转录因子Nkx2.5、ISL-1表达与小鼠胚胎心的早期发育

目的：探讨转录因子Nkx2.5和ISL-1的表达与小鼠胚胎早期心发育的关系.方法：胚龄7.5～13d小鼠胚胎连续石蜡切片,用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗转录因子ISL-1、抗Nkx2.5抗体,进行免疫组织化学显色.结果：转录因子Nkx2.5在胚龄7.5d生心板表达早于心肌特异性蛋白MHC及SMA.随心外形建立,Nkx2.5在心各部表达逐渐增强.胚龄9d, Nkx2.5阳性表达从原始心管动脉端延伸至心包腔背侧脏壁中胚层及咽周围轴旁中胚层.Isl-1开始表达于胚龄8d原始心管心背系膜及前肠腹侧脏壁中胚层间充质,阳性细胞数量在11～12d达顶峰,形成前肠腹侧连接流出道远端和心房背侧壁的ISL-1阳性细胞带.11～12d,流出道远端出现Nkx2.5和MHC阴性,ISL-1、SMA阳性表达区.胚龄13d后,Nkx2.5和ISL-1在心和前肠腹侧间充质的表达强度下降.结论：Nkx2.5是原始生心区心肌前体细胞早期分化的标记蛋白,在第2生心区表达限于胚龄9d、咽周脏壁和轴旁中胚层心肌前体细胞亚群.第2生心区标记蛋白ISL-1主要表达在胚龄8～12d前肠腹侧脏壁中胚层心肌前体细胞,并向心管添加心肌细胞,参与流出道发育及心管成襻.11d后,第2生心区间充质细胞开始分化为升主动脉和肺动脉干平滑肌.

上海地区早发2型糖尿病Isl-1基因突变筛查及患者临床特征

目的筛查上海地区早发2型糖尿病Isl-1基因突变的发生情况并分析患者的临床特点。方法选择上海地区96例早发2型糖尿病患者作为研究对象,以100名健康志愿者作为正常对照。收集受试者年龄、性别、血压等一般资料以及糖、脂代谢等实验室检查资料,并进行组间比较。应用PCR直接测序法,对两组受试者Isl-1基因突变情况进行筛查,观察突变基因位点、基因型分布频率、等位基因频率以及携带突变基因者的临床特点。结果与正常对照组比较,早发2型糖尿病组患者年龄较轻,空腹血糖、空腹胰岛素及三酰甘油水平均明显升高(P<0.05或P<0.01);空腹血浆C肽水平虽高于正常对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。PCR直接测序筛查结果显示,正常对照组未见Isl-1基因突变;早发2型糖尿病组筛查发现2例患者携带Isl-1外显子5的E283D错义突变基因(A→T),其中T等位基因频率为1.0%,AT基因型分布频率为2.1%;两突变基因携带者空腹血浆C肽分别为0.6ng/mL和0.2ng/mL,均低于其0.82ng/mL的正常值下限(P<0.05)。结论上海地区早发2型糖尿病患者中筛查出Isl-1基因外显子5的E283D突变,且突变基因携带者的空腹血浆C肽水平均低于正常值下限。

ISL-1和Tbx18联合转染对乳鼠心室肌细胞重编程的作用研究

目的:探讨ISL-1和Tbx18联合转染对乳鼠心室肌细胞重编程的作用,及能否在体外构建生物起搏点。方法:将乳鼠心室肌细胞随机分成空白对照组、GFP组、ISL-1组、Tbx18组、ISL-1+Tbx18组,分别转染相应病毒,培养5～7 d后qRT-PCR、Western blot和免疫荧光检测超极化激活环核苷酸门控离子通道蛋白亚型4(HCN4)的表达情况,观察细胞形态和搏动频率变化,并用膜片钳技术记录细胞内电流活动。结果:ISL-1组、Tbx18组和ISL-1+Tbx18组的细胞搏动频率和HCN4的mRNA和蛋白表达水平较空白对照组和GFP组明显升高,其中ISL-1+Tbx18组的细胞搏动频率和HCN4的mRNA和蛋白表达水平明显高于ISL-1组和Tbx18组(P均<0.05)。通过免疫荧光技术,ISL-1组和Tbx18组可检测到HCN4不连续表达,ISL-1+Tbx18组HCN4连续高表达。通过膜片钳技术,ISL-1组和Tbx18组均仅有少数细胞可记录到起搏电流活动,而ISL-1+Tbx18组大多数细胞可记录到起搏电流活动。结论:ISL-1和Tbx18联合表达能提高乳鼠心室肌细胞重编程为起搏样细胞的效率。

