基因捕获元件int1和ISCR1在临床菌株中的分布及与细菌耐药性的关系研究

目的研究临床多种细菌中的Ⅰ型整合酶编码基因int1和ISCR1的分布情况,探究其与细菌多药耐药表型的关系。方法收集2011-2012年河北省某医院临床菌株,应用VITEK2COMPACT全自动微生物生化鉴定系统和16SrDNA序列分析进行种属鉴定,利用PCR方法进行int1基因和ISCR1筛查;两种可移动元件的携带情况和菌株的多药耐药表型之间的关系采用卡方检验进行统计计算。结果共收集临床菌株372株,包括325株革兰氏阴性菌和47株革兰氏阳性菌;int1基因和ISCR1在22种(属)175株和18种(属)90株革兰氏阴性细菌中检出,同时在17种(属)71株革兰氏阴性细菌中检出,革兰氏阳性细菌int1基因和ISCR1检测均为阴性;通过对数据分层对比,统计分析发现,在int1基因不存在时,ISCR1的存在与否与菌株是否为多药耐药的关系明显,差异有统计学意义(P<0.01),其存在亦能介导更广泛种类药物耐受,差异亦有统计学意义(P<0.01)。在int1基因存在时,ISCR1的存在能介导更广泛种类药物耐受,差异有统计学意义(P=0.02);在ISCR1不存在时,int1基因的存在与否与菌株是否多药耐药的关系明显,差异有统计学意义(P<0.01),其存在亦能介导更广泛种类药物耐受,差异亦具有统计学意义(P<0.01)。而在ISCR1存在的情况下,上述两种关系不明显。结论基因捕获元件int1基因及ISCR1在革兰氏阴性临床菌株中分布广泛,并与细菌的多重耐药、泛耐药明显相关,特别是ISCR1;应加强可移动元件int1基因或ISCR1流行状况的监测,为其在耐药基因捕获中的作用机制研究和控制多药耐药细菌在临床散播提供可靠的基础数据。

洋葱伯克霍尔德菌整合子Ⅰ和ISCR1分布及ERIC-PCR分型

目的研究临床分离洋葱伯克霍尔德菌的整合子Ⅰ和ISCR1的分布情况,并对其进行基因分型。方法分离临床70株洋葱伯克霍尔德菌,用WHONET5.4分析菌株药敏情况,ERIC-PCR进行基因分型。PCR检测整合酶Ⅰ、整合子Ⅰ、ISCR1以及ISCR1携带的耐药基因。结果洋葱伯克霍尔德菌对氨曲南、庆大霉素、阿米卡星高度耐药,对复方新诺明、米诺环素、哌拉西林/他唑巴坦、美洛培南的敏感率较高。70株洋葱伯克霍尔德菌分为15个基因型,14株整合酶阳性,9株整合子Ⅰ阳性,4株ISCR1阳性,2株ISCR1和ISCR1携带的耐药基因阳性。结论整合子Ⅰ和ISCR1在洋葱伯克霍尔德菌的携带率低,ERIC-PCR可用于临床分离洋葱伯克霍尔德菌的基因分型。

安徽地区嗜麦芽寡养单胞菌中整合子及ISCR1流行情况研究

目的了解安徽省2010—2013年嗜麦芽寡养单胞菌(SMA)临床分离株的整合子和ISCR1及其携带的耐药基因情况,并初步探究其与耐药性的关系。方法应用PCR扩增qac E△1-sul1基因、int I、int II、int III、I类整合子可变区、ISCR1基因及ISCR1可变区耐药基因;对临床分离株采用琼脂倍比稀释法测定药物的最低抑菌浓度。结果 115株嗜麦芽寡养单胞菌中Int I的检出率为64.3%,ISCR1的检出率为4.3%,未检测到II类、III类整合子。I类整合子可变区检出aac A4-cat B8-aad A1和aac(6’)-IIblaCARB-8两类基因盒,检出率分别为6.8%和2.7%,ISCR1可变区未检出耐药基因。I类整合子的检出在多重耐药株与非多重耐药株中的差异有统计学意义(P<0.01)。sul1阳性组和Int I阳性组中甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐药程度均要明显高于两者均阴性的一组。结论 I类整合子及sul1基因的存在可以加重SMA对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐药性。本地区I类整合子与ISCR1的检出可能有助于SMA的多重耐药性及耐药基因的传播。

