞培养结束后,采用CCK-8法检测细胞存活率;ELISA检测细胞上清液中TNF-α、IL-6的水平;AO/EB染色法检测细胞凋亡;Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平、内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP的表达水平以及IRE1α通路相关蛋白(IRE1α、JNK)的磷酸化水平。结果与高糖组比较,DMDD各浓度组细胞存活率明显升高;TNF-α、IL-6水平,Bax/Bcl-2、GRP78、CHOP蛋白表达水平和IRE1α、JNK蛋白磷酸化水平均明显降低,细胞中橙红色荧光明显减少。结论DMDD可能部分通过抑制内质网应激及IRE1α通路相关蛋白的表达,减少炎症反应,达到HK-2细胞的保护作用。

益肾汤经结肠透析对慢性肾衰竭大鼠肠上皮细胞IRE1α、GRP78表达的影响

目的:观察益肾汤经结肠透析对慢性肾衰竭(CRF)大鼠肠上皮细胞IRE-1α、GRP78表达的影响。方法:随机在60只健康雄性SD大鼠中抽取45只,腺嘌呤灌胃诱导建立CRF大鼠模型,其余15只为正常组。将造模成功大鼠随机分为CRF组、尿毒清结肠透析组和益肾汤结肠透析组,尿毒清结肠透析组予尿毒清结肠透析,益肾汤结肠透析组予益肾汤结肠透析,实验周期为4周。实验过程中记录大鼠一般状况、体重、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)的变化,4周末取肾组织、结肠组织行HE染色观察组织学改变,免疫组化检测各组结肠组织IRE1α、GRP78的表达及分布情况,实时荧光定量PCR法测定IRE1α、GRP78 mRNA表达情况。结果:(1)CRF组大鼠一般情况较正常组差,体重增长减慢(P<0.05),而尿毒清结肠透析组及益肾汤结肠透析组与CRF组相比有所改善,体重增加(P<0.05);(2)与正常组比较,CRF组Scr、BUN值升高(P<0.05),免疫组化示肠上皮细胞IRE1α、GRP78表达均明显上调(P<0.05),PCR结果显示GRP78、IRE1αmRNA相对表达量明显升高(P<0.05);(3)与CRF组比较,尿毒清结肠透析组及益肾汤结肠透析组Scr、BUN值降低(P<0.05),免疫组化示肠上皮细胞IRE1α、GRP78表达水平下调(P<0.05),PCR结果显示GRP78、IRE1αmRNA相对表达量显著降低(P<0.05),但两治疗组间表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:益肾汤经结肠透析可通过调节IRE1α、GRP78表达,抑制ERS保护肠黏膜屏障,从而改善CRF大鼠肾功能。

电针对脑缺血再灌注大鼠内质网应激IRE1α/TRAF2/ASK1/Caspase-12通路的影响研究

目的:观察电针“百会”“内关”对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠缺血侧大脑皮质凋亡相关蛋白IRE1α、TRAF2、ASK1及Caspase-12的影响,初步探讨电针治疗脑缺血再灌注凋亡损伤的作用机制。方法:60只雄性SD大鼠,随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、针刺组(C组)和依达拉奉组(D组),每组15只。选用改良线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型;LONGA 5级神经功能评分法评估大鼠神经功能情况;苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠缺血侧大脑皮质病理形态学变化;原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测大鼠神经元细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(WB)检测大鼠大脑皮质IRE1α、TRAF2、ASK1及Caspase-12蛋白表达情况。结果:与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分,细胞凋亡率以及IRE1α、TRAF2、ASK1及Caspase-12蛋白表达量均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01),大脑皮质组织结构紊乱,细胞萎缩坏死;与模型组比较,针刺组和依达拉奉组神经功能缺损评分以及IRE1α、TRAF2、ASK1和Caspase-12蛋白表达量均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),且细胞凋亡率降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),大脑皮质细胞病理状况比模型组减轻,萎缩坏死细胞变少;与依达拉奉组比较,针刺组大鼠各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:电针能抑制CIRI大鼠脑组织细胞凋亡,促进神经功能恢复,作用机制可能与电针下调IRE1α/TRAF2/ASK1/Caspase-12通路蛋白有关。