ISL-1诱导脂肪干细胞向起搏样细胞分化

目的探讨过表达胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1)的慢病毒在体外转染脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),能否诱导ADSCs向起搏样细胞分化。方法取第3～5代ADSCs,随机分成Bank、m Cherry和胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1) 3组,按分组分别转染病毒,经荧光强度和流式分析确定最适感染复数,与乳鼠心室肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRVMs)共培养7天后进行实时荧光定量聚合酶式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质印迹、免疫荧光检测分析,期间观察细胞形态和搏动频率变化,并用膜片钳技术记录细胞内电流活动。结果分离贴壁后的ADSCs呈长梭形,慢病毒转染ADSCs的最适感染复数为50。ISL-1组ADSCs形态呈多样化,窦房结特异性基因HCN4、Cx45和Tbx3的mRNA表达水平上调,而工作心肌特异性基因Nkx2. 5下调,组间比较差异有统计学意义(P <0. 05)。ISL-1组大多数细胞可检测到HCN4表达并且可记录到超极化内向电流。结论经ISL-1基因修饰的ADSCs通过体外心肌微环境诱导,产生了一定的高表达窦房结标志性基因并具有细胞内典型超极化电活动的起搏样细胞。

Isl-1介导瘦素对胰岛素分泌的调节

已有的研究结果证明,瘦素能够调节胰岛素的分泌,转录因子Isl-1亦对胰岛的发育及功能也具有重要调节作用。但是,转录因子Isl-1是否参与介导胰腺中瘦素对胰岛素的分泌尚不清楚。我们正是针对这一问题,通过体内、体外实验,同时利用瘦素受体敲除(db/db)

神经嵴细胞和胰岛因子1阳性细胞与小鼠胚胎心流出道发育的关系

目的探讨迁移中的细胞视黄酸结合蛋白1(CRABP1)阳性神经嵴细胞、胰岛因子1(ISL-1)、阳性心肌前体细胞与小鼠胚胎心流出道发育的关系。方法 36只胚龄8.5～13d小鼠胚胎心连续石蜡切片,选用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗转录因子ISL-1、抗CRABP1和抗磷酸化组蛋白H3(PHH3)抗体,进行免疫组织化学及免疫荧光染色。结果胚龄8.5～10d,ISL-1阳性心肌前体细胞相继出现在心背系膜、原始咽两侧、头面部、鳃弓核心间充质和心包腔背侧壁间充质,构成心管流出道发育的第二生心区。胚龄11～13d,ISL-1阳性细胞在咽前方聚集,形成特征性锥体形结构,并向升主动脉、肺动脉干及主肺动脉隔延伸。胚龄9d前,神经嵴细胞散在分布于ISL-1阳性细胞之间,流出道远侧端可见少量CRABP1和ISL-1双阳性细胞。胚龄10d,CRABP1阳性神经嵴细胞分布在ISL-1阳性鳃弓核心间充质周围。随着发育,弓动脉等处的神经嵴细胞逐渐失去CRABP1表达,开始表达α-SMA。结论 ISL-1阳性第二生心区是动态结构,胚龄8.5～10d时,在神经嵴细胞配合下,向心管动脉端添加心肌细胞;胚龄11d后,开始向平滑肌方向分化,参与升主动脉、肺动脉干和主肺动脉隔的发育。

转录因子Brn3a及胰岛因子1在三个时期中三叉神经节的表达情况

目的探讨转录因子Brn3a及胰岛因子1(Islet1,Isl-1)转录因子在生长发育的三个时期中三叉神经节中的表达情况。方法取发育不同时期的小鼠胚胎头部第13.5天、15.5天、17.5天,各个时期为相互对照。用免疫荧光的方法标记相关蛋白,观察比较不同时期的Brn3a及Isl-1在三叉神经节的表达情况。结果三个时期中Brn3a及Isl-1在三叉神经节均有共表达,在生长发育早期Isl-1没有明显增殖,在生长发育晚期Brn3a没有明显凋亡。结论在发育后期Brn3a及Isl-1标记的神经元,依旧共表达于神经元中,且随生长发育,标记Brn3a及Isl-1的神经元逐渐减少。Brn3a及Isl-1标记的神经元,在生长发育过程中分化为亚型神经元。