iscR基因缺失对副猪嗜血杆菌荚膜多糖合成基因簇中部分相关基因表达的影响

为研究iscR基因对副猪嗜血杆菌(HPs)荚膜多糖(CPS)合成相关基因表达的影响,本研究利用荧光定量PCR方法检测野毒株(290A1-WT)和iscR基因缺失株(290A1-△iscR)内构成CPS基因簇相关基因funA、wbgY、capD、wza和funK的表达量变化;并利用透射电镜观察两菌株体外培养和与猪血清作用后菌体表面荚膜的差异。结果显示:体外培养时,iscR基因缺失株wza的表达量一直高于野毒株的表达量,在OD_(600nm)值为0.2时差异显著(p<0.05),而capD在OD_(600nm)值为0.2时表达量显著降低(p<0.05);其他基因表达量无明显差异。当菌株与猪血清作用后,iscR基因缺失株中的capD、wza和funK的表达量均显著高于野毒株(p<0.05);在血清作用10 min时,funA的表达量显著低于野毒株(p<0.05);在血清作用20 min后,wbgY的表达量显著高于野毒株(p<0.05)。透射电镜结果显示,与血清作用前两菌株均无明显荚膜生成,与猪血清作用10 min后野毒株荚膜厚度达到100 nm,而iscR基因缺失株仍无明显荚膜生成,该结果说明iscR基因可能在一定程度上会促进HPs表面荚膜的生成。本研究结果为HPs CPS合成相关基因功能及其表达调控研究提供一些新的依据。

临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子与ISCR1研究

目的了解临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单保菌Ⅰ类整合子与插入序列共同区1(ISCR1)的分布情况。方法 2010年1月至2013年12月共收集我院126株多重耐药鲍曼不动杆菌和89株多重耐药铜绿假单胞菌,采用PCR法扩增Ⅰ类整合酶、Ⅰ类整合子基因盒、ISCR1、ISCR1可变区。Ⅰ类整合基因盒和ISCR1可变区的PCR产物分别用HinfⅠ、RasⅠ进行酶切,相同类型酶切图谱的PCR产物随机挑取一例进行测序,测序结果在Gen Bank中用Blast N进行核酸序列同源性搜索。结果在多重耐药鲍曼不动杆菌中,检出79例Ⅰ类整合酶,67例Ⅰ类整合子基因盒阳性,含有6种类型;59例ISCR1阳性,其中9例ISCR1可变区阳性。在89株多重耐药铜绿中,检出41例Ⅰ类整合酶,36例Ⅰ类整合子基因盒阳性,含有10种类型;9例ISCR1阳性,其中4例ISCR1可变区阳性。有8株鲍曼不动杆菌和2株铜绿假单胞菌同时携带Ⅰ类整合子和ISCR1可变区结构。结论在多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中,Ⅰ类整合子和ISCR1分布较广。

铜绿假单胞菌整合子Ⅰ和ISCR1分布及ERIC-PCR分型

目的研究临床分离铜绿假单胞菌的整合子Ⅰ和ISCR1的分布情况,并对其进行基因分型。方法分离临床234株铜绿假单胞菌,用WHONET5.4分析菌株药敏情况,PCR检测整合酶Ⅰ、整合子Ⅰ、ISCR1以及ISCR1携带的耐药基因。ERIC-PCR进行基因分型。结果铜绿假单胞菌对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氯霉素、头孢唑啉、米诺环素、氨苄西林/舒巴坦高度耐药,对环丙沙星、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、亚胺培南、美洛培南较敏感,118株整合酶Ⅰ阳性,95株Ⅰ类整合子可变区阳性,3株ISCR1和ISCRI携带的耐药基因阳性。118株整合酶Ⅰ阳性铜绿假单胞菌分为89个基因型。结论Ⅰ类整合子广泛存在于铜绿假单胞菌中,ISCRI携带率较低,ERIC-PCR可用于临床分离铜绿假单胞菌的基因分型。