延龄草总皂苷通过调控GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信号通路抑制内质网应激而减轻PSCI大鼠海马神经元损伤

目的:探讨延龄草总皂苷(TST)对卒中后认知障碍(PSCI)大鼠海马神经元的保护作用及分子机制。方法:将采用改良Zea Longa线栓法造模成功的大鼠随机分为模型(model)组、TST(100 mg/kg)组和盐酸多奈哌齐(DON;0.45 mg/kg)组,另设假手术(sham)组,每组10只,连续给药4周。采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力;TTC染色检测大鼠脑梗死体积变化,HE、Nissl和TUNEL染色观察大鼠海马组织神经元病理变化;免疫组化及Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、肌醇需求酶1α(IRE1α)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、胱天蛋白酶12(caspase-12)、Bax和Bcl-2的蛋白水平。结果:与sham组相比,model组大鼠逃避潜伏期显著延长,穿越平台次数及目标象限停留时间显著减少(P<0.01);大鼠脑梗死体积显著增大,神经元尼氏小体数量显著减少,凋亡细胞显著增多;海马组织中GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平显著升高,Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.01)。与model组比较,TST组及DON组大鼠逃避潜伏期显著缩短,穿越平台次数及目标象限停留时间显著增加(P<0.01);大鼠脑梗死体积显著缩小,神经元尼氏小体数量显著增多,凋亡细胞显著减少;GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平显著降低,Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.01)。结论:TST对PSCI大鼠海马神经元具有保护作用,其机制可能与减轻内质网应激、减少神经元凋亡并抑制GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信号通路有关。

抑制IRE1α/NF-κB通路减轻蛛网膜下腔出血后炎症反应

目的:探讨肌醇激酶-1 (IRE1α)/核因子κB (NF-κB)通路与蛛网膜下腔出血(SAH)炎症反应的关系。方法:通过血管内穿刺法建立SAH模型。所有实验动物随机分为Sham组、SAH组、SAH + DMSO组、SAH + STF-083010 (IRE1α抑制剂)组、SAH + BAY11‐7082 (NF-κB抑制剂)组。使用改良加西亚评分评估神经功能。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测IRE1α、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、NF-κB的表达。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的浓度。结果:SAH后改良加西亚评分降低,IRE1α、GRP78、NF-κB蛋白表达和炎症因子(TNF-α, IL-1β, IL-6)表达均增加,抑制IRE1α/NF-κB通路后所有结果正好相反。皮尔森相关分析显示炎症因子表达与改良加西亚评分呈负相关。结论:抑制IRE1α/NF-κB通路可以减轻SAH后炎症,发挥神经保护作用。

从lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1信号通路探讨透骨消痛胶囊改善膝骨关节炎内质网应激研究

目的基于lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1信号通路,探讨透骨消痛胶囊延缓膝骨关节炎(KOA)软骨退变的机制。方法48只8周龄小鼠适应性喂养1周后,采用随机数字表法分为空白组12只、造模组36只,造模组动物经5%异氟醚吸入麻醉后,采用Hulth法诱导KOA模型,随机数字表法分为模型组12只、透骨消痛胶囊组12只和对照组12只。透骨消痛胶囊组予以透骨消痛胶囊368 mg/kg进行灌胃;对照组使用牛磺熊去氧胆酸500 mg/kg进行灌胃;空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃,连续4周。干预结束后,麻醉状态下处死各组小鼠,分离与收集膝关节软骨组织,Micro-CT观察小鼠膝关节软骨组织形态变化;Western blot检测关节软骨IRE1α/XBP1通路相关蛋白表达;qPCR检测软骨组织中lncRNA NEAT1表达水平。结果与空白组比较,模型组半月板结构缺失,胫骨平台软骨面呈现凹凸不平状、伴有明显的骨赘增生,软骨组织IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白含量、lncRNA NEAT1表达均显著升高(P<0.05);透骨消痛胶囊组、对照组小鼠内侧半月板结构缺失,2组软骨组织的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白含量均显著降低(P<0.05),lncRNA NEAT1表达水平均显著降低(P<0.05)。结论透骨消痛胶囊可通过下调KOA小鼠关节软骨组织中lncRNA NEAT1水平,抑制软骨组织与内质网应激有关的IRE1α/XBP1通路蛋白表达发挥作用。