小鼠胚胎心流出道发育中胰岛因子1的表达及意义

目的观察胰岛因子1(Islet-1,ISL-1)在小鼠胚胎心流出道发育中的表达,探讨ISL-1阳性细胞在第二生心区的时空分布特点及其在心流出道发育中的作用。方法 15只胚龄8.5d^12d小鼠胚胎心连续石蜡切片,选用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、抗心肌肌球蛋白重链(myosinheavy chain,MHC)和抗ISL-1抗体,进行免疫组织化学染色。结果胚龄8.5d^10d,ISL-1阳性细胞相继出现在流出道远端、心包腔背侧脏壁和体壁中胚层、原始咽腹外侧间充质及第2对鳃弓核心间充质,并逐渐分化为心肌细胞添加到流出道远端;胚龄11d,咽腹侧ISL-1阳性细胞形成独特的锥形结构,形成主肺动脉隔的雏形;胚龄12d,ISL-1阳性锥形结构与流出道远端心内膜垫融合形成主肺动脉隔,此时ISL-1阳性细胞开始分化为平滑肌细胞,参与心包腔内升主动脉、肺动脉干和主肺动脉隔的发育。结论第二生心区涵盖了原始咽腹外侧间充质、心包腔背侧壁中胚层及鳃弓核心间充质等多个区域,其中的ISL-1阳性细胞具有多向分化潜能,在心发育的不同阶段可以分化为不同类型的细胞,参与流出道的正常发育。

同源框基因蛋白ISL—1抗血清的制备

用ＰＣＲ方法合成了ＩｓＬ－１ｃＤＮＡ的一段５４３ｂｐ的编码序列，将该ｃＤＮＡ克隆于表达载体ｐＱＥ－３２中，含ｐＱＥ－３２／ＩｓＬ－１重组子的Ｍ１５转化菌株经诱导培养后获得了ＩｓＬ－１融合蛋白，用该蛋白免疫家兔，产生抗ＩｓＬ－１抗体，经免疫组化初步检测发现大鼠中枢神经系统内广泛存在ＩｓＬ－１免疫阳性细胞。ＩｓＬ－１在中枢神经系统的作用有待研究。

配对相关的同源异型框1导入棕色脂肪干细胞构建生物起搏

目的:探讨过表达配对相关的同源异型框1(Prrx1)是否能诱导棕色脂肪干细胞(BADSC)向类窦房结细胞分化,构建生物起搏。方法:分离培养大鼠BADSC,分别转染带有GFP的空载腺病毒(Ad-GFP组)和带有Prrx1的腺病毒(Ad-Prrx1组)。光镜下观察细胞形态和荧光表达强度,Western blot、实时聚合酶链反应检测窦房结细胞相关的起搏蛋白(HCN4)和转录因子[TBX18、胰岛素基因增强子结合蛋白1(ISL-1)、Pitx2]的表达水平,膜片钳技术检测起搏电流I_f,免疫荧光技术检测细胞HCN4、TBX18和ISL-1的表达。结果:Ad-Prrx1组的起搏相关因子TBX18、ISL-1、HCN4的mRNA和蛋白表达水平均明显高于Ad-GFP组,而Pitx2的mRNA表达水平明显降低(P均<0.05)。膜片钳记录到BADSC的I_f电流,且该电流能被4 mmol/L CsCl阻断。免疫荧光显微镜下可见Ad-Prrx1组Prrx1与TBX18、ISL-1、HCN4在BADSC中共表达,而Ad-GFP组未发现有上述起搏相关蛋白共表达。结论:过表达Prrx1能诱导BADSC分化为类窦房结细胞。