鲍曼不动杆菌临床株中可移动遗传元件ISCR1的作用

目的了解鲍曼不动杆菌临床株中新型可移动遗传元件ISCR1的携带情况及其下游基因环境,探讨鲍曼不动杆菌耐药播散机理。方法收集多重耐药鲍曼不动杆菌临床株34株和敏感株21株,PCR扩增ISCR1基因及其下游的基因环境,扩增产物测序分析。结果 34株多重耐药鲍曼不动杆菌临床株中,携带ISCR1基因14株,其中11株ISCR1阳性多重耐药株,在ISCR1基因下游携带氨基糖甙类耐药基因armA基因;21株敏感株中,ISCR1基因扩增结果均为阴性。结论 ISCR1元件可能参与了armA耐药基因的水平播散。

多重耐药铜绿假单胞菌整合子和ISCR1结构及基因分型研究

目的：研究临床分离的铜绿假单胞菌的整合子I和ISCRl的分布情况，并进行ERIC-PCR基因分型。方法：分离临床80株铜绿假单胞菌，ERIC-PCR进行基因分型。PCR检测整合酶I、整合子I、ISCRl以及ISCRl携带的耐药基因。结果：铜绿假单胞菌分为51个基因型，26株整合酶阳性，21株整合子I阳性，2株ISCR1和ISCR1携带的耐药基因阳性。结论：铜绿假单胞菌的整合子I和ISCRI携带率较低，临床可用ERIC-PCR进行铜绿假单胞菌的基因分型。

多重耐药鲍曼不动杆菌整合子和ISCR1结构及基因分型研究

目的探讨临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌整合子I和ISCR1的结构,并进行基因分型。方法分离临床80株多重耐药鲍曼不动杆菌,PCR检测整合酶I、整合子I、ISCR1以及ISCR1携带的耐药基因,ERIC-PCR进行基因分型。结果多重耐药鲍曼不动杆菌80株整合酶阳性,50株整合子I阳性,37株ISCR1携带的耐药基因阳性,ERIC-PCR分为22个类型。结论整合子I和ISCR1在鲍曼不动杆菌介导多重耐药方面有重要作用,ERIC-PCR是研究临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌基因分型的有效方法之一。

维氏气单胞菌IscR异源表达调控大肠杆菌氧化应激耐受

以维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)基因组为模板,扩增iscR基因全长,经双酶切后与外源表达质粒pET28a连接,并利用电击转化法转化大肠杆菌BL21感受态细胞,通过阳性克隆子筛选,获得含有重组质粒pET28a-iscR的BL21重组菌株BL21-pET28a-iscR。以该重组菌株为研究对象,通过添加特定浓度的IPTG,诱导重组菌株中IscR蛋白表达,并采用0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L 5个H_(2)O_(2)终浓度对BL21-pET28a-iscR和转入空载质粒的对照菌株BL21-pET28a处理30 min,最后通过浓度梯度稀释点板试验,观察经不同H_(2)O_(2)浓度处理后细菌的菌落生长情况。研究结果显示,与对照菌株BL21-pET28a相比,在相同H_(2)O_(2)终浓度处理情况下,重组菌株BL21-pET28a-iscR的生长能力均较强,表明维氏气单胞菌来源的IscR蛋白可以异源表达并发挥功能,从而提高重组大肠杆菌的抗氧化应激能力。初步证明维氏气单胞菌IscR蛋白参与细菌响应氧化应激胁迫的调节,为后续进一步探究IscR蛋白参与病原菌环境适应和毒力等功能,并解析细菌胁迫响应的分子机制提供依据。