基于Nrf2/HO-1信号通路研究黄连化浊胶囊对糖尿病大鼠胰岛β细胞及MCP1、IRE1α表达的影响

目的:基于Nrf2/HO-1信号通路研究黄连化浊胶囊对糖尿病大鼠胰岛β细胞及MCP1、IRE1α表达的影响。方法:选取50只SPF级雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、模型组、Nrf2激动剂EGCG(5 mg/kg)组、黄连化浊胶囊(2.025 g/kg)组、黄连化浊胶囊+EGCG组,每组10只,除正常对照组外其余各组采用腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,造模成功后,各给药组灌胃相应药物,正常对照组与模型组灌胃相应体积生理盐水。HE染色检测胰腺组织病理学;醛品红-橙黄G染色观察胰岛β细胞;TUNEL法检测胰岛β细胞凋亡;ELISA法检测血清MCP1含量;免疫印迹法检测胰腺组织IRE1α及Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型组胰腺结构遭到破坏,细胞出现空泡变性,胰岛体积明显变小,且边界不规则、模糊不清,胰岛出现萎缩且形状不规则,胰岛β细胞数量明显减少,胰腺组织病理评分、胰岛β细胞凋亡率及血清MCP1含量和胰岛组织IRE1α蛋白表达显著升高,胰岛组织Nrf2、HO-1蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较,各给药组胰腺组织病理形态明显改善,胰岛明显增大,胰岛β细胞数量明显增多;胰腺组织病理评分、胰岛β细胞凋亡率及血清MCP1含量和胰岛组织IRE1α蛋白表达显著降低,胰岛组织Nrf2、HO-1蛋白表达显著升高(P<0.05)。黄连化浊胶囊组各指标与EGCG组比较差异无统计学意义(P>0.05),黄连化浊胶囊+EGCG组各指标改善显著优于黄连化浊胶囊组和EGCG组(P<0.05)。结论:黄连化浊胶囊可显著改善胰岛β细胞损伤,并可抑制MCP1及IRE1α表达,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。

Bushen Yizhi Formula regulates the IRE1αpathway to alleviate endoplasmic reticulum stress in an Alzheimer’s disease rat model

While the Bushen Yizhi Formula can treat Alzheimer’s disease(AD),the yet to be ascertained specific mechanism of action was explored in this work.Methods:Different concentrations of the Bushen Yizhi Formula and amyloid-beta peptide(Aβ)were used to treat rat pheochromocytoma cells(P12)and human neuroblastoma cells(SH-SY5Y).Cell morphological changes were observed to determine the in vitro cell damage.Cell Counting Kit(CCK)-8 assay and flow cytometry were employed to identify cell viability and apoptosis/cell cycle,respectively.Western blotting and immunohistochemistry were employed to measure the expressions of endoplasmic reticulum stress(ERS)-related proteins(GRP78 and CHOP),p-IRE1α,IRE1α,ASK1,p-JNK,JNK,Bax,Bcl-2,XBP-1,and Bim.Fura 2-acetoxymethyl ester(Fura-2/AM)was used to determine the intracellular calcium(Ca^(2+))concentration.Also,an AD model was constructed by injecting Aβinto the CA1 area of the hippocampus in Sprague Dawley rats.AD model rats were gavaged with different concentrations of Bushen Yizhi Formula for 14 consecutive days.The Morris water maze experiment was conducted to test the learning and memory of rats.Hematoxylin&Eosin(H&E)and Terminal-deoxynucleotidyl Transferase(TdT)-mediated dUTP Nick-End Labeling(TUNEL)staining were done to determine histopathological changes in the brain.Results:Bushen Yizhi Formula relieved the Aβ-induced effects including cell injury,decreased viability,increased apoptosis,G0/G1 phase cell cycle arrest,upregulation of GRP78,CHOP,p-IRE1α,p-JNK,Bax,XBP-1 and Bim,as well as down-regulation of Bcl-2.These results were also seen with IRE1αsilencing.While Aβsuppressed the learning and memory abilities of rats,the Bushen Yizhi Formula alleviated these effects of Aβ.Brain nerve cell injury induced by Aβcould also be treated with Bushen Yizhi Formula.Conclusion:Bushen Yizhi Formula could influence ERS through the IRE1αsignaling pathway to achieve its therapeutic effects on AD.