Sonic Hedgehog信号通路分子及胰岛素增强子结合蛋白在小鼠胚胎心流出道发育的早期表达

目的探讨胰岛素增强子结合蛋白(ISL-1)及音速波状蛋白(Sonic Hedgehog,Shh)信号通路分子在小鼠胚胎心流出道的早期表达特点与其发育的关系。方法取胚龄8-13 d小鼠胚胎心脏40例制作连续石蜡切片,应用抗音速波状蛋白(Shh)、抗Smoothened(Smo)、抗Patched(Ptc1)、抗Patched 2(Ptc2)、抗ISL-1、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行免疫组织化学及免疫荧光化学染色。结果胚龄8-9 d,Shh阳性表达于前肠腹侧内胚层,Ptc1和Ptc2在心管心肌呈较强阳性表达,ISL-1阳性细胞自心包腔背侧壁、前肠两侧间充质延伸至心管动脉端。胚龄10-13 d,前肠内胚层向腹侧延伸形成喉气管沟,并呈Ptc1和Ptc2强阳性表达,ISL-1和Smo双阳性细胞围绕喉气管沟形成对称的锥体形结构,其顶端突入动脉囊腔,形成主肺动脉隔,随发育进行,主肺动脉隔由ISL-1阳性表达逐渐转为α-SMA强阳性表达,并将动脉囊分隔为MHC阴性的心包内升主动脉和肺动脉干。结论 Shh信号通路与ISL-1阳性细胞共同参与小鼠胚胎心流出道的正常形态发生。

异甘草素抗肿瘤活性及初步机制研究

目的探讨异甘草素(isoliquiritigenin,ISL)抗肿瘤活性及初步机制。方法采用SRB法检测ISL对A549、SW620和HMEC-1细胞增殖的抑制作用;Transwell小室检测ISL对HMEC-1细胞迁移能力的影响;明胶酶谱法检测ISL对HMEC-1细胞MMP-2和MMP-9的表达;管样结构形成实验测定ISL对HMEC-1细胞管样结构形成能力;细胞内活性氧(ROS)通过荧光探针DCFH-DA进行测定;流式细胞术检测ISL对HMEC-1的细胞周期。鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验检测ISL体内抗血管生成作用。结果 ISL可明显抑制A549、SW620和HMEC-1细胞的增殖、HMEC-1细胞的迁移、管样结构形成以及细胞内MMP-2和MMP-9的表达,且均呈现浓度依赖关系。同时,ISL还可抑制HMEC-1细胞内由VEGF诱导产生的ROS量,且存在浓度依赖关系。流式细胞术检测发现高浓度ISL可将HMEC-1细胞阻滞于S期,而低浓度ISL通过诱导细胞凋亡来抑制HMEC-1细胞的增殖。ISL能明显抑制鸡胚尿囊膜新生毛细血管的生成。结论ISL具有明显的抗肿瘤活性,能抑制血管生成,其机制可能与清除HMEC-1细胞内ROS生成,诱导细胞凋亡有关。

胰岛因子1在牙胚不同发育时期对上颌牙髓神经投射表达的影响

目的:探讨胰岛因子1(Islet1,Isl-1)在上颌牙牙髓神经生长发育的3个不同时期中投射表达的影响。方法:用Wnt1^(cre/+)雄鼠与Isl1^(f/f)雌鼠配出Wnt1^(cre/+);Isl1^(-/-)基因敲除的小鼠,做基因鉴定(PCR)。取发育不同时期第13.5d、14.5 d、15.5 d小鼠胚胎头部(实验组),同窝非基因敲除小鼠为对照,冰冻切片。用免疫荧光方法标记牙髓神经,比较第13.5 d、14.5 d、15.5 d小鼠上颌牙胚在基因敲除小鼠中与同窝对照小鼠中神经分布情况。结果:PCR结果鉴定为基因敲除小鼠以及同窝对照小鼠;分别在第13.5 d、14.5 d、15.5 d观察基因敲除小鼠与同窝对照小鼠牙髓神经,且各个时期的实验组中神经分布明显减少,对照组中神经分布较多。结论:在牙髓神经的生长发育过程中,Isl-1这一转录因子对牙髓神经的投射表达产生影响,可能是Isl-1调控牙胚周围的转录因子,并影响牙髓神经的投射。

胰岛因子1在胰腺中的转录调控机制

胰岛因子1(ISL1)是重要的转录因子,在胚胎发育期广泛分布于全身多种组织细胞,而在成体组织中主要表达于胰岛和神经组织。在胰腺中,ISL1主要调控胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽等内分泌激素的表达,在胚胎期促进胰腺背侧间充质细胞和胰岛内分泌细胞的分化、发育、成熟,在出生后通过抑制细胞凋亡、促进细胞增殖来维持胰岛β细胞数量的稳态。ISL1通过与基因启动子上的特定元件TAAT/ATTA结合,并与其它蛋白质相互作用,实现对下游靶基因的转录调控,以完成多种生理功能。