MGB探针标记-实时荧光PCR方法检测细菌int1基因和ISCR1元件方法的建立

目的 建立一种快速、准确检测细菌中ISCR1复合型Ⅰ型整合子的MGB探针二重实时荧光PCR方法。方法 根据ISCR1复合型Ⅰ型整合子中int1基因和ISCR1元件序列设计特异性引物和探针,在多种经常携带有2种多耐药相关基因元件的细菌中检测其特异性;使用含有2种基因元件特异性序列的重组质粒标准品评价建立方法的灵敏度。结果 建立的MGB二重探针实时荧光PCR检测方法特异性好,携带2种基因元件或单独含有ISCR1或者int1的实验菌株均出现相应特异性扩增曲线,对2种基因元件均不含的菌株进行试验扩增时,均未见出现特异性扩增曲线。对2种基因元件都存在的实验菌株的扩增中,亦不存在由于2套引物/探针相互影响而造成的干扰扩增。根据标准质粒样品构建的标准曲线可确定其对int1基因和ISCR1元件的检测灵敏度分别为5.89×10~1拷贝/μl和4.13×10~1拷贝/μl。结论本研究成功建立了MGB二重探针实时荧光PCR快速检测方法。

483株肉鸡源大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ISCR1及int1基因的流行及耐药情况

目的 研究山东肉鸡源细菌中ISCR1和int1基因的流行及耐药情况。方法 于2014年6月，在山东某大型肉鸡养殖场中选择日龄在37 d的待宰肉鸡作为采样对象。将鸡舍分为东部、南部、西部、北部、中部5区，选取不同区域肉鸡，采用单纯随机方法，按照1∶50比例进行泄殖腔拭子采样，共得到肉鸡粪便样本400份，经分离共得到483株非重复性样本菌株，其中大肠埃希菌373株（77.2%），肺炎克雷伯菌110株（22.8%）；采用微量肉汤稀释法，测定菌株对8类10种抗菌药物的最低抑菌浓度；并对int1和ISCR1基因进行PCR扩增和测序；比较携带两种基因的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的耐药程度差异。结果 483株菌株中，共检测到携带int1基因的菌株为440株（91.1%），携带ISCR1基因的菌株为126株（26.1%），同时携带int1和ISCR1基因的菌株共有126株（26.1%）。37株同时不携带ISCR1和int1基因的大肠埃希菌耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为13.5%（5株）、78.4%（29株）和8.1%（3株），288株仅携带int1基因的大肠埃希菌耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为2.4%（7株）、74.7%（215株）和22.9%（6株），两者差异有统计学意义（P〈0.001）；26株仅携带int1基因的肺炎克雷伯菌耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为11.5%（3株）、76.9%（20株）和11.5%（3株），78株同时携带ISCR1和int1基因的肺炎克雷伯菌耐受0~2、3~5、6~8类药物的比例分别为0、35.9%（28株）和64.1%（50株），两者差异有统计学意义（P〈0.001）。结论 int1和ISCR1基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的检出率较高，两类基因同时存在可介导更高程度的耐多药表型。

新型抗生素抗性基因传播元件ISCR及其生态风险

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)作为一种新型的环境污染物,成为多个学科关注的焦点.其在不同环境介质中的扩散和传播具有极大的环境危害性,对人类健康造成严重威胁.插入序列共同区(insertion sequence common region,ISCR),是一种新发现的抗性基因传播元件,因其特殊的遗传结构,能够通过滚环复制及同源重组等机制移动邻近的任何DNA序列,是ARGs在不同DNA分子或不同种属细菌间水平传播的高效媒介.目前世界上发现了27种ISCR元件.大量间接证据表明,ISCR可能与许多耐药基因的移动和扩散有关,特别是多重耐药性(multiple drug resistance,MDR)形成与传播.因此,ISCR很可能是抗生素抗性基因在环境中扩散传播的关键因子.本文就ARGs水平传播、ISCR结构特征、ISCR种类及其相关ARGs及其研究方法等进行综述,并揭示ISCR元件可能的生态风险,提出了今后的研究重点,以期为今后深入开展相关研究打下基础.