肝胃百合汤对胃溃疡大鼠IRE1α信号通路的影响

目的基于肌醇需求酶1α(IRE1α)信号通路探讨肝胃百合汤对吲哚美辛所致胃溃疡大鼠胃黏膜的保护作用及机制。方法将36只SD大鼠随机分为空白组、模型组、奥美拉唑组、肝胃百合汤组,每组9只。肝胃百合汤组和奥美拉唑组分别给予7.29 g/(kg·d)肝胃百合汤和3.6 mg/(kg·d)奥美拉唑灌胃,空白组和模型组给予等量蒸馏水灌胃,连续灌胃1周后,模型组、奥美拉唑组、肝胃百合汤组给予80 mg/kg吲哚美辛灌胃诱导胃溃疡,造模3 h后处死大鼠,观察并计算胃溃疡指数,HE和TUNEL染色观察胃黏膜损伤及胃组织细胞凋亡情况,Western blot法检测胃组织内质网应激相关蛋白[葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、IRE1α、磷酸化肌醇需求酶1α(p-IRE1α)、凋亡信号激酶1(ASK1)、胱天蛋白酶12(Caspase-12)]表达情况。结果与空白组比较,模型组大鼠胃黏膜出现严重缺损,腺体结构紊乱,大量细胞死亡和炎性细胞浸润,胃组织细胞凋亡明显,胃组织中GRP78、p-IRE1α/IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与模型组比较,肝胃百合汤组和奥美拉唑组大鼠胃黏膜损伤明显减轻,胃溃疡指数均明显降低(P均<0.05),凋亡细胞明显减少,胃组织中GRP78、p-IRE1α/IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论肝胃百合汤可能通过抑制IRE1α信号通路介导的内质网应激,减轻胃黏膜细胞凋亡,从而发挥胃黏膜保护作用。

IRE1α重组腺病毒载体对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响

目的构建重组人IRE1α腺病毒,观察其对软骨干细胞ATDC5增殖与凋亡的影响。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建包含全长IRE1α基因和RNase+Kinase核心结构域的重组穿梭质粒pAdTrack-IRE1α、pAdTrack-R+K,通过电转法分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得重组腺病毒pAd-IRE1α、pAd-R+K。随后在HEK-293细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad-IRE1α、Ad-R+K。用直接PCR法鉴定重组腺病毒,后者体外感染软骨干细胞ATDC5,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪分别检测在内质网应激(ERS)和非ERS状态时重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响。结果酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd-IRE1α、pAd-R+K。流式细胞仪检测结果显示,在ERS状态时,重组腺病毒质粒Ad-IRE1α、Ad-R+K感染后ATDC5细胞G1期比例明显降低,S期细胞比例明显升高(P<0.05),细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。结论含IRE1α基因的重组腺病毒感染可促进ATDC5细胞的增殖和凋亡。