泛耐药鲍曼不动杆菌整合子Ⅰ和ISCR1结构及基因分型研究

目的研究从临床分离的鲍曼不动杆菌的整合子Ⅰ和ISCR1的分布及结构情况,并对其进行基因分型。方法分离自临床的57株鲍曼不动杆菌,PCR检测整合酶Ⅰ、整合子Ⅰ、ISCR1以及ISCR1可变区,PCR产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分型并进行测序分析可变区携带的耐药基因盒,ERIC-PCR进行基因分型。结果 49株整合酶I阳性,其中47株整合子I扩增阳性,RFLP分为2型,测序结果为aacA4-catB8-aadA1和drf17-aadA5。3株ISCR1以及ISCR1可变区扩增均阳性,可变区经RFLP分为1型,测序结果为orf513-qnrA1-ampR-qacEdeltal,ISCR1阳性菌整合子I均阳性,经ERIC-PCR检测将57株鲍曼不动杆菌分为27个基因型。结论Ⅰ类整合子广泛存在于鲍曼不动杆菌中,ISCRI携带率较低,氨基糖苷类、甲氧苄啶类和β-内酰胺类耐药基因盒较常见,ERIC-PCR可用于临床鲍曼不动杆菌的分子流行病学研究。

鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子和ISCR1的检测及其结构分析

目的了解鲍曼不动杆菌中Ⅰ类整合子与ISCR1分布情况及其所携带耐药基因的种类,从而分析其结构及其与耐药性的关系。方法采用煮沸法提取鲍曼不动杆菌基因组DNA,设计引物进行PCR反应,扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果,根据Ⅰ类整合子可变区扩增产物图谱进行RFLP分型,最后进行产物的序列分析。结果PCR扩增51株鲍曼不动杆菌,Ⅰ类整合酶基因intⅠ扩增阳性45株,其中包括可变区阳性32株。并且Ⅰ类整合子的可变区扩增出的目的片段大小各不相同,有28株扩增片段约为2.3kb,2株扩增片段约为2.4kb,2株扩增片段为3kb;ISCR1扩增阳性22株,其下游扩增阳性5株,扩增片段大小约为3kb。同时携带Ⅰ类整合子和ISCR1扩增阳性菌目的片段大小约为2kb。酶切图谱显示,大小为2.3kb的Ⅰ类整合子可变区产物为同一带型;序列分析显示,大小不同的Ⅰ类整合子的可变区各片段所含的基因盒各不相同;耐药基因序列分析显示,5株ISCR1的下游扩增片段为qnrA1-ampR。同时显示Ⅰ类整合子和ISCR1两种元件以串联的形式存在于鲍曼不动杆菌中。结论Ⅰ类整合子与ISCR1大多以串联形式同时存在于骨髓炎患者感染的鲍曼不动杆菌中,该结构对耐药基因在不同鲍曼不动杆菌菌株间的水平传播可能起介导作用。

高比例新能源接入的配电网稳定薄弱环节辨识与致稳调控技术研究

高比例新能源接入电网的间歇性和波动性对系统稳定性有显著影响。因此,评估和提升含高比例可再生能源(Renewable Energy Source, RES)的配电网稳定性至关重要。文中提出了一种新的系统强度评估指标——集成短路比(Integrated Short Circuit Ratio, ISCR),该指标不仅考虑了RES之间的相互作用,还考虑了储能设备(Energy Storage Device, ESD)的影响,能更准确地辨识电网薄弱环节。另外,基于ISCR提出了通过双层优化方法调配RES和ESD的位置和容量的配电网稳定性提升方法,以增强系统强度并提高RES和ESD容量。在上层,对RES的位置和容量进行优化,确保节点处的ISCR值最大;在下层,对ESD的位置和容量进行优化,确保ISCR值高于临界短路比(Critical Short Circuit Ratio, CSCR),以保持系统强大。位置优化由节点处的ISCR值确定。容量优化采用线性规划方法求解。最后,案例研究验证了所提优化方法在保持系统强度的同时增加RES和ESD容量的有效性。

一类社交网络中受媒介影响的信息传播动力学模型分析与最优控制

建立了考虑信息传播者对信息传播具有冷淡期及在点对点和群体传播方式下的ISCR(Ignorants-Spreaders-Cooled-Recovered)动力学模型。推导出模型的基本再生数R0和平衡点,证明了当R0<1时无信息平衡点全局渐近稳定;利用Li-Muldowney几何准则得出当R0>1时信息正平衡点全局渐近稳定的条件。通过运用Pontryagin最大值原理得出最优控制策略。数值模拟发现,冷淡率在信息传播中至关重要,增大冷淡率可显著减少传播者数量;当疾病爆发时,应减小冷淡率以扩大与疾病相关的信息的传播范围,从而采取保护措施来降低染病风险。

一株致病性溶藻弧菌的多重耐药与毒力基因分子分析

从发病的凡纳滨对虾中分离并经鉴定得到一株溶藻弧菌(命名为:V_A-76),通过对虾回感实验和药物敏感性实验分别对V_A-76菌株的耐药表型和致病能力进行了研究,并运用PCR方法检测了该菌的毒力相关基因、整合子和耐药基因的携带情况。对虾感染实验结果表明,溶藻弧菌V_A-76能够导致凡纳滨对虾发病死亡。经PCR检测发现,该菌携带8种毒力相关基因:tdh、tlh、tox S、collagenase、fla A、omp W、asp A和fur。药敏结果显示,V_A-76对环丙沙星、氯霉素、链霉素、红霉素、磺胺甲噁唑、复方新诺明和利福平7种药物表现出较高的耐药水平,且该菌包含1类整合子、4类超级整合子SXT和1型插入序列共同区(ISCR1)。此外,该菌携带arr-2、dfr A27、str A、str B、floR、cat和qnrv C耐药相关基因。从上述研究结果可知,菌株V_A-76既具有一定的感染能力,同时对多种抗菌药物表现出较高的耐药水平,提示应对养殖源致病性弧菌的耐药性现状予以更多的关注。

临床分离大肠埃希菌耐药机制和基因分型研究

目的研究临床分离大肠埃希菌的耐药机制及遗传多态性。方法用WHONET5.4分析菌株药敏情况。PCR检测大肠埃希菌I类整合酶基因、插入序列共同区(ISCR/orf513)和产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因;以肠杆菌科间的重复序列(ERIC)-PCR检测基因型,SPSS分析多态性。结果除亚胺培南、美洛培南、四环素和哌拉西林/他唑巴坦,产ESBLs菌的耐药率明显高于不产ESBLs菌(P<0.05)。72株产ESBLs株中I类整合酶,ISCR,blaTEM,blaSHV,blaCTX-M的阳性率分别为51.4%,12.5%,80.6%,0%和36.1%;而27株不产ESBLs株中的阳性率分别为37.0%,3.7%,81.5%,3.7%和3.7%。根据指纹图谱把99株大肠埃希菌基因型分为79种,经SPSS系统聚类分析,可归为18个大泪。结论我院产ESBLs大肠埃希菌主要是CTX-M型;产ESBLs株的I类整合酶阳性率明显高于不产ESBLs株,整合子和ISCR可以共存;ERIC-PCR是一种效果较好的基因分型方法,我院大肠埃希菌散发存在。

耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌耐药机制及分子流行病学研究

目的:阐明耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(CRAB)主要耐药机制和分子流行病学特征。方法:PCR方法检测常见碳青霉烯酶基因,PCR-RELP分型及基因测序检测整合子Ⅰ和ISCR1,ERIC-PCR及聚类分析研究克隆相关性。结果:碳青霉烯酶基因NDM、IMP、VIM、OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like检出率分别为4.1%、22.9%、26.0%、67.7%、63.5%、46.8%、65.6%。整合子Ⅰ可变区分为12个耐药基因盒排列类型,A6和A12首次在鲍曼不动杆菌中发现;ISCR1可变区分为6个类型。将耐药机制、ERIC-PCR及聚类分析结合临床资料综合分析,CRAB感染患者均为散发,粪便中CRAB不是临床感染来源。结论:CRAB主要耐药机制是产碳青霉烯酶及整合子Ⅰ、ISCR1携带率高,ERIC-PCR基因分型结合耐药机制研究适用于分子流行病学调查。