siIRE1α重组腺病毒对内质网应激介导凋亡的影响

目的构建内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒,并探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)状态下其对C2C12细胞增殖凋亡的影响。方法人工合成靶向IRE1α的siRNA序列,连接到穿梭载体pSES-HUS上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183感受态中进行同源重组,得到pAdSES-HUS-IRE1αsiRNA重组质粒。通过脂质体介导在HEK293细胞中包装并扩增重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA,在C2C12细胞中采用RT-PCR和Western blot检测其干扰效果,并通过FCM法和MTT检测Tm诱导ERS时病毒对C2C12细胞增殖凋亡的影响(分为4组:NC组、Tm单独处理组、Tm+Ad-RFP组和Tm+AdIRE1αsiRNA组),Western blot检测C2C12细胞中Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达。结果成功获得了病毒滴度约为4.3×1011PFU/mL的重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA。RT-PCR和Western blot检测结果表明,该重组腺病毒有效地抑制了C2C12细胞中IRE1α的表达。FCM检测结果表明,ERS条件下,Tm+Ad-IRE1αsiRNA组S期的细胞比例分别比Tm单独处理组和Tm+Ad-RFP组升高12.62%和14.80%(P<0.05);凋亡率比Tm单独处理组和Tm+Ad-RFP组降低16.64%和16.26%(P<0.05)。MTT实验结果与Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达与FCM结果一致。结论重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA在C2C12细胞中能有效抑制IRE1α的表达;ERS状态下,RNA干扰IRE1α基因可促进C2C12细胞的增殖,抑制其凋亡。

电针丰隆穴对非酒精性脂肪肝病大鼠肝脏p-PERK、p-IRE1α及炎性因子的影响

目的:探讨电针丰隆穴对非酒精性脂肪肝病大鼠肝脏p-PERK、p-IRE1α及炎性因子表达的影响。方法:SD大鼠按随机数字表法分为普食组、高脂对照组、手针"丰隆"组、电针"丰隆"组、电针"足三里"5组各12只,高脂饲料造模,取相应穴位给予毫针针刺、电针干预4周,HE染色观察肝脏病理形态变化,检测大鼠血清FFA、TG含量与肝组织TNF-α、IL-6 mRNA及p-PERK、pIRE1α蛋白表达。结果:HE染色示高脂对照组大鼠肝细胞排列紊乱,胞浆疏松,细胞内见大量大泡型脂肪空泡,干预后各组大鼠肝细胞脂肪变性减轻,两电针组效果更明显;各干预组血清FFA、TG含量及肝脏TNF-α、IL-6 mRNA与p-PERK、p-IRE1α蛋白表达明显低于高脂对照组,且电针"丰隆"组表达低于手针"丰隆"组;电针"丰隆"组与电针"足三里"组比较,FFA含量及TNF-α、IL-6mRNA与p-PERK蛋白表达降低。结论:电针能下调p-PERK、p-IRE1α蛋白和TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平,调节脂质代谢,改善内质网应激与炎症反应状态,且电针"丰隆"穴效果更优。

IRE1α促进人牙周膜成纤维细胞增殖

目的研究内质网跨膜蛋白IRE1α对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)增殖的影响。方法将成功构建的人IRE1α基因重组质粒染入hPDLFs细胞,采用免疫印迹法检测IRE1α重组基因在真核细胞内的表达情况,XTT法和流式细胞仪(FCM)检测转染后hPDLFs细胞增殖和细胞周期变化。结果酶切及测序结果证实IRE1α重组质粒构建成功;免疫印迹分析结果证实,IRE1α重组质粒能在hPDLFs细胞内正确表达;在内质网应激(ERS)状态下,与衣霉素(tunicamycin,TM)对照组相比,XTT检测结果显示:IRE1α实验组hPDLFs细胞增殖率明显增高(P<0.01);FCM结果分析显示:IRE1α实验组hPDLFs细胞S期比例增加而G1期减少(P<0.05)。结论在ERS状态下,IRE1α促进hPDLFs细胞增殖,促进hPDLFs细胞从G1期进入S